从分子组装到功能实现：栗树11S球蛋白的结构表征及其对热凝胶化和生物活性肽释放的影响

《Food Hydrocolloids》：From molecular assembly to functionality: structural characterization of chestnut 11S globulin and its implications for thermal gelation and bioactive peptide release

　　

崔浩鑫|张英|秦东泽|魏凡|于郑婷|吴思浩|季亚洲|傅文辉|张岩|王瑞灿|王硕

天津市南开大学医学院食品科学与健康重点实验室，中国天津市300071

摘要

植物11S球蛋白是主要的种子储存蛋白，但栗子中的11S球蛋白的结构特征研究相对较少。本研究旨在分离高纯度的栗子11S球蛋白组分（Cn11S），并阐明其多尺度结构特征以及其与热行为和消化生物活性的结构-功能关系。Cn11S通过碱性提取-等电沉淀、阴离子交换色谱和大小排阻色谱依次纯化，得到纯度为92.58%的均匀11S组分，其分子量与典型的六聚体结构相符。SDS-PAGE结合质谱分析鉴定出三种主要亚基（Cn11SA、Cn11SB和Cn11SC），每种亚基均含有两个保守的Cupin-1结构域。结构建模显示单体具有典型的Cupin结构，六聚体结构在热力学上稳定。透射电子显微镜（TEM）和原子力显微镜（AFM）观察证实了其紧凑的球形形态，而傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析表明其二级结构以β-折叠为主。ζ电位分析显示等电点约为4.25。差示扫描量热法（DSC）表明Cn11S具有较高的热稳定性，这与它的热诱导凝胶化行为密切相关。实验结果表明，栗子蛋白的最低凝胶化浓度约为4%，且Cn11S更倾向于被纳入凝胶网络。模拟胃肠道消化实验显示其有中等程度的水解（17.88%），释放出具有ACE和DPP-IV抑制活性的肽。总体而言，本研究首次全面阐明了栗子11S球蛋白的结构，将其分子组装与其热凝胶化行为和消化衍生生物活性联系起来，为将栗子蛋白作为植物性食品系统的功能性成分奠定了科学基础。

引言

栗子（Castanea mollissima Bl.）是壳斗科的重要成员，具有悠久的栽培历史，主要产于中国（Li et al., 2022）。过去十年间，全球栗子产量稳步增长，主要是由于消费者对其营养价值的认识不断提高（Massantini et al., 2021）。栗子富含淀粉（干物质基计39.0–71.0%），同时也是蛋白质（6.9–9.7%）和抗氧化剂（Carlsen et al., 2010; Pereira-Lorenzo et al., 2006; Yang et al., 2018; Zhu et al., 2019）的宝贵来源。尽管蛋白质在栗子干物质中所占比例较低，但它含有所有必需氨基酸（EAAs），具有高质量的营养成分。先前的研究表明，中国栗子的EAA/TAA比例约为40%，凸显了其作为生物活性肽的潜在价值（Fu et al., 2024; Yang et al., 2018）。鉴于市场对新型植物蛋白资源的兴趣日益增长，高效提取和纯化栗子蛋白并深入理解其结构特征具有重要意义。

植物种子是全球人类和动物的主要营养来源。种子储存蛋白含量是衡量营养价值的重要指标，不同植物物种之间差异显著（Yang et al., 2023）。在种子成熟过程中，植物会积累大量的储存蛋白。在大多数双子叶植物中，7S和/或11S球蛋白以及清蛋白构成胚或子叶中的主要储存蛋白（Mouzo et al., 2018; Shewry, 1995）。值得注意的是，11S球蛋白在植物种子中的分布更广，且由于其紧凑的六聚体构象和链间二硫键的存在，其结构稳定性优于7S球蛋白（Adachi et al., 2003; Garcia et al., 2005; Gravel & Doyen, 2023）。

了解新型植物蛋白资源的分子结构和组装行为对于阐明其营养和功能特性对于食品应用至关重要。许多研究聚焦于从不同植物中提取和鉴定11S球蛋白的结构特征。阴离子交换色谱（AEC）和大小排阻色谱（SEC）已被证明能有效获得高纯度的11S球蛋白组分（Albillos et al., 2008）。例如，Zhang et al.（2017）使用硫酸铵沉淀法从黑核桃中分离出11S球蛋白，随后通过疏水相互作用色谱（HIC）和SEC进一步纯化；Capraro et al.（2020）则使用盐提取结合离子交换色谱纯化了藜麦11S球蛋白（Chenopodin），并对其均六聚体三维结构进行了建模。

相比之下，关于栗子（Castanea mollissima Bl.）蛋白的研究主要集中在不同品种和提取方法对其技术和功能特性的影响上（Lv et al., 2015; Yang et al., 2018），而其分子组成和结构组织的详细信息仍然匮乏。在我们之前的工作中，通过碱性提取-等电沉淀（AE-IP）方法分离出了栗子蛋白。尽管分离过程中pH值发生变化，但超速离心分析证实蛋白质保持了其有序的四级结构，这从栗子蛋白组分中11S球蛋白六聚体的优势中得到了验证（Cui et al., 2026）。与大豆或藜麦球蛋白等研究较为充分的蛋白质不同，栗子11S球蛋白尚未进行系统的多尺度结构分析。这一知识空白严重限制了我们对它的组装行为和结构-功能关系的理解。填补这一知识缺口对于将栗子蛋白发展为具有竞争力的高价值植物蛋白资源至关重要。

因此，本研究旨在分离、纯化并系统地表征栗子11S球蛋白组分（Cn11S）的多尺度结构和功能潜力。通过AE-IP、AEC和SEC的连续过程获得了高纯度的Cn11S。使用FTIR、TEM和AFM研究了其二级结构和微观形态。首次构建了栗子11S亚基的单体和六聚体结构模型，深入的序列分析揭示了与蛋白质热稳定性、凝胶化行为和消化性相关的保守Cupin结构域。此外，通过质谱鉴定出模拟体外消化释放的肽序列，并通过计算机预测了其生物活性。综上所述，这些发现首次系统性地证明了栗子11S球蛋白作为功能性食品中促进健康生物活性肽的前体的潜力。

节片段

材料

本研究使用的栗子（Zao Feng品种）由中国河北的成德沈利食品有限公司提供。Pierce?双缩氯苯胺（BCA）蛋白测定试剂盒购自Thermo Fisher Scientific（美国伊利诺伊州罗克福德）。Q 6FF色谱柱（1 mL）购自上海的Yeasen Biotechnology有限公司。HiLoad 16/600 Superdex 200预级分离柱购自瑞典的Cytiva AB公司。Amicon Ultra离心滤膜购自Merck公司

Cn11S的纯化和组成分析

在我们之前的工作中，使用AE-IP方法制备的CPI含有约69.7%的11S组分（Cui et al., 2026）。在本研究中，进一步纯化了栗子11S球蛋白（Cn11S），以阐明其结构特征。CPI依次经过AEC和SEC处理，每个阶段的纯度通过SDS-PAGE和超速离心进行评估。

结论

总之，本研究首次全面报道了栗子11S球蛋白（Cn11S）的系统分离和多尺度表征，明确了其分子结构、理化性质、热行为、凝胶化性能和营养功能之间的明确关联。成功获得了高纯度的Cn11S，确认其为典型的六聚体，由三种主要亚基（Cn11SA、Cn11SB和Cn11SC）组成，每种亚基均具有保守的结构特征

CRediT作者贡献声明

王瑞灿：撰写——审阅与编辑、方法学、数据分析、概念构思。王硕：监督、资金获取、概念构思。傅文辉：方法学、数据分析。张岩：监督、数据分析、概念构思。秦东泽：方法学、数据分析。魏凡：方法学、数据分析。崔浩鑫：撰写——审阅与编辑、初稿撰写、方法学、实验研究、数据分析。张英：方法学、数据分析。季亚洲：

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本项工作得到了中国国家自然科学基金（Grant No. U22A20544）的支持。