综述：基于CRISPR的食源性病原体检测的最新进展：机制基础、技术进步以及生物传感技术的整合

《Food Microbiology》：Recent advances in CRISPR–based Detection of Foodborne Pathogens: Mechanistic Foundations, Technological Advances, and Biosensing Integration

　　

杨哲轩|肖思立|陈轩|李永芳|白卫东|刘巧玉

中国佛山大学，518000

摘要

基于CRISPR的生物传感技术已成为一种快速、灵敏且可应用于野外的平台，用于检测食源性疾病病原体，有效解决了传统检测方法固有的局限性。通过将CRISPR/Cas效应子与核酸扩增（NAA）反应和多种信号转导模式相结合，这些生物传感平台在复杂食品基质中特异性检测关键食源性疾病病原体方面展现出巨大潜力。本文系统总结了CRISPR/Cas介导的病原体检测的分子机制、关键技术里程碑以及基于CRISPR的系统与多样化读出策略和先进生物传感格式的整合。此外，还指出了阻碍这些系统广泛应用的主要瓶颈，包括食品基质引起的抑制作用、缺乏标准化检测设备以及有限的多重检测通量。最后，文章展望了未来发展方向，认为人工智能（AI）驱动的序列挖掘和合理的多重检测设计将加速下一代食品安全监测系统的发展，并在信号处理和决策支持工作流程中实现具体应用。

引言

食源性疾病是全球主要的公共卫生挑战，每年导致大量发病率、死亡率和经济损失。根据世界卫生组织（WHO）的数据，每年有超过6亿人因食用受污染的食物而患病，造成约42万人死亡。儿童和免疫系统较弱的人群尤其容易受到威胁。常见的食源性疾病病原体包括沙门氏菌（Salmonella enterica）、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），这些病原体可能在生产、加工和分销过程中污染食品。例如，沙门氏菌经常污染禽蛋及其制品，成为全球食源性疾病暴发的主要病因之一。尽管食品保存和卫生措施有所改进，但微生物污染事件仍在全球范围内发生，给健康和社会经济带来严重负担。

传统的病原体检测方法，包括微生物培养、酶联免疫吸附测定（ELISA）和聚合酶链反应（PCR），仍是食品微生物检测的基石。然而，这些方法存在明显局限性：基于培养的检测方法耗时较长（通常需要24-72小时）且劳动密集；ELISA对微量污染的敏感性不足；PCR虽灵敏度高，但需要热循环仪和专业实验室。在大规模疫情中，这种诊断延迟会显著阻碍及时干预。因此，开发快速、灵敏且经济高效的诊断平台成为食品安全监测和预警系统的紧迫任务。

近年来，原本作为原核生物适应性免疫机制的规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统，已成为基因组编辑和生物传感领域的变革性分子平台。CRISPR向分子诊断领域的转变主要得益于2012年可编程Cas9核酸酶活性的发现。近年来，大规模的基因组和宏基因组研究将CRISPR/Cas系统分类为两大类、七种类型和46个亚型，发现了许多低频变体，丰富了该系统的多样性。这种多样性为下一代生物传感和可编程病原体检测提供了模块化基础。

CRISPR系统利用CRISPR RNA（crRNA）指导效应蛋白进行序列特异性核酸识别，使诊断应用具有单核苷酸级别的特异性。在第二类效应子中，Cas9、Cas12和Cas13等单组分蛋白因结构简单和底物选择性强而受到关注。值得注意的是，Cas12和Cas13分别能够切割单链DNA（ssDNA）和单链RNA（ssRNA），从而实现内在的信号放大。

基于上述机制原理，最新研究致力于将CRISPR/Cas系统转化为适用于食品安全监测的实际生物传感架构。研究人员将CRISPR介导的分子识别与核酸扩增（NAA）方法（如重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP）结合，并与荧光、比色、电化学和侧向流动检测等多种读出方式集成。这些进展弥合了实验室检测与即时检测（POCT）之间的差距。

目前，基于CRISPR的生物传感检测主要集中在单个技术模块或局部应用上，系统性地探讨分子机制的整合、在复杂食品基质中的干扰分析以及检测方法的优化和标准化仍较为匮乏。同时，构建大规模和高通量的食品安全监测系统，以及人工智能技术的全面应用前景，尚未在这一领域得到系统梳理和深入研究。因此，本文提供了关于基于CRISPR的食源性疾病检测技术背景、分子机制和整合策略的系统性综述，不仅总结了现有CRISPR系统的代表性应用，还指出了检测方法优化和标准化的挑战，并展望了实现可扩展、高通量监测的未来发展方向，包括人工智能的潜在作用。

章节片段

基于CRISPR的食源性疾病病原体检测的分子机制基础

规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）系统为新一代核酸诊断提供了无与伦比的精确度和可编程性。该系统源于原核生物的适应性免疫机制，利用RNA引导的核酸酶以单碱基分辨率识别和切割互补的DNA或RNA目标。

CRISPR/Cas系统与核酸扩增技术的整合

基于核酸的检测方法对微生物安全监测至关重要，但在复杂食品基质中检测食源性疾病病原体时，直接使用CRISPR/Cas方法往往无法达到足够的灵敏度。为解决这一难题，研究人员采取了两种深入的研究方向：

CRISPR/Cas系统与信号输出平台的整合

除了与纯核酸扩增技术整合外，CRISPR/Cas系统还与多种信号转导平台（如荧光、比色、光热、电化学、电化学发光（ECL）和石墨烯场效应晶体管（gFET）结合，开发出用于食源性细菌病原体检测的高功能生物传感器。这些方法结合了CRISPR的可编程特异性和先进材料的信号放大能力，实现了快速检测。

样品制备的瓶颈

复杂食品基质会对基于核酸扩增和CRISPR的检测产生特异性抑制作用，这种抑制不仅由脂肪、多糖或蛋白质引起。不同食品类别之间的化学成分、物理结构和内源性微生物群差异导致不同的抑制机制，因此需要针对基质特性的样品制备策略。

与数字技术的整合

将基于CRISPR的诊断技术与数字微电子和人工智能结合，应视为分析性能的功能提升，而不仅仅是现有检测方法的延伸。在食源性疾病检测中，AI辅助方法可应用于三个操作层面：crRNA设计优化、信号采集和处理以及结果解释。

结论

基于CRISPR的诊断平台通过分子精确性、快速性和野外适用性重新定义了食源性疾病病原体的检测方法，具有补充或替代传统方法的巨大潜力。本文总结了这类平台的进展：第二类Cas效应子（Cas9、Cas12、Cas13、Cas14）能够实现快速（30-60分钟）、灵敏（飞摩尔级）的野外检测，适用于复杂食品基质中的沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌和大肠杆菌O157:H7。

作者贡献声明

白卫东：资金支持。陈轩：撰写初稿。李永芳：资金筹集。肖思立：撰写初稿、项目管理、实验研究。杨哲轩：撰写、审稿与编辑、实验研究。刘巧玉：实验研究

Abebe等人，2020；Angela Gilda Carota等人，2024；Chen等人，2025；Chen等人，2024；Chen等人，2021；Dong等人，2024；Fan等人，2021；Jung和Lee，2018；Gootenberg等人，2017；Li等人，2025；Li等人，2025；Li等人，2025；Li等人，2021；Liu等人，2025；Lu等人，2022；Harrington等人，2018；Ma等人，2021；Lu等人，2022；Sri Vigna Hema和Manickavasagan，2024；Xiao等人，2023；Xiang等人，2022；Yang等人，2024；Guo等人，2024；

利益冲突

我们确认所有参与者均已同意参与并同意使用他们的信息。

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本项目得到了佛山大学高层次人才科学研究启动资金（CGZ07379）的财政支持。