三种利莫乳杆菌（Limosilactobacillus fermentum）噬菌体的比较基因组学与化学灭活分析

《Food Microbiology》：Comparative Genomics and Chemical Inactivation Analysis of Three Limosilactobacillus fermentum phages

　　

马文新|王瑞尧|陈应通|张景杰|关浩凡|陈霞

教育部乳品生物技术与工程重点实验室，内蒙古农业大学，呼和浩特，010018，中国

摘要

噬菌体感染通过降低产品质量和导致发酵失败威胁食品发酵行业。本研究对从溶原性菌株中诱导出的Limosilactobacillus (L.) fermentum噬菌体LFP01、LFP02和LFP03的基因组及其对化学消毒剂（乙醇、异丙醇、次氯酸钠和过氧乙酸）的耐受性进行了表征。在所有三种噬菌体宿主菌株的基因组中均检测到了完整的噬菌体区域。此外，这些噬菌体能够感染溶原性宿主菌株。LFP01和LFP03彼此关系密切，而LFP02代表了一个不同的谱系，这突显了L. fermentum噬菌体之间的基因组多样性。这三个噬菌体的核心功能区域是保守的，而其他区域则表现出变异性。噬菌体LFP02对乙醇和异丙醇的耐受性最强。噬菌体LFP03对次氯酸钠的耐受性最弱，这可能与基因组差异和结构复杂性降低有关，从而增加了其受到氧化损伤的敏感性。透射电子显微镜（TEM）和SDS-PAGE分析显示，过氧乙酸灭活后噬菌体结构受到了损伤。这些发现提高了我们对L. fermentum噬菌体抗性机制的理解，并为控制食品发酵中的噬菌体污染提供了一些实用策略。

引言

Limosilactobacillus (L.) fermentum被认为是重要的益生菌物种之一，广泛存在于发酵食品、人体胃肠道以及生殖道中。它具有多种有益特性，包括抗氧化活性、抗炎作用和调节肠道微生物群平衡（Zhou等人，2024年）。这些特性使其成为生产酸奶、泡菜和各种谷物面团等发酵食品中的有价值的益生菌起始菌株（Pakroo等人，2022年）。然而，与其他乳酸菌（LAB）一样，Lactobacillus fermentum容易受到噬菌体感染，这可能导致发酵失败，造成重大经济损失（Ledormand等人，2022年；Ranveer等人，2024年；Wen等人，2024年）。Henick-Kling等人（1986年）证明，感染Oenococcus oeni的噬菌体可以抑制或延缓苹果酸发酵，从而影响葡萄酒的质量。同样，Antoni等人（2010年）在酸牛奶生产中发现了属于Longicaudidae科的噬菌体，这些噬菌体可以感染多达36种Lactobacillus菌株。因此，有效的预防和控制噬菌体污染的策略对于确保工业发酵过程的稳定性和安全性至关重要。

感染L. fermentum的噬菌体越来越被认为是食品发酵系统中的重要生物污染物。大多数已被鉴定出的L. fermentum噬菌体是属于Caudoviricetes类的双链DNA病毒，具有典型的有尾噬菌体基因组结构。然而，关于L. fermentum噬菌体的基因组信息仍然有限，它们的进化关系和遗传多样性尚未系统分析。

根据它们的感染策略，L. fermentum噬菌体可以分为毒力噬菌体和温和噬菌体。毒力噬菌体仅通过裂解周期传播，并迅速破坏宿主细胞，对发酵性能构成直接威胁（Fortier和Sekulovic，2013年）。相比之下，温和噬菌体作为噬菌体整合到宿主基因组中，并可能在环境压力（如紫外线照射、丝裂霉素C或氧化应激条件）下保持潜伏状态（Zhang等人，2022年）。这些生物学差异可能会影响噬菌体的持久性和它们对外部压力因子的响应。为了控制噬菌体污染，工业卫生通常依赖于化学消毒剂，包括浓度为60–80%（v/v）的乙醇和异丙醇、有效氯浓度为50–1000 ppm的次氯酸钠以及浓度为0.1–0.5%的过氧乙酸（Marcó、Suarez等人，2019年；Meyers等人，2021年）。然而，越来越多的证据表明，噬菌体对化学杀菌剂的敏感性存在显著差异，这可能与噬菌体之间的遗传差异有关。Hayes等人（2017b）报告称，噬菌体对季铵化合物的耐受性存在显著差异，这表明噬菌体之间的遗传变异可能导致它们对化学杀菌剂的敏感性不同。同样，Morin等人（2015年）表明，过氧乙酸对乳酸菌dsDNA噬菌体P001的效力存在差异，这表明噬菌体基因型在对其化学处理的敏感性中起重要作用。尽管如此，L. fermentum噬菌体的基因组特征与化学灭活敏感性之间的关系尚未明确。

在以前的研究中，从L. fermentum菌株中诱导出了三种噬菌体（LFP01、LFP02和LFP03），并分别对其基因组特征和生物特性进行了研究（Lv等人，2023年；Wen等人，2024年；Zhang等人，2024年）。然而，这些噬菌体之间的基因组关系及其对化学消毒剂的响应尚未进行比较分析。在本研究中，将这三种噬菌体以及NCBI数据库中可用的另外53种Lactobacillus噬菌体纳入了比较基因组分析。此外，还评估了常见化学杀菌剂（乙醇、异丙醇、次氯酸钠和过氧乙酸）对这三种噬菌体的灭活效果。总体而言，本研究旨在通过结合比较基因组学和对常用化学杀菌剂的敏感性分析，为基于消毒剂的策略提供信息，以防止工业发酵中的噬菌体污染。

章节摘录

噬菌体预测和整合位点分析

使用PHASTER（https://phaster.ca/）和默认参数（Arndt等人，2016年）在L. fermentum IMAU32646（BioSample: SAMN41127702）、IMAU32579（BioSample: SAMN23894542）和IMAU32510（BioSample: SAMN57096763）的完整基因组中识别出了噬菌体区域。根据PHASTER评分标准，预测的区域被分类为完整（得分>90）、可疑（70–90）或不完整（< 70）。对于完整区域，从基因组中提取了基因组坐标和基因注释。

预测噬菌体的基因组定位和整合位点

预测噬菌体区域及其整合位点的基因组分布分别在图S1和表1中展示。L. fermentum IMAU32646中检测到两个完整的噬菌体区域。区域5位于基因组图谱的1.14-1.17 Mb处，两侧有相同的12-bp直接重复序列，并编码了一种噬菌体整合酶，支持典型的溶原性整合。区域7位于1.63 Mb附近，缺乏可检测的att位点和整合酶注释。

结论

在本研究中，所有三种噬菌体宿主菌株的基因组中均检测到了完整的噬菌体区域，并在两种菌株中检测到了典型的att位点和整合酶基因。进一步研究表明，这些噬菌体能够感染溶原性宿主菌株。噬菌体LFP01和LFP03在进化上关系密切，而LFP02的关系较远。在LFP01、LFP02和LFP03的基因组中观察到了复杂的保守性和变异模式。

CRediT作者贡献声明

陈应通：方法学、调查。王瑞尧：撰写 – 初稿、方法学、数据管理。马文新：撰写 – 审阅与编辑、撰写 – 初稿、方法学、调查、数据管理。陈霞：撰写 – 审阅与编辑、监督、项目管理、形式分析。关浩凡：调查、数据管理。张景杰：方法学、调查

Bronson和Levine，1971年；De Antoni等人，2010年。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据将按请求提供。

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的竞争性财务利益或个人关系。

本工作得到了内蒙古自治区杰出青年学者科学基金（资助编号：2025JQ017）、中国自然科学基金（资助编号：32160550）以及内蒙古农业大学的跨学科研究基金（资助编号：BR231410）的支持。