通过转谷氨酰胺酶与脱酰胺蛋白的预交联技术增强基于大豆蛋白分离物的乳液凝胶的性能

《Food Hydrocolloids》：Enhancement of soy protein isolate–based emulsion gels via transglutaminase pre-crosslinking with deamidated proteins

　　

梁贵江|陈文普|邓谦|王兆军|曾茂茂|何志勇|道格拉斯·戈夫|陈秋明|陈杰

江南大学食品科学与技术学院，中国无锡214122

摘要

由于其相对较弱的凝胶形成能力和有限的界面稳定性，大豆蛋白分离物（SPI）在构建高性能乳液凝胶时仍然存在挑战。在本研究中，将脱酰胺的异源蛋白（卵白蛋白、乳清蛋白、酪蛋白和明胶）掺入SPI体系中，并在乳液凝胶形成前进行TG酶介导的预交联，以增强基于SPI的乳液凝胶的凝胶化行为。脱酰胺改变了异源蛋白的反应性和分子构象，从而降低了它们通过TG酶自我交联的倾向，使交联反应主要发生在SPI与SPI之间以及SPI与异源蛋白之间。这种协同效应促进了连续共价交联网络的形成。此外，在后续热处理过程中，还增强了包括二硫键形成在内的共价相互作用，最终使得乳液凝胶具有致密的网络结构，并显著提升了其机械性能。在所有基于SPI-异源蛋白稳定的乳液凝胶中，分别使用脱酰胺卵白蛋白（DEWP）和脱酰胺明胶（DGEL）制备的SPI/DEWP-TG和SPI/DGEL-TG体系表现出最高的机械强度和最均匀的微观结构。通过蛋白质分析、流变测量、质地分析、持水能力和相互作用力分析，阐明了乳液凝胶网络形成的机制。本研究为构建具有增强结构完整性和凝胶性能的乳液凝胶提供了一种有前景的策略，从而支持其在混合蛋白-乳液凝胶基食品系统中的应用。

引言

在各种植物蛋白中，大豆蛋白分离物（SPI）衍生物因其均衡的氨基酸组成、良好的营养价值以及高溶解性和强的乳化能力等优异的功能特性，在多组分食品基质（如乳液凝胶）的设计中受到了广泛关注（Chen等人，2019；Huang等人，2023）。SPI的特性使其适合用于烘焙食品、加工肉类、奶酪和香肠等产品中的食品乳液凝胶（Paglarini等人，2021；Yu等人，2022）。通常，乳液凝胶是复杂的胶体系统，其中油滴分散在由吸附的蛋白质形成的三维凝胶网络中（Dickinson，2012）。基于大豆蛋白的乳液凝胶可用于开发低脂食品、封装和输送精油及脂溶性生物活性化合物，并设计新型食品（Torres等人，2016）。大豆蛋白乳液凝胶的生产涉及多种加工技术，如均质化、热处理、用葡萄糖δ-内酯（GDL）酸化以及用TG酶进行酶促交联（Dickinson，2012；Silva等人，2019；Tang等人，2011）。然而，仅由SPI形成的乳液凝胶通常网络强度弱、易碎且凝聚力差（Luo等人，2019）。完整的SPI具有球状结构，在油水界面处的灵活性和展开能力有限，可能导致分子间相互作用较弱（Chen等人，2019）。此外，SPI亚基疏水性的异质性和SPI分子的电荷分布可能导致在油水界面处吸附不均匀，从而形成无序的交联乳液凝胶，其储能模量（G′）较低，持水能力差（Wu等人，2024）。如果油滴表面的大而缺乏灵活性的SPI分子涂层不足，可能导致油滴在碰撞时聚集并发生宏观相分离，从而导致不连续或不稳定的乳液凝胶结构（Dickinson，2012）。

为了改善基于SPI的乳液凝胶，一些研究人员将乳清蛋白等动物蛋白掺入SPI中以构建具有增强功能性的复合凝胶。将乳清蛋白加热至其变性温度以上，会使β-乳球蛋白和α-乳白蛋白展开，暴露出隐藏的疏水基团和反应性巯基团，并促进不同分子之间的巯基-二硫键交换（Schokker等人，2000）。这可以通过疏水关联和巯基-二硫键交换增强蛋白质-蛋白质相互作用，从而提高凝胶的强度和弹性（Mounsey & O’Kennedy，2007）。SPI作为次要结构成分，如颗粒填料使用，会引入一定程度的异质性，但不会显著影响整体凝胶强度（McCann等人，2018；Xia等人，2022）。例如，Cheng等人（2024）报告称，WPI/SPI混合物凝胶显示出不规则的网络结构，随着SPI比例的增加，G′降低；而Wang等人（2015）在热处理过程中将肌原纤维蛋白与预热处理的SPI结合，增强了疏水相互作用，从而显著提高了凝胶的硬度和个人G′。蛋白质-蛋白质相互作用主要决定了热诱导凝胶化过程中混合蛋白乳液凝胶的机械性能（Nicolai，2019）。影响乳液凝胶性能的关键因素包括围绕每个油滴的界面蛋白质膜的结构完整性和弹性，以及整个蛋白质网络的内聚性和连通性。常用的方法包括添加乳蛋白、热处理、用GDL酸化以及添加二价盐（Tang等人，2013）。尽管有这些策略，但很少有研究探讨通过TG酶介导的交联来开发理想的乳液凝胶，特别是将大豆蛋白与异源蛋白结合。异源蛋白指的是结构和高分子物理化学性质与SPI不同的非大豆蛋白。TG酶是一种交联酶，它可以催化蛋白质分子中的谷氨酰胺残基的γ-羧酰胺基团和赖氨酸的ε-氨基团的交联，从而增强蛋白质内部或之间的交联，改善凝胶结构（Li和Damodaran，2017；Liang等人，2025；Ramírez-Suárez & Xiong，2003）。Cui等人（2020）报道，经过微生物转谷氨酰胺酶交联的SPI-WPI凝胶在超声处理30分钟后表现出更高的凝胶强度和持水能力（WHC），这是由于分子间交联和网络形成的增加。

虽然SPI和异源蛋白都含有这些谷氨酰胺和赖氨酸残基，但在异源蛋白中的无选择性的自我交联可能会破坏蛋白质之间的协同作用，并限制对基于SPI的乳液凝胶基质的改进。为了解决这一限制，首先选择性地对异源蛋白进行脱酰胺，然后使用TG酶与SPI进行交联，以提高结构完整性并改善乳液凝胶的界面性能。蛋白质-谷氨酰胺酶选择性地水解谷氨酰胺残基的酰胺基团，生成谷氨酸，引入负电荷，从而提高蛋白质的溶解性和灵活性（Miwa等人，2013）。这些电场变化和相关的结构松弛间接暴露了隐藏的赖氨酸残基，使其更容易参与后续反应。脱酰胺不仅提高了异源蛋白与SPI的相容性，还增加了它们对酶促交联的敏感性。同时，减少了异源蛋白中可用的谷氨酰胺残基，有助于抑制其自我交联，同时有利于与SPI的交联。在本研究中，选择了卵白蛋白（EWP）、乳清蛋白分离物（WPI）、酪蛋白（CAS）和明胶（GEL）作为异源蛋白，因为它们含有丰富的谷氨酰胺和赖氨酸残基，这些残基可以作为TG酶介导交联的底物。这促进了SPI与异源蛋白之间的有效ε-(γ-谷氨酰)-赖氨酸交联，有助于在油滴周围形成强界面膜和连续的蛋白质网络，最终提高乳液凝胶的强度。

迄今为止，很少有研究通过选择性地脱酰胺预处理异源蛋白来系统地指导TG酶交联，以增强基于SPI的乳液凝胶网络。本研究旨在通过将SPI与脱酰胺的异源蛋白（DEWP、DWPI、DCAS、DGEL）结合，并通过TG酶处理进行定向交联，开发一种新型的基于蛋白质的乳液凝胶系统。评估了蛋白质-谷氨酰胺酶预处理对大豆蛋白基乳液凝胶中TG酶诱导交联方向性的影响。本研究进行了多维分析，包括SDS-PAGE、界面流变学、热凝胶化行为、粒径分布、物理稳定性（通过LUMiSizer）、共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和相互作用力表征，以阐明凝胶形成的基本机制，并了解蛋白质之间的主要相互作用。这些发现为设计具有增强机械强度、稳定性和可调界面性能的混合乳液凝胶提供了坚实的基础，这些凝胶可以应用于多种食品领域，包括低脂配方、稳定的乳液系统和植物基肉替代品。

章节片段

材料

大豆（Taiwan 292）购自中国无锡的当地超市。卵白蛋白（EWP）购自上海源叶生物技术有限公司。乳清蛋白分离物（WPI）购自上海麦克林生化有限公司。胶束酪蛋白（CAS）购自中国上海新华制药试剂有限公司，明胶（GEL，B型，膨胀度220）购自内蒙古包头东宝生物技术有限公司。蛋白质-谷氨酰胺酶

蛋白质复合体的亚基组成

在图1中，应用了非还原（–βME）和还原（+βME）条件下的SDS-PAGE来研究样品的亚基组成和聚合状态。在第1条泳道中，作为对照的纯SPI包含酸性和碱性亚基的谷蛋白醇溶蛋白以及α′、α和β亚基的β-谷蛋白醇溶蛋白，与Liang等人（2025）的先前报告一致。将DEWP、DWPI、DCAS或DGEL掺入SPI（第3、5、7和9条泳道）后，亚基条带轮廓没有明显变化，

结论

本研究提出了一种有效策略，通过结合脱酰胺的异源蛋白和TG酶的作用来增强基于SPI的乳液凝胶的结构和功能性能。单独的SPI没有凝胶形成能力。添加DEWP和DGEL显著提高了乳液凝胶的硬度、弹性和持水能力（WHC）。然而，加入脱酰胺的WPI和酪蛋白并未形成稳定的乳液凝胶。乳液凝胶的网络性能得到了改善

作者贡献声明

梁贵江：撰写——原始草案、可视化、实验研究、数据分析。陈文普：撰写——审阅与编辑。邓谦：实验研究。王兆军：资源支持。曾茂茂：资源支持。何志勇：资源支持。道格拉斯·戈夫：撰写——审阅与编辑。陈秋明：监督、资金获取。陈杰：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（编号：2024YFF1106500）和江南大学食品科学与资源国家重点实验室（编号：SKLF-ZZB-202515）的财政支持。