通过电喷雾离子化-串联质谱法对铜-膦复合物进行表征，以实现大麻素异构体的区分

《Forensic Chemistry》：Characterization of copper-phosphine complexes for the differentiation of cannabinoid isomers using electrospray ionization-tandem mass spectrometry

　　Alleigh N. Couch | Emma K. Hardwick | Christany Liggins | Zoe G. Piazza | Jayleigh M. Lanza | Christopher M. Zall | J. Tyler Davidson
美国德克萨斯州亨茨维尔的萨姆休斯顿州立大学法医科学系

摘要
2018年《农业改进法案》根据0.3%的Δ9-四氢大麻酚（Δ9-THC）阈值区分了非法大麻和合法大麻。因此，法医实验室和监管机构必须采用能够定性和定量检测Δ9-THC的分析方法。由于大麻（Cannabis sativa L.）中含有多种大麻素异构体，这一分析过程变得更加复杂。虽然液相色谱-质谱（LC-MS）可以避免气相色谱-质谱（GC-MS）中存在的大麻素脱羧和转化问题，但在全扫描和产物离子质量谱中，Δ9-THC的异构体几乎无法区分。本研究通过表征11种铜-膦复合物，评估它们区分大麻植物材料中常见大麻素以及可能喷洒在植物材料上的Δ9-THC异构体的能力，这是基于特征前体或产物离子的形成。具体而言，大麻素对[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4的优先结合亲和力，结合铜催化的O2活化产生的氧化产物，有助于形成Δ9-THC的特征离子（m/z 915），而对CBD则不会形成特征离子，从而实现全扫描异构体区分，并消除CBD对Δ9-THC定量的潜在干扰。[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4和[Cu(dppf)(ACN)2]BF4也表现出类似的行为。使用最优化的铜-膦复合物对真实大麻样品的甲醇提取物进行了分析，以评估其在实际样品中的适用性。通过展示铜-膦离子配位的潜力并引入一种消除CBD干扰的新方法，本研究为未来区分非法大麻和合法大麻的研究奠定了基础，可能增强法医实验室中大麻识别的能力。

1. 引言
大麻（Cannabis sativa L.）是全球使用最广泛的植物之一，具有农业、医药和娱乐等多种用途。2018年的《农业改进法案》显著改变了美国的监管格局，该法案规定了0.3%的Δ9-四氢大麻酚（Δ9-THC）法定阈值，以此区分合法大麻和非法大麻[1]。干基重量中含有超过0.3% Δ9-THC的大麻及其衍生产品被归类为大麻，属于第一类管制物质[2]，而大麻的干基重量Δ9-THC含量不得超过0.3%[1]。由于大麻的合法地位取决于Δ9-THC含量的准确测定，法医实验室和监管机构必须采用能够可靠识别和定量Δ9-THC的分析方法[3]。化学成分复杂的大麻基质进一步增加了分析难度，其中包含多种大麻素、萜烯和黄酮[4][5][6]。异构大麻素给大麻素鉴定带来了巨大挑战，因为Δ9-THC异构体具有相同的分子结构（C21H30O2），仅在结构上略有差异，通常体现在烯烃的位置上。图1展示了Δ9-THC的结构及其基于二苯并吡喃编号系统的潜在烯烃位置。其他Δ9-THC异构体（如大麻二酚CBD和大麻色酮CBC）由于含有额外的末端或次级烯烃而在结构上有更大差异，但仍然表现出相似的分析行为，这给准确的大麻素鉴定和定量带来了挑战。此外，大麻的合法化促进了Δ9-THC异构体（如Δ8-四氢大麻酚Δ8-THC）的兴起[7][8]，这些异构体具有类似的药理效应[9]，同时规避了与Δ9-THC相关的法律限制。

图1. 基于二苯并吡喃编号系统的Δ9-THC大麻素结构及潜在双键位置

涉嫌大麻的样品占查获的药物证据中的很大比例[10]，这给本已负担繁重案件积压的法医实验室带来了巨大的分析压力[11]。传统上，气相色谱-电子电离-质谱（GC-EI-MS）一直是疑似大麻分析的金标准，因为该技术能够有效区分Δ9-THC异构体[12][13]。然而，GC进样口所需的高温会导致酸性大麻素的脱羧和潜在的大麻素转化[14][15]。幸运的是，2019年美国农业部明确指出，大麻和非法大麻的区分基于总THC含量，即Δ9-THC加上酸性前体四氢大麻酚酸（THCA）的总和（总THC = (0.877×THCA) + Δ9-THC），其中0.877因子考虑了分子量差异[16]。尽管已经采用了强制脱羧、化学衍生化和分析物保护等技术来解决大麻素脱羧问题[12][13][18][17]，但CBD转化为Δ9-THC的报道令人担忧，因为这可能导致Δ9-THC含量被高估[15][19]，从而产生重大法律后果。因此，实验室越来越多地探索液相色谱-光电二极管阵列（LC-PDA）[20][21]和液相色谱-电喷雾电离-质谱（LC-ESI-MS）[22][23]等替代方法，以克服GC-EI-MS的局限性。然而，大麻素异构体在色谱行为、吸收光谱和全扫描质量谱中的质子化分子（即[M + H]+）方面非常相似。即使在碰撞诱导解离（CID）激活条件下，Δ9-THC异构体的产物离子谱也几乎无法区分。大麻素异构体分辨率的有限性促使人们探索能够提高查获药物案件中大麻素鉴定的其他技术，这对于区分非法大麻和合法大麻至关重要。

金属离子配位成为在软电离条件下改善Δ9-THC异构体区分的一种有前景的技术。过渡金属（如银Ag或铜Cu）被用于诱导形成大麻素-金属加合物[24][25][26][28]或金属-大麻素复合物[29][30]，这些复合物生成的质谱更具区分性，从而提高了Δ9-THC异构体的区分能力。Ag+和Cu+离子可逆地与碳-碳π键结合；烯烃的数量和位置（例如末端或内部）直接影响过渡金属的结合亲和力和配位行为[31][32]。因此，大麻素异构体之间的结构差异决定了金属-大麻素的相互作用，进而影响最终的质量谱。例如，Huang等人[24][25][26]和Ieritano等人[28]的研究表明，引入Ag+离子有助于形成阳离子型Ag-大麻素加合物（即[Ag + 大麻素]+），可以通过CID激活和串联质谱（MS/MS）进行分析区分。Δ9-THC含有一个内部烯烃，而CBD含有一个内部烯烃和一个末端烯烃，使得CBD与Ag+的结合更强。因此，强结合的[Ag + CBD]+加合物在碎裂过程中保留了Ag并失去了一部分CBD分子，形成特征产物离子；而结合较弱的[Ag + Δ9-THC]+加合物在碎裂过程中失去了AgH，形成特征产物离子，从而实现异构体区分。然而，简单的Ag盐具有光敏感性，稳定性和选择性较差，溶解度也有限。为了解决这些问题，作者后续的研究探索了两种替代的金属离子配位方法进行大麻素区分。第一种方法使用辅助膦配体形成Ag-膦复合物，膦配体的配位增强了金属离子的稳定性和溶解性[33]。膦配体的空间和电子性质的差异使得可以微调金属中心周围的的大麻素结合位点，从而实现Δ9-THC和CBD的区分[33]。另一项研究通过开发一种直接的质谱方法，使用更保守的1%判别点测定法，扩展了Ag-膦离子配位的适用性[34]。第二种方法采用Cu作为替代过渡金属，因为Cu+离子与烯烃的结合比Ag+更强，且不易受光化学和溶解性问题影响。与主要生成简单Ag-大麻素加合物的Ag盐不同，在乙腈（ACN）溶液中引入[Cu(ACN)4]BF4可实现更多样的配位相互作用，从而在全扫描中区分Δ9-THC、Δ8-THC、CBD、THCA-A和大麻二酚酸（CBDA）[29]。特征前体离子的形成消除了对MS/MS仪器的依赖性，提高了其在法医实验室中的可行性，因为许多实验室仅配备MS1仪器。

全扫描质量谱中观察到的特征Cu-大麻素复合物是由于Cu+离子能与目标大麻素反应，而不仅仅是与其烯烃基团结合。几种特征离子是通过Cu+介导的O2活化产生的，从而选择性地氧化大麻素；而双铜-大麻素复合物是通过OH基团与路易斯酸性Cu+离子反应去质子化形成的[29]。这种反应性很复杂，且高度依赖于溶剂、Cu前体和仪器条件。当使用甲醇（MeOH）作为溶剂而非ACN时，氧化反应产生的大麻素分子离子在ESI-MS/MS条件下呈现类似EI的MS/MS碎裂模式[35]。相比之下，Sboto等人使用CuCl作为Cu+前体，观察到含有Cu2+的离子，如[Cu + Δ9-THC-H]+ [30]。然而，Δ9-THC和CBD形成的离子类似，需要通过MS/MS分析进行异构体区分[30]。

尽管上述研究表明Cu在异构体区分方面的潜力，但Cu+盐像Ag+盐一样，在水或甲醇溶液中仍然相对不稳定，这取决于具体条件；ACN中的氮原子作为软配体稳定了Cu+中心，而MeOH或H2O中的氧原子对Cu+的稳定性较差，更倾向于形成Cu2+离子。与之前的Ag-膦研究一致，引入膦配体可以提高稳定性 và 选择性，通过膦的 spatial 和电子性质指导Cu-大麻素的相互作用。本研究通过表征11种铜-膦复合物，评估它们区分常见大麻素（包括Δ9-THC异构体）的能力，这是基于特征前体或产物离子的形成。选择这11种铜-膦复合物是基于它们的化学特性，包括空间体积、螯合亲和角和刚性等结构特征。所有复合物均使用高分辨率质谱（HRMS）进行表征，以辅助结构解析。每种复合物都在十八种大麻素和两种氘代大麻素存在下独立评估。结果通过逐步排除法确定最佳的大麻素区分铜-膦复合物。此外，还在甲醇和乙腈溶液中分析了铜-膦大麻素复合物，以评估溶剂效应。此外，使用优化的铜-膦复合物分析真实大麻植物材料提取物，证明了该方法的可行性和在实际样品中的应用潜力。本研究基于不同质量谱的形成，评估了铜-膦复合物在大麻素异构体区分方面的效果，可能提高法医实验室识别大麻素异构体的能力，为未来区分非法大麻和合法大麻的研究奠定基础。

2. 材料与方法
2.1. 化学品和材料
从Cayman Chemical（美国密歇根州安娜堡）购买了以下十七种大麻素和两种同位素标记大麻素的认证参考物质（CRMs）：Δ9-THC、CBD、Δ8-THC、exo-四氢大麻酚（exo-THC）、Δ10-THC、Δ6a,10a-四氢大麻醇（Δ6a,10a-THC）、大麻环醇（CBL）、大麻环三酚（CBT）、大麻色酮（CBC）、大麻内酯（CBG）、大麻酚（CBN）、四氢大麻酚酸-A（THCA-A）、CBDA、大麻内酯酸（CBNA）、大麻内酯酸（CBGA）、四氢大麻维林（THCV）、大麻二维林酸（CBDVA）、Δ9-四氢大麻酚-d9（Δ9-THC-d9）和Δ9-四氢大麻酚-d3（Δ9-THC-d3）。Δ9-四氢大麻酚-B（THCA-B）和Δ9-THC从Cerilliant（美国德克萨斯州朗德罗克）购买；[Cu(ACN)4]BF4和1,1′-二苯基磷脲双(二苯基膦)（dppf）从TCI America（美国俄勒冈州波特兰）购买；三苯基膦（PPh3）从Oakwood Chemical（美国南卡罗来纳州埃斯蒂尔）购买；(R)-(+)-2,2′-二苯基膦-1,1′-联萘（(R)-BINAP）、(S)-(?)-2,2′-二苯基膦-1,1′-联萘（(S)-BINAP）、4,6-二苯基膦二苯并呋喃（DBFphos）和2,2’-二苯基膦二苯醚（DPEphos）从Ambeed（美国伊利诺伊州布法罗格罗夫）购买；1,3,5-三氮杂-7-磷杂 adamantane（PTA）从Thermo Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）购买；(2,4,6-三甲基苯)膦或间苯基膦（P(mes)3从Sigma Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）购买；4,5-二苯基膦-9,9-二甲基蒽（Xantphos）和三(2,4,6-三甲基苯)膦（TTMPP）从Strem（美国新贝里波特）购买。本研究使用的溶剂包括从Fisher Scientific（美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）购买的甲醇（MeOH）、从Supelco（美国宾夕法尼亚州贝尔丰特）购买的ACS级乙腈（ACN）和从MilliporeSigma（美国马萨诸塞州伯灵顿）购买的ACS级稳定乙醚。乙腈和乙醚在氩气下脱气，并在Pure Process Technology（美国纳舒阿）的Glass Contour GC-SPS-7溶剂纯化系统上干燥。其他所有试剂均按原样使用。所有合成均在Vigor SciLab手套箱中进行，使用氩气或氮气作为惰性气体。铜-膦复合物的合成
这些铜-膦复合物是使用为 [Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4 [36], [37] 制定的合成方法制备的。在典型的合成过程中，将25.0毫克的 [Cu(ACN)4]BF4（79.5微摩尔，1当量）和1当量的二膦配体或2当量的单膦配体溶解在5.0毫升的乙腈中，室温下搅拌5分钟后，然后在真空条件下干燥，得到白色粉末；或者与乙醚混合后得到形成良好的晶体。通过核磁共振（NMR）判断，复合物的形成在几分钟内完成，且以近似定量的纯固体形式分离出来，或以中等产量（通常为50%）得到结晶材料。粗产品和结晶材料在多次独立制备的批次中显示出相同的电喷雾离子化质谱（ESI-MS）和NMR数据。对于PTA和TTMPP衍生物，无法获得适合X射线衍射的结晶材料。TTMPP体系在乙腈中的溶解度有限，因此被排除在后续的分析研究中。所有其他复合物均通过1H NMR和31P NMR光谱进行表征，L = PPh3、P(o-tolyl)3、P(mes)3、dppf、R-BINAP、Xantphos和DPEphos的复合物还进行了X射线晶体学分析。结构和光谱细节超出了本分析研究的范围，将在后续发表。

2.3 样品制备
所有大麻素样品均在含有铜-膦复合物的ACN和MeOH溶液中进行分析。对于在ACN中制备的样品，最初储存在MeOH中的大麻素标准品（CRMs）使用Biotage TurboVap LVV（美国北卡罗来纳州夏洛特市）在20°C和15 psi条件下进行干燥，然后重新溶解在ACN中，方法与我们的先前工作[29]类似。同样，铜-膦复合物晶体也溶解在ACN中以制备相应的溶液。对于基于MeOH的分析，最初储存在ACN中的大麻素CRMs重新溶解在MeOH中，铜-膦复合物晶体也溶解在MeOH中。无论溶剂组成如何，用于表征铜-膦大麻素复合物的所有样品的大麻素浓度均为50 ppm（即50毫克/升），铜-膦复合物浓度为15微摩尔。选择50 ppm的浓度进行表征，是因为本研究使用的提取方案中该浓度对应于最近用于大麻和马铃薯醇区分的半定量1%决策点检测方法的1%阈值，而不是传统的0.3%阈值[1] [19]。此外，由于本研究的主要目的是表征，因此没有进行详细的性能评估；因此，没有检查不同的多巴胺浓度。

对于真实的大麻植物材料样品，采用了甲醇提取法。提取过程结合了两种先前建立的大麻提取方法[19] [21]：将50毫克±0.5毫克的植物材料加入15毫升的离心管中，涡旋10秒，置于管式振荡器上以25转/分钟的速度振荡10分钟，再次涡旋10秒。上清液用棉塞巴斯德吸管过滤后倾倒。向含有大麻植物材料的离心管中再加入5毫升MeOH，并重复上述提取步骤，总提取体积为10毫升。为了证明所开发方法在真实样品中的可行性，分析了一个真实的大麻提取物，该提取物既未经强化也未添加CBN、?9-THC、THCA-A和CBDA（各添加50 ppm），并在三种最佳的铜-膦复合物 [Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4、[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4 和 [Cu(dppf)(ACN)2]BF4 的存在下进行测试。由于基质的复杂性，使用了ACN进行2倍稀释，并将铜-膦复合物的浓度提高到以下最佳水平：[Cu(dppf)(ACN)2]BF4 为32微摩尔，[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4 为66微摩尔，[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4 为133微摩尔。

2.4 仪器
本研究中所有样品的分析均使用Agilent Technologies 6530四极杆飞行时间（Q-TOF）质谱仪，该质谱仪连接了双Agilent Jet Stream（AJS）电喷雾离子化源。样品通过注射泵以18微升/分钟的流速直接注入离子化源，注射器和PEEK管在每次样品分析之间用MeOH或ACN彻底冲洗，以避免大麻素或铜-膦复合物的携带和污染。采用的仪器参数如下：雾化器压力为40 psi，鞘气温度为350°C、流量为8升/分钟，干燥气体温度为300°C、流量为8升/分钟，毛细管电压为3500伏特，喷嘴电压为1500伏特[33]。所有铜-膦复合物（无论是否含有大麻素）均在正离子模式下进行表征，扫描范围为m/z 40–2000。对于所有感兴趣的前体离子，使用15、25、35和45电子伏特的CID能量进行MS/MS分析，每个激活能量大约持续30秒。对于稳定性较高的前体离子，使用了55、65和75电子伏特的更高激活能量。目标MS/MS分析的采集时间为200毫秒/谱，并设置4 Da的隔离宽度，以包含代表天然存在的63Cu和65Cu同位素的单同位素质量峰和M+2同位素。为了便于光谱解释，所有特征离子和产物离子均以其单同位素质量报告。

2.5 数据分析
使用MassHunter Qualitative Analysis版本B.10.00进行质谱数据分析。数据随后导出为CSV文件，导入Microsoft Excel版本16.0中，并归一化到基峰以便可视化。通过表征和比较前体离子和产物离子光谱来识别特征离子，从而区分大麻素异构体。为了提高对特征离子化学组成的信心，将准确的质量测量结果与相应的理论精确质量进行比较，质量误差容忍度为5毫道（mDa）。

3 结果与讨论
3.1 合成的铜-膦复合物概述
作者之前的铜离子络合研究表明，Cu+离子可以选择性地结合?9-THC异构体，并在某些情况下通过Cu介导的O2活化促进选择性氧化产物的形成[28]。因此，主要的大麻素异构体，如?9-THC、CBD、?8-THC、THCA-A和CBDA，可以根据特征前体离子的形成在完整扫描质谱中区分，而无需依赖它们的MS/MS裂解模式。不幸的是，包括Cu和Ag在内的过渡金属提供的立体体积和选择性有限。这一点在分析大麻植物材料时尤为令人关注，因为大麻植物材料中含有许多目标大麻素以外的化合物，从而降低了结合效率并使质谱解释变得复杂。之前的工作通过加入辅助膦配体来稳定Ag+离子并调节其对大麻素的选择性，以克服这些限制[33] [34]。与Ag相比，Cu(I)（Cu+）离子对光化学降解的敏感性较低，在卤离子存在下也不太可能沉淀；然而，在没有稳定配体的情况下，它们在溶液中热不稳定。虽然ACN可以作为Cu+离子的稳定配体，但膦配体的强电子供体能力和高度可调的结构可以进一步提高Cu离子对?9-THC异构体络合过程的选择性。选择膦配体是因为它们的商业可用性，特别是对于本研究中使用的那些，其苯基取代基增强了空气稳定性。

图2展示了本研究中探讨的各类膦配体：单齿膦（即单膦），它们通过一个磷供体原子进行配位；以及双齿膦（即二膦），它们由两个磷原子在单一配体框架中连接而成。如图2所示，单膦的立体体积通常由锥角（θ）表征，而二膦的立体体积则由螯合咬合角（β）表征，后者主要取决于连接磷供体原子的螯合连接器。单齿膦，尤其是那些含有大体积取代基的膦，容易从Cu+离子上解离，而双齿膦由于螯合作用而牢固地结合在Cu+中心。

Cu+离子通常表现出二、三和四个配位位点。当两个配位位点被膦配体占据时，其余的配位位点被溶剂配体（如ACN或MeOH）占据。支持的膦配体与Cu+中心紧密结合，而结合较弱的ACN或MeOH溶剂配体可能被大麻素取代，从而形成铜-膦大麻素复合物。配体整体大小、立体体积、螯合咬合角、电子供体能力和电子密度的变化调节了大麻素限制或允许接触Cu+中心的能力，影响弱结合的ACN或MeOH配体是否会被大麻素取代。因此，本研究中选择的膦配体具有多样化的结构和电子特性，并被评估为能够促进特定异构体铜-膦大麻素复合物形成的配体。

图3提供了合成的十一种铜-膦复合物的理论结构：[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4、[Cu(P(mes)3)2(ACN)2]BF4、[Cu(PTA)2(ACN)2]BF4、[Cu(P(o-tolyl)3)2(ACN)2]BF4、[Cu((S)-BINAP)(ACN)2]BF4、[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4、[Cu(dppf)(ACN)2]BF4、[Cu(Xantphos)(ACN)2]BF4、[Cu(DPEphos)(ACN)2]BF4、[Cu(DBFphos)(ACN)2]BF4 和 [Cu(TTMPP)(ACN)2]BF4。本研究中使用的各种膦配体的锥角和自然咬合角列在表S1[38]、[39]、[40]、[41]中。单膦的体积从小（如PTA）到中等（如PPh3），再到大（如P(o-tolyl)3、TTMPP和P(mes)3不等；二膦的咬合角从相对狭窄（如(R)-BINAP和(S)-BINAP）到中等（如dppf、DPEphos和Xantphos），再到宽（如DBFphos），反映了Cu+与大麻素配位的可能性。此外，最初评估了具有较小和更灵活螯合连接器的配体，但这些配体容易重新排列形成多核铜簇或双膦；因此，评估了具有刚性大螯合骨架的膦配体，以提供单核体系，其中包含一个铜离子和一个二膦。此外，大体积芳基取代基的立体拥挤也限制了可接近性，这进一步促进了选择性烯烃配位，这对?9-THC异构体的区分很重要。包含手性膦配体(R)-BINAP和(S)-BINAP是为了评估金属中心的手性是否会影响结构相似的大麻素的配位偏好。所选的膦配体结构的多样性使得能够系统地评估Cu-膦离子对?9-THC异构体的络合，并评估其选择性和相对于Cu盐的稳定性。

3.2 铜-膦复合物性能的评估
进行了全扫描和MS/MS分析，以评估铜-膦复合物对常见大麻素、?9-THC异构体及其氘代类似物的区分能力，确保方法的全面适用性。尽管THCA-B在自然界中并不常见，但其可检测或高含量的存在可能提供关于真实大麻样品的年龄、加工或储存条件的信息[42]；因此，本研究中也包括了THCA-B结构异构体。每种铜-膦复合物都在有无大麻素CRMs的情况下进行了表征，大麻素浓度为50 ppm（即50毫克/升），铜-膦复合物浓度为15微摩尔。样品分别在ACN和MeOH中制备并分析，以评估溶剂对质谱结果的影响。首先独立分析铜-膦复合物，以识别来自铜-膦复合物本身的离子，从而有助于区分和鉴定特征性的铜-膦大麻素复合物。图S1和S2分别提供了在ACN和MeOH中的所有铜-膦复合物的全扫描质谱，以及关于这些复合物的身份和配体交换平衡的相关结构和光谱表征。随后使用MS/MS分析进行结构阐明和所有感兴趣离子的表征。实施了5×10^3的丰度阈值，以防止背景离子的干扰并确保足够的信噪比。溶液中铜-膦复合物之间的动态平衡产生了少量的大麻素铜-膦物种，但只考虑了最丰富且具有分析信息量的复合物。为了确定最佳铜-膦复合物和溶剂条件以区分大麻素，进行了逐步评估。系统评估使用了以下标准：在MeOH或ACN中的溶解性、至少形成一种?9-THC铜-膦复合物的能力、溶剂对复合物形成和背景噪声的影响、区分?9-THC异构体的能力、光谱复杂性以及特征离子的相对丰度。图4概述了所实施的逐步程序以及在不同标准下特定Cu-膦配合物或溶剂被淘汰的情况；每个步骤的详细讨论见第3.2.1-3.2.6节。下载：下载高分辨率图像（182KB）下载：下载全尺寸图像

图4. 对Cu-膦配合物和溶剂条件进行系统评估以优化方法的概述。为简便起见，图4中的膦配体标记为-phosphine；但实际上，相应的单齿和双齿膦配合物分别是[Cu(单齿)2(ACN)2]BF4和[Cu(双齿)(ACN)2]BF4。

3.2.1. 溶解度
十种合成的Cu-膦配合物在ACN和MeOH中均可溶解。[Cu(TTMPP)(ACN)2]BF4在这两种溶剂中的溶解度不足。这种配合物的溶解度受限可能是由于TTMPP配体的较大体积和非极性芳香环结构（见图3）。TTMPP配体在Cu+中心周围的巨大空间位阻限制了溶剂的渗透，降低了ACN和MeOH有效溶剂化Cu-TTMPP配合物的能力。尽管甲基取代基引入了局部极性区域，但整体配体环境仍以非极性芳香环为主，进一步阻碍了溶剂与配体的相互作用。因此无法进行质谱分析，TTMPP被排除作为潜在的膦配体。

3.2.2. ?9-THC Cu-膦配合物的形成
下一个评价标准是基于Cu-膦配合物与?9-THC配位并形成全扫描质谱中可观察到的特征离子的能力。[Cu(P(mes)3)2(ACN)2]BF4和[Cu(P(o-tolyl)3)2(ACN)2]BF4未能形成特征离子；因此被认为不合适而被排除。这些配体无法形成?9-THC配合物可能是由于其芳基取代基的巨大空间体积，这可以通过较大的锥角测量得知（见表S1），使得这些配合物不适合本研究。

3.2.3. 溶剂选择
分别在ACN和MeOH中制备样品，以确定哪种溶剂能生成最佳的Cu-膦大麻素配合物。在我们之前使用Cu盐进行大麻素分离的研究中，溶剂的选择对结果有显著影响，Cu-大麻素配合物主要在ACN中生成，而大麻素分子离子则在MeOH中形成[29][30]。图5显示了当引入?9-THC CRM与[Cu(dppf)(ACN)2]BF4时，溶剂对Cu-膦大麻素配合物形成的影响。在ACN中，特征性的?9-THC配合物分别出现在m/z 945.2321（C55H56O3FeP2Cu+，误差-3.0 mDa）和m/z 1067.2505（C59H67O3FeP2Cu2+，误差-0.1 mDa），对应的离子组成为[Cu+ dppf+?9-THC+ O-2H]+和[2Cu+ dppf+?9-THC+ O+ C4H9]。在MeOH中，也观察到了相同的特征性?9-THC配合物，同时还出现了m/z 975.2464（C56H58O4FeP2Cu+，误差+0.9 mDa）和m/z 1547.2806（C89H85O2Fe2P4Cu+，误差+1.6 mDa）的特征性离子，对应的离子组成为[Cu+ dppf+?9-THC+ CO2]+和[2Cu+ 2dppf+?9-THC-H]+。m/z 1067处的离子组成是基于精确的质量测量和Cu-膦配体结合原理提出的；然而，这一组成存在不确定性，将在第3.3节中详细讨论。在MeOH中观察到更多的?9-THC配合物表明，与ACN相比，?9-THC的分析信号分布在更多种Cu-膦大麻素物种上。所生成的特征离子并没有提高异构体的选择性，因为这些离子也存在于其他?9-THC异构体的MeOH光谱中（见表S2和S3）。额外形成的非选择性配合物使得质谱更加复杂，并降低了特征离子的丰度。例如，m/z 945.2321在ACN中的相对丰度为43.8%，而在MeOH中仅为8.5%（见图5A和图5B）。

图5. 示例性的全扫描质谱，显示了[A] ACN和[B] MeOH中[Cu(dppf)(ACN)2]BF4与?9-THC形成的配合物，突出显示了溶剂对配合物形成的影响。ACN中的特征性?9-THC配合物用红色圈出，MeOH中用蓝色圈出。（关于图例中颜色的解释，请参阅本文的网络版本。）

此外，使用ACN可以获得更清洁的质谱背景。ESI需要溶液中形成离子；因此，作为极性质子溶剂的MeOH可以提供促进质子化分子形成的不稳定质子。然而，在本研究中，由于感兴趣的离子是阳离子（因为Cu+中心的存在），质子化是不希望发生的。过度质子化会使质谱变得复杂，尤其是在分析真实大麻样品时，复杂的基质会增强背景离子信号。相比之下，ACN是一种极性非质子溶剂，可以最小化质子化，促进配合物的形成，并产生背景较低的清洁质谱。此外，尽管没有进行定量评估，但从定性观察来看，Cu-膦配合物在空气中更稳定，溶解在ACN中时对强氧化剂具有抵抗力，这一点通过UV-Vis、1H NMR和31P NMR得到了验证；而在MeOH中或以干燥固体形式存在时，它们会迅速氧化为Cu2+，表现为蓝色和NMR信号的宽化，这与顺磁Cu2+和膦氧化物的形成一致。基于最小化的光谱背景、分析信号的分裂减少以及Cu+的稳定性提高，选定了ACN作为最佳溶剂。表S2-15总结了在ACN和MeOH中观察到的所有感兴趣的特征Cu-膦大麻素配合物的离子。需要注意的是，表中未列出的次要Cu-膦大麻素配合物可能存在；然而，它们不是我们关注的特征离子。此外，对于那些不能与大麻素结合或组成难以确定的Cu-膦配合物，没有专门创建表格。本文的其余部分仅关注在ACN中制备的样品的数据。

3.2.4. ?9-THC异构体的区分
下一个评估标准是每种Cu-膦配合物区分?9-THC异构体的有效性。[Cu(DBFphos)(ACN)2]BF4在标称m/z 975（C57H54O4P2Cu+；误差-4.6至-2.9 mDa）产生了?9-THC、CBD和?8-THC的特征离子，以及在标称m/z 927（C57H55O3P2Cu2+；误差-3.7 mDa至-3.2 mDa）产生了?9-THC和?8-THC的特征离子。这些特征离子的产生表明[Cu(DBFphos)(ACN)2]BF4缺乏区分大麻素所需的选择性。DBFphos的螯合角度比其他双齿膦配体DPEphos、Xantphos、BINAP和dppf更大（见表S1）。即使经过MS/MS分析，生成的产物离子也无法区分大麻素。这种无选择性的结合限制了区分?9-THC与其异构体的能力；因此，[Cu(DBFphos)(ACN)2]BF4被排除作为潜在的配体。

[Cu(PTA)2(ACN)2]BF4也能与?9-THC、CBD和?8-THC形成配合物。尽管观察到了离子丰度和比例的微小差异，但没有生成能够明确区分?9-THC与其异构体的特征离子。此外，所有使用[Cu(PTA)2(ACN)2]BF4收集的光谱都非常复杂，观察到的配合物组成大多无法解析，使得所需离子的鉴定变得困难（见图S3）。这种光谱复杂性可能是由于PTA是一种非常小、单齿的配体，具有有限的空间体积。其小尺寸和缺乏螯合作用使得PTA在溶液中可以发生多次结合和解离平衡，形成大量的PTA配合物，从而干扰了光谱解析和分析的可靠性。综上所述，[Cu(PTA)2(ACN)2]BF4被排除作为潜在的Cu-膦配体。

因此，[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4被认为是最佳的单齿配体，而其余五种具有适当空间区分性和可访问性的双齿配体（可能由于它们的庞大苯基团和适中的到较大的P-Cu-P角度）被进一步评估。对于这些Cu-膦配合物，包括[Cu(dppf)(ACN)2]BF4、[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4、[Cu((S)-BINAP)(ACN)2]BF4、[Cu(Xantphos)(ACN)2]BF4和[Cu(DPEphos)(ACN)2]BF4，在存在?9-THC、?8-THC和CBD的情况下，它们的质谱中观察到了一致的模式（见表S2、S4、S6、S8、S10和S12）。?9-THC生成了两个特征离子，?8-THC仅生成了一个特征离子，而CBD没有生成可观察到的离子，使得能够完全区分主要的大麻素。CBD没有特征离子的存在减少了光谱重叠，并消除了对特征?9-THC离子的干扰。这一特性对于未来旨在定量或半定量?9-THC以识别大麻的研究可能特别有益。

3.2.5. 特征离子的丰度
Cu-膦配体优化的下一个标准是基于剩余双齿配体的特征离子丰度。表1提供了在相应Cu-膦配体存在下?9-THC主要和次要特征离子的绝对和相对丰度。分析显示，使用[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4和[Cu(dppf)(ACN)2]BF4产生的?9-THC主要和次要特征离子的丰度高于[Cu((S)-BINAP)(ACN)2]BF4、[Cu(Xantphos)(ACN)2]BF4和[Cu(DPEphos)(ACN)2]BF4，后者的相对丰度几乎是前者的两倍。特征离子的丰度差异可能是由于双齿配体之间的结构差异造成的。

表1. 各种双齿Cu-膦配体的?9-THC主要和次要特征离子的绝对和相对丰度概览。
| 配体 | m/z | 绝对丰度 | 相对丰度 (%) |
|----------------------|--------------|-----------------|-------------------|
| [Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4 | 101 | 32.88 | 77.7 |
| [Cu(dppf)(ACN)2]BF4 | 101 | 135 | 11.0 |
| [Cu((S)-BINAP)(ACN)2]BF4 | 101 | 136 | 58.0 |
| [Cu(DPEphos)(ACN)2]BF4 | 94 | 52.6 | 55.8 |
| [Cu(Xantphos)(ACN)2]BF4 | 96 | 91.3 | 85.5 |
| [Cu(DPPf)(ACN)2]BF4 | 92 | 91.5 | 73.3 |

有趣的是，BINAP配体的R-和S-对映体产生了类似的特征离子，但在?9-THC存在下产生的丰度显著不同。由于大麻素是手性的，它们与手性的Cu-BINAP配体的相互作用不同。R-BINAP配体的取向似乎有利于结合和稳定，而S-BINAP配体产生的?9-THC特征离子丰度较低。因此，[Cu((S)-BINAP)(ACN)2]BF4被排除作为潜在的Cu-膦配体。其余的丰度差异主要由螯合角度决定的配体结合位点的大小引起（见表S1）。(R)-BINAP和dppf具有适中的自然螯合角度，而Xantphos和DPEphos的螯合角度较大，导致结合位点更难接近，从而解释了它们特征离子丰度较低的原因。随后，[Cu(Xantphos)(ACN)2]BF4和[Cu(DPEphos)(ACN)2]BF4被排除作为潜在的Cu-膦配体，而[Cu(dppf)(ACN)2]BF4和[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4被确定为最佳的?9-THC异构体区分双齿Cu-膦配体。

3.2.6. 优化的Cu-膦配合物
通过对Cu-膦配合物进行系统评估，[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4被确定为最佳的单齿膦配体，而[Cu(R)-BINAP)(ACN)2]BF4和[Cu(dppf)(ACN)2]BF4被确定为最佳的双齿膦配体，表现出相似的性能。在初始采样条件下，双齿配体产生了较高的特征离子丰度；然而，进一步浓缩可能会增强配合物的形成。尽管全扫描质谱显示了较少见?9-THC异构体的类似特征离子形成模式，但MS/MS行为的潜在差异将在第3.4节中探讨。总体而言，这些配体的相似性表明，在最大化配体稳定性、选择性和特征离子丰度时，需要平衡空间压力。因此，这一步骤的逐步评估为使用Cu-膦配体区分?9-THC异构体奠定了基础。

3.3. 优化Cu-膦配合物的全扫描表征
优化的Cu-膦配合物能够有效区分?9-THC、CBD和?8-THC，通过类似的配合物形成过程，观察到的Cu-膦大麻素配合物的m/z值取决于膦配体的分子量。每天进行Q-TOF调谐，以验证相关m/z扫描范围内的质量准确性，这对于基于准确的质量测量进行可靠的配合物归属至关重要。使用来自单一商业供应商的大麻素CRM并在一致的分析条件下分析了一年，以确保配合物形成的重复性。还从另一供应商购买了第二个?9-THC CRM，以帮助确定?9-THC的次要离子组成。选择[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4作为示例Cu-膦配合物，以说明三种优化Cu-膦配合物的一般行为。

图6提供了在没有和有?9-THC（供应商A）、?9-THC（供应商B）、CBD、?8-THC、CBN、THCA-A和THCA-B的情况下[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4的全扫描质谱，用于表征与Cu-膦大麻素配合物相关的离子。由于[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4配体会自然生成多种背景离子，因此在引入大麻素之前有必要对这些物种进行表征。如图6A所示，在ACN中的[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4的背景离子分别出现在m/z 325.0194（C18H15PCu+；误差为?1.3 mDa）、m/z 366.0457（C20H18NPCu+；误差为?1.5 mDa）、m/z 587.1101（C36H30P2Cu+；误差为?1.7 mDa）和m/z 849.2003（C54H45P3Cu+；误差为?2.7 mDa），相应的离子组分为[Cu + PPh3]+、[Cu + PPh3 + ACN]+、[Cu + 2PPh3]+和[Cu + 2PPh3]+。这些离子共同反映了一系列配体结合/解离平衡，通过这些平衡，与Cu+结合的配体数量和种类可能会有很大变化。在ESI条件下可以直接观察到配体的动态交换。这种离子形态取决于配体的结合亲和力，以及Cu+离子和存在的配体（即ACN或PPh3）的浓度。大麻素的存在引入了涉及烯烃和/或酚基团结合的额外平衡。

图6. [Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4的示例全扫描质谱：A) 仅含Cu-膦络合物；B) 在?9-THC（供应商A）存在下；C) 在?9-THC（供应商B）存在下；D) 在CBD存在下；E) 在?8-THC存在下；F) 在CBN存在下；G) 在THCA-A存在下；H) 在THCA-B存在下。每个谱图中都圈出了含有大麻素的典型络合物。

图6B显示，在供应商A提供的?9-THC存在下，观察到两个特征离子，分别位于m/z 915.3163（C57H58O3P2Cu+；误差为+0.6 mDa）和m/z 1037.3344（C61H69O3P2Cu2+；误差为+3.6 mDa），分别称为主要离子和次要离子。m/z 915.3145的主要离子是主导的特征离子，其组分为[Cu + 2PPh3 + ?9-THC + O-2H]+。该物种的提议结构见图S4，其中包含一种与大麻素类似的氧化产物，这与作者之前使用[Cu(ACN)4]+ [29]进行的Cu络合研究中的观察结果一致。因此，Cu+离子不仅与烯烃结合，还激活了O2，导致氧原子插入到CH键中并 abstraction 了两个氢原子。m/z 1037.3344观察到的次要特征离子的组成尚未确定。虽然最初提出了[2Cu + 2PPh3 + ?9-THC + ACN + 2O]+的组成，其对应的m/z为1037，但所得到的质量误差达到了50 mDa，超过了可接受的质量容忍度（即5 mDa），因此排除了这种可能性。根据准确的质量测量和MS/MS产物离子谱，可以确定次要络合物必须包含?9-THC和2PPh3，并且很可能包含两个Cu原子而不是一个Cu原子，同时还包含一个与大麻素相关的额外有机片段，质量为73.0665 Da（即[2Cu + 2PPh3 + ?9-THC + 73.0665 Da]+）。在这些条件下，剩余的73.0665 Da与C2H7N3或C4H9O的元素组成一致，相应的化学式分别为[C59H67Cu2N3O2P2+；误差为?2.5 mDa]或[C61H69O3P2Cu2+；误差为+1.2 mDa]。然而，仅凭准确的质量数据是不够的，因为了解Cu-膦结合的原理对于理解复杂络合物的组成至关重要，特别是在两个Cu+离子参与的情况下，还需要考虑电荷中和的问题。如果次要离子的组成要与C59H67Cu2N3O2P2+一致，则必须存在含氮物种。乙酰胺是ACN的一种常见降解产物，很可能是氮的来源。如果乙酰胺参与了次要络合物的形成，那么对于其他?9-THC异构体也应该形成类似的次要离子，但由于所有样本使用了相同的ACN溶液，但并未观察到这种行为，因此排除了这种可能性。另一种可能的组成是[2Cu + 2PPh3 + ?9-THC + C4H9O]+；尽管C4H9O既不是PPh3配体也不是?9-THC的已知片段或降解产物。无法提出与已建立的Cu-膦配位行为或本研究中观察到的大麻素-Cu-膦络合物一致的化学合理结构。

为了确认次要离子的形成不是实验装置或仪器性能的产物，不同的分析师独立使用未开封的CRM安瓿和新鲜合成的Cu-膦络合物完成了实验程序。这些结果表明，次要离子是可重复的，不能归因于污染。另一方面，如果次要离子与?9-THC合成过程中的副产物有关，那么更换化学供应商可能有助于确定次要离子的来源，尽管具体的合成路线是专有的。图6C展示了一种从供应商B购买的?9-THC CRM，在相同的实验参数下进行分析，仅观察到m/z 915.3145（C57H58O3P2Cu+；误差为?1.2 mDa）的主要离子。这些结果强烈表明，次要离子的形成是由于初始?9-THC CRM中的某种成分，可能来源于其合成过程，而不是?9-THC本身的性质。需要注意的是，所有CRM的纯度都高于96%，并且从供应商A随机选取的一个CRM通过内部的ESI-MS和GC-EI-MS大麻素方法分析后未检测到任何可检测到的污染物或副产物，表明该CRM适合用于分析。综上所述，次要离子对于识别?9-THC是不可靠的，而主要离子在所有样本和供应商中都是一致观察到的。

如图6D所示，CBD在[Cu(PPh3)2(ACN)2]+存在下不会形成可观测的络合物。CBD没有形成可检测到的络合物可能表明形成了一个在质谱中不可观测的中性物种。因此，?9-THC和CBD是可以区分的，从而简化了大麻与大麻素的鉴别。图6E显示，?8-THC在m/z 915.3136（C57H58O3P2Cu+；误差为?2.1 mDa）处形成一个特征离子，其组分为[Cu + 2PPh3 + ?8-THC + O-2H]+。不幸的是，由于次要离子的性质依赖于制造商，仅凭全扫描质谱无法轻易区分?9-THC和?8-THC。未来的研究方向将集中在阐明负责在Cu-膦络合物存在下区分?9-THC和?8-THC的结构或化学特征上。尽管区分?9-THC的异构体很重要，但了解大麻提取物中可能存在的其他常见大麻素的络合物形成也是必要的。

在分析的二十种大麻素中，有十二种形成了类似[Cu + 2PPh3 + 大麻素 + O-2H]+的物种，其m/z值根据相应大麻素的分子量而有所不同（见表S4）。例如，图6F显示，分子量为310.1932 g/mol的CBN在m/z 911.2839（C57H54O3P2Cu+；误差为?0.5 mDa）处形成了特征性的[Cu + 2PPh3 + CBN + O-2H]+络合物。相反，CBC和CBT表现出类似CBD的模式，无法在全扫描质谱中形成可检测到的特征络合物。

图6G展示了酸性前体THCA-A的全扫描谱图，其特征离子分别位于m/z 1007.2476（C58H59O4P2Cu+；误差为?0.4 mDa）和m/z 1269.3391（C78H74O4P3Cu2+；误差为?1.6 mDa），分别为[2Cu + 2PPh3 + THCA-A-H]+和[2Cu + 3PPh3 + THCA-A-H]+。与氧原子插入不同，这种双铜物种经历了质子的丢失（H），使得整体电荷变为+1。对于THCA-A，质子的丢失可能来自于羧酸根离子的形成，如我们之前的研究[29]中所示，并在图S5中有所证明。CBDA也形成了相同的络合物。因此，从全扫描的角度来看，THCA-A和CBDA是无法区分的。然而，如图6H所示，THCA-B可以通过在m/z 683.2362（C40H45O4PCu+；误差为?3.3 mDa）处形成的特征离子与THCA-A区分开来，该离子由[Cu + THCA-B + 2PPh3]+组成，此外还有在m/z 1007.2469（C58H59O4P2Cu+；误差为?1.1 mDa）处也为THCA-A观察到的络合物。这些分子之间的结构差异在于羧酸的位置，THCA-A的羧基位于C-1位置，而THCA-B的羧基位于C-3位置，进一步说明了结构的微小差异如何影响能够区分大麻素的特征离子的形成。其余分析的大麻素、它们的Cu-PPh3络合物、化学式和准确的质量测量数据见表S4。

Cu((R)-BINAP和Cu(dppf)表现出类似的大麻素络合行为。对于?9-THC（供应商A）、CBD和?8-THC的区分，Cu((R)-BINAP和Cu(dppf)保持了与Cu(PPh3)相同的行为模式：?9-THC形成了主要和次要络合物，?8-THC仅形成了主要络合物，而CBD没有形成可观察到的络合物。然而，由于Cu(dppf)和Cu((R)-BINAP是双齿配体，相应的?9-THC主要和次要络合物分别只包含一个配体，即[Cu + (R)-BINAP + ?9-THC + O-2H]+、[Cu + (R)-BINAP + ?9-THC + C4H9O]+、[Cu + dppf + ?9-THC + O-2H]+和[Cu + dppf + C4H9O]+。这两种膦配体的空间体积和大小限制了它们与?9-THC结合第二个配体的能力。与[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4类似，其他?9-THC异构体没有出现次要特征离子，而是只出现了主要离子（见表S2和S6）。然而，对于供应商B提供的?9-THC标准品，也观察到了相同的行为（即没有形成次要离子）。对于所有三种优化的Cu-膦络合物，?9-THC及其最大的干扰物CBD可以使用全扫描质谱进行区分。尽管三种优化配体之间的大麻素总体行为高度一致，但在使用Cu((R)-BINAP的CBT中观察到了一个差异。在m/z 999.3512（C65H62O2P2Cu+；误差为?0.9 mDa）处观察到的特征离子[Cu + (R)-BINAP + CBT]+实际上是主要络合物，而[Cu + (R)-BINAP + CBT + O-2H]+则是次要络合物。尽管存在这种差异，但从全扫描的角度来看，Cu(PPh3)2、Cu(BINAP)和Cu(dppf)配体提供了相似的结果。

3.4. 优化Cu-膦络合物的MS/MS表征

尽管可以使用全扫描质谱区分?9-THC和CBD，但MS/MS产物离子谱提供了有关这些络合物形成的额外见解，有助于结构阐明。图7A展示了在25 eV激活条件下，[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4中?9-THC的特征离子的产物离子谱。在前体离子在标称m/z 915处进行CID激活时，观察到两条裂解途径：1）直接丢失含有?9-THC的片段；2）直接丢失PPh3配体。对于?9-THC观察到两条裂解途径，与我们之前对类似银络合物的研究结果相反，在那些研究中，[Ag + PPh3 + ?9-THC]+仅通过丢失?9-THC而裂解，因为其烯烃与Ag+离子的结合相对较弱[33]、[34]。这些结果表明，Cu+与?9-THC的结合比Ag+更强，可能是因为Cu-烯烃键更强，或者由于氧原子的存在。在第一条途径中，[?9-THC + O-2H]的中性丢失产生了m/z 587.1098（C36H30P2Cu+；误差为?2.0 mDa）的产物离子，对应于[Cu + 2PPh3]+。这个产物离子随后丢失了PPh3（?262 Da），形成了m/z 325.0191（C18H15PCu+；误差为?1.6 mDa）的次级产物离子。在另一种裂解途径中，中性的PPh3络合物从前体离子在标称m/z 915处直接解离，产生了m/z 653.2221（C39H43O3PCu+；误差为?2.4 mDa）的大麻素含有产物离子，对应于[Cu + PPh3 + ?9-THC + O-2H]+。剩余的PPh3（262 Da）丢失，形成了m/z 391.1316（C21H28O3Cu+；误差为?1.8 mDa）的[Cu + ?9-THC + O-2H]+产物离子。在这两种途径中，?9-THC都通过插入一个氧原子和 abstraction 两个氢原子（即[?9-THC + O-2H]+）发生了变化，表现为一个独特的实体。不幸的是，所有在标称m/z 915处具有特征离子的大麻素的MS/MS产物离子谱都包含了与?9-THC相同的裂解途径，因此无法进一步区分异构体。

图7. 示例MS/MS产物离子谱：A) 在25 eV激活能量下?9-THC的特征离子，m/z 915；B) 在35 eV激活能量下THCA-A的产物离子，m/z 1007；C) 在35 eV激活能量下CBDA的产物离子。THCA-A和CBDA的区分性产物离子被圈出。

相比之下，与双齿络合物[Cu(dppf)(ACN)2]BF4和[Cu((R)-BINAP)(ANC)2]BF4形成的?9-THC特征离子的MS/MS产物离子谱遵循单一的裂解途径，即从前体离子直接丢失?9-THC或含?9-THC的片段，从而形成仅含Cu-膦的产物离子。如图S5所示，对于[Cu(dppf)(ANC)2]BF4，特征离子位于m/z 945.2321（C55H56O3P2FeCu+；误差为?2.9 mDa），其组分为[Cu + dppf + ?9-THC + O-2H]+，通过中性丢失[?9-THC + O-2H]形成了m/z 617.0275（C34H28P2FeCu+；误差为?3.6 mDa）的产物离子，其中仅包含[Cu + dppf]+。在图S5中也观察到了相同的行为。S6对于[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4，其中含有大麻素的片段[?9-THC?+?O-2H]从中性丢失，来自相应的特征离子，其在m/z 1013.3275（C65H60O3P2Cu+；?3.8 mDa质量误差），该离子由[Cu?+?(R)-BINAP+?9-THC?+?O-2H]+组成，形成产物离子在m/z 685.1249（C44H32P2Cu+；?2.6 mDa误差），其中仅包含[Cu?+?(R)-BINAP]+。这些配体的立体体积提供了很大的稳定性；然而，这也阻止了其他碎片化途径，最小化了MS/MS产物离子光谱中可能存在的差异，从而能够区分大麻素。虽然全扫描质谱图能够区分?9-THC和CBD，但对于所有三种优化的配体，MS/MS产物离子光谱并没有提供额外的?9-THC异构体之间的分辨率。然而，与ESI-MS分析相比，所开发的方法仍然提供了更高的分析能力，在ESI-MS分析中，所有?9-THC异构体（包括CBD）都是无法区分的。相反，其他大麻素异构体，如THCA-A和CBDA，可以使用[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4进行区分。图7B和C提供了前体离子在标称m/z 1007（C58H59O4P2Cu2+；?1.3 mDa至?0.4 mDa误差）的MS/MS产物离子光谱，[2Cu?+?2PPh3?+?THCA/CBDA-H]+，显示出在标称m/z 483（C22H29O4Cu2+；?2.4 mDa至?1.8 mDa误差）、m/z 587（C36H30P2Cu+；?2.5 mDa至?0.1 mDa误差）、m/z 701（C39H44Cu2O2P+；+2.7 mDa误差）和m/z 745（C40H44O4PCu2+；?3.1 mDa至?2.7 mDa误差）观察到的共享产物离子，分别由[2Cu?+?THCA-A/CBDA-H]+、[Cu?+?2PPh3]+、[2Cu?+?PPh3?+?THCA-A-H-CO2]+和[2Cu?+?PPh3?+?THCA/CBDA-H]+组成。此外，在标称m/z 404.9520和m/z 637.2271（C39H43CuO2P+；?2.5 mDa质量误差）观察到THCA-A的区分性产物离子，在m/z 727.1431（C40H42O3PCu2+，?3.2 mDa误差）和m/z 465.0527（C22H27O3Cu2+，?2.5 mDa误差）观察到CBDA的区分性产物离子。在标称m/z 745观察到的共享离子与前体离子中的PPh3的初始丢失有关，形成[2Cu?+?PPh3?+?THCA/CBDA-H]+，并且可以进一步丢失PPh3，生成标称m/z 483的次要产物离子[2Cu?+?THCA/CBDA-H]+，或者丢失CO2，生成标称m/z 701的次要产物离子[2Cu?+?PPh3?+?CBDA-H]+。另外，尽管标称m/z 667的产物离子同时存在于THCA-A和CBDA的光谱中，但在所有碰撞能量下，这个离子在THCA光谱中的丰度要高得多。相比之下，标称m/z 587的产物离子由[Cu?+?2PPh3]+组成，是通过前体离子在标称m/z 1007中的Cu结合的去质子化的大麻素[Cu?+?CBDA-H]的中性丢失形成的。为了形成更具区分性的THCA-A特征产物离子，标称m/z 667的中间离子会丢失PPh3，形成标称m/z 405的特征离子，而标称m/z 701的中间离子会丢失CuH，形成标称m/z 637的特征离子。CBDA的特征产物离子通过不同的碎片化途径形成。标称m/z 727的产物离子可能是通过前体离子中直接丢失PPh3然后丢失H2O形成的，其最终组成为[2Cu?+?PPh3?+?C22H28O3-H]+，而标称m/z 465的产物离子可能是通过从前体离子中额外丢失PPh3或连续丢失两个(PPh3)基团然后丢失H2O形成的，最终组成为[2Cu?+?C22H28O3-H]+。CBDA和THCA-A之间的主要区别在于CBDA中丢失H2O的过程，这导致了在标称m/z 727和m/z 465处生成不同的产物离子。这可能是由于CBDA和THCA-A之间的结构差异，因为CBDA含有两个酚基团，使其更容易脱水。尽管[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4能够通过不同的区分性产物离子区分THCA-A和CBDA，[Cu(dppf)(ACN)2]BF4和[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4并没有提供足够的MS/MS区分能力。这些双齿配体的庞大体积和立体阻碍强烈稳定了Cu-磷环境，限制了碎片化途径。一旦施加碰撞活化能量，大麻素就会立即丢失，因此[Cu(dppf)(ACN)2]BF4和[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4的THCA-A和CBDA的MS/MS产物离子光谱非常相似，限制了它们在区分THCA-A和CBDA异构体方面的用途。这些发现强调了在实施Cu-磷离子络合方法时需要慎重选择配体的必要性。

3.5. 对真实大麻植物材料样品的甲醇提取物的分析
本手稿的主要重点是Cu-磷复合物的特征分析；然而，分析了一个真实样品以证明该方法对于真实大麻样品的可行性。图8显示了真实大麻植物材料样品的甲醇提取物中优化后的Cu-磷复合物的全扫描质谱图，包括未增强（图8A、C和E）和增强了各种大麻素（如CBN、?9-THC、THCA-A和CBDA）的增强（图8B、D和F）情况，以展示所开发方法的能力。与纯标准品不同，制备的真实样品由复杂的基质组成，影响了络合效率。即使经过1:1稀释，Cu-磷复合物的有限可用性也 necessitated 使用更高的Cu-磷复合物浓度，这些浓度是针对每种Cu-磷复合物进行优化的。此外，大麻提取物使用的是MeOH，因为MeOH是提取大麻的首选溶剂，可能会降低使用ACN作为溶剂的好处。然而，引入MeOH并没有实现仅在MeOH控制实验中观察到的Cu-磷离子的形成。这些发现提供了强有力的证据，表明ACN显著影响大麻素Cu-磷复合物的形成。

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图8. 使用A) [Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4、C) [Cu(dppf)(ACN)2]BF4和E) [Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4的未增强大麻植物材料甲醇提取物的全扫描质谱图，以及使用B) [Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4、D) [Cu(dppf)(ACN)2]BF4和F) [Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4的增强大麻植物材料甲醇提取物的全扫描质谱图。
未增强和增强真实样品的结果质量谱比较表明，从全扫描的角度来看，只能识别出?9-THC，可能还有THCA-A和/或CBDA，而只有使用Cu(PPh3)2时才能明确识别THCA-A和CBDA，因为MS/MS产物离子光谱存在差异。添加其他大麻素后，相应Cu-磷大麻素复合物的相对丰度略有增加，并且对于所有优化的Cu-磷复合物，都观察到了CBN的特征离子。因此，这一评估证明了所开发的方法可以检测自然存在和人为引入样品中的大麻素，为识别喷洒在大麻植物材料上的大麻素提供了有用的工具。
尽管在所有真实大麻Cu-磷复合物的全扫描质谱图中都检测到了至少一个感兴趣的大麻素的特征离子，但大麻基质的影响决定了哪些Cu-磷复合物物种更受青睐。在纯THCA-A和CBDA样品中，双齿配体[Cu(dppf)(ACN)2]BF4和[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4形成了单核[Cu?+?BINAP/dppf+THCA-A/CBDA-H]+和双核[2Cu?+?2BINAP/2dppf?+?THCA-A/CBDA-H]+特征离子。然而，在真实样品中，更高质量的双铜物种更受青睐，而单铜物种未被观察到，这表明在基质中较大复合物得到了优先稳定，这也与它们在纯样品中的相对优势一致。例如，图8E表明，使用[Cu(BINAP)(ACN)2]BF4时，预期的THCA-A和CBDA的特征离子在标称m/z 1042和m/z 1727均未出现；尽管在真实样品的质量谱中m/z 1042缺失，但标称m/z 1727的较高质量复合物确实存在。结果表明，双铜物种可能是更稳定的物种。虽然真实样品的质量谱更为复杂，没有包括纯标准品中观察到的所有特征离子，但使用三种优化的Cu-磷复合物至少检测到了一个识别特征离子。此外，在真实样品中没有观察到?9-THC的次要特征离子，进一步支持了次要离子的形成是?9-THC合成途径的副产品。

4. 结论
本研究对11种Cu-磷复合物进行了表征和评估，旨在寻找一种基于独特的全扫描或产物离子质量谱来区分大麻素异构体的Cu-磷复合物。通过利用Cu+对大麻素中烯烃部分的优先结合亲和力，大麻素结构的差异影响了结合方向，从而形成了特征性的Cu-磷大麻素复合物，从而实现了用ESI-MS方法无法实现的异构体区分。系统地评估了11种Cu-磷复合物在含有20种大麻素的ACN和MeOH溶剂系统中的表现，考虑了Cu-磷复合物的溶解性、大麻素复合物的形成、光谱复杂性、大麻素分析信号的分裂、大麻素异构体的区分以及特征离子的丰度。选择磷配体是由于它们具有可调的立体和电子性质、与Cu的强配位能力以及来自芳基取代基的增强的空气稳定性。
溶剂评估显示，溶剂的选择影响了Cu-磷大麻素复合物的形成。当使用相同的Cu-磷和大麻素在MeOH中时，形成的Cu-磷复合物类型增加，导致感兴趣的大麻素分析信号的分裂。相比之下，ACN支持更清晰和更可重复的络合。在检验的磷配体中，[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4被认为是最佳的单齿配体，而[Cu(dppf)(ACN)2]BF4和[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4被认为是最佳的双齿配体。对于优化的Cu-磷复合物，最初观察到一个一致的质量光谱模式，使得能够在全扫描质量谱中区分?9-THC、?8-THC和CBD：?9-THC形成了主要和次要特征离子，而CBD没有在全扫描质量谱中形成特征离子。不幸的是，次要离子的观察依赖于制造商；因此，无法在全扫描质量谱中区分?9-THC和?8-THC。然而，消除可测量的CBD复合物减少了?9-THC的干扰，从而更自信地识别?9-THC。所展示的直接质谱法在?9-THC和CBD之间的区分也表明，这种方法可以扩展到更快速的分析方法中，例如环境电离质谱法，用于大麻的鉴定。此外，使用[Cu(PPh3)2(ACN)2]BF4与[Cu(dppf)(ACN)2]BF4和[Cu((R)-BINAP)(ACN)2]BF4相比，其他大麻素异构体（如THCA-A和CBDA）也能够基于独特的MS/MS产物离子进行区分。这些发现突显了根据分析目标和必要的样品准备选择配体的重要性。
尽管本研究的主要目标是表征和评估11种合成的Cu-磷复合物，但对未增强和增强的大麻提取物的分析展示了该方法在现实世界样品中的潜在适用性。尽管大麻植物基质复杂，需要增加Cu-磷复合物的浓度，该方法仍然能够区分大麻素。这项研究还为未来定量或半定量Cu-磷离子络合研究奠定了基础，旨在区分大麻和大麻。值得注意的是，许多法医实验室正转向半定量决策点检测方法，而不是全定量方法。在这种情况下，由于有效排除了CBD，因此CBD复合物的缺失可能是有利的。尽管?9-THC和CBD易于区分，但还需要进一步的工作来区分其他?9-THC异构体。Cu-磷离子络合与LC色谱分离的结合可以帮助根据保留时间考虑产物离子比率，从而提高大麻素区分的信心。最后，尽管次要特征离子的形成可能是由于合成副产品，但未来的工作将致力于阐明能够在Cu-磷存在下实现?9-THC和?8-THC全扫描区分的化学成分，并将其纳入Cu-磷离子络合方法中，从而实现?9-THC、CBD和?8-THC的全扫描区分。总体而言，这项工作确立了Cu-磷离子络合作为区分?9-THC异构体的可行替代方法，为未来旨在区分大麻和大麻的分析工作提供了坚实的基础。