《Free Radical Biology and Medicine》：Nano-Selenium Attenuates Cadmium-Induced ER-phagy through Inhibition of TFEB Nuclear Translocation and FAM134B Downregulation
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镉 (Cadmium, Cd) 是一种有据可查的、与男性生殖功能障碍相关的环境污染物，因此迫切需要开发有效的治疗剂。纳米硒 (Nano-selenium, Nano-Se) 是一种具有强大抗氧化特性的先进硒补充剂，可减轻多种形式的重金属毒性。然而，Nano-S
镉 (Cadmium, Cd) 是一种有据可查的、与男性生殖功能障碍相关的环境污染物，因此迫切需要开发有效的治疗剂。纳米硒 (Nano-selenium, Nano-Se) 是一种具有强大抗氧化特性的先进硒补充剂，可减轻多种形式的重金属毒性。然而，Nano-Se在缓解Cd诱导的睾丸损伤中的作用尚不清楚。序列相似性家族134成员B (Family with sequence similarity 134 member B, FAM134B) 是首个被鉴定的内质网自噬 (Endoplasmic reticulophagy, ER-phagy) 受体，其介导的ER-phagy在生殖系统中起着至关重要的作用。在本研究中，研究人员将海兰白公鸡随机分为四组，进行为期90天的观察。收集公鸡的血清样本和睾丸组织样本用于后续检测。采用苏木精-伊红 (Hematoxylin-eosin, H&E) 染色、过碘酸-雪夫 (Periodic acid-Schiff, PAS) 染色、酶联免疫吸附试验 (Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) 试剂盒检测、蛋白质印迹 (Western blotting, WB)、免疫荧光 (Immunofluorescence, IF)、细胞热位移分析 (Cellular thermal shift assay, CETSA) 和分子对接技术，以探究Cd对生殖系统的影响及Nano-Se的缓解作用。体内实验表明，Nano-Se能有效减轻Cd暴露引发的睾丸萎缩和组织学损伤。Nano-Se逆转了Cd介导的类固醇生成相关蛋白的抑制，并提高了包括3β-羟基类固醇脱氢酶 (3β-HSD) 和胰岛素样因子3 (INSL3) 在内的睾丸间质细胞 (Leydig cell) 标志物的表达，从而改善了Cd引发的Leydig细胞功能障碍。与体内结果一致，使用原代公鸡Leydig细胞进行的体外试验表明，Nano-Se显著抑制了Cd激活的ER-phagy和过度的溶酶体酸化。在机制上，这种保护作用是通过阻断TFEB (转录因子EB) 核转位和防止FAM134B的下调实现的。本研究为其作为环境重金属污染物诱导的生殖毒性的潜在治疗药物的临床前研究提供了基础。
研究背景、问题与研究目的
镉 (Cd) 是一种具有高毒性、显著生物累积性的危险重金属污染物，广泛存在于环境中。它可通过农业-饲料链进入畜禽体内长期蓄积，并经由肉、蛋、奶等动物产品沿食物链传递至人体。镉是公认的多靶点毒物，其对男性生殖系统的毒性备受关注，可导致睾丸损伤、睾酮合成障碍、精子数量减少和形态异常，是男性生殖功能障碍的重要原因。尽管已有关于镉对家禽Leydig细胞影响的研究报道，但有效的治疗或缓解策略仍显不足。硒 (Se) 是一种具有强抗氧化特性的必需微量元素，研究表明其可有效缓解镉的毒性。然而，传统硒补充剂存在吸收率低、安全窗口窄的局限。纳米硒 (Nano-Se) 作为一种具有高生物利用度、高生物活性和低毒性的新型硒材料，近年来备受关注，但其在缓解镉诱导的睾丸损伤，特别是具体分子机制方面的作用仍不清楚。
本研究旨在阐明Nano-Se在缓解镉诱导的睾丸毒性中的作用与机制，重点关注镉是否通过诱导一种被称为内质网自噬 (ER-phagy) 的选择性自噬过程导致损伤，以及Nano-Se如何干预这一过程。内质网自噬受体FAM134B和调控自噬与溶酶体生成的转录因子TFEB (Transcription Factor EB) 是此过程的关键调控分子。论文发表在《Free Radical Biology and Medicine》期刊。
关键技术方法
为开展研究，研究人员首先建立了动物模型，将80只一日龄海兰白公鸡随机分组，进行了为期90天的处理与观察，采集血清和睾丸组织样本。随后，研究人员从公鸡睾丸中分离培养了原代Leydig细胞用于体外机制研究。在分析层面，综合运用了多种技术：通过H&E染色和PAS染色进行睾丸组织形态学评估；通过ELISA检测血清激素水平；通过Western Blotting和免疫荧光技术检测关键蛋白的表达与定位；通过细胞热位移分析 (CETSA) 验证纳米硒与靶蛋白的相互作用；并辅以分子对接技术从计算层面预测相互作用模式。
研究结果
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Nano-Se减轻Cd诱导的睾丸结构与功能损伤：体内实验显示，Cd暴露导致公鸡睾丸显著萎缩、长度缩短，生精小管内出现细胞碎片，生精细胞层次紊乱。Nano-Se处理有效缓解了这些结构损伤。同时，Cd暴露显著降低了血清睾酮水平和类固醇合成关键蛋白（如StAR、CYP11A1、3β-HSD）的表达，而Nano-Se恢复了这些指标。Cd还抑制了Leydig细胞标志物3β-HSD和INSL3的表达，Nano-Se则提升了它们的表达水平。这些结果表明Nano-Se能有效改善Cd引发的睾丸结构损伤和Leydig细胞功能障碍。
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Nano-Se抑制Cd诱导的ER-phagy和溶酶体过度酸化：Western Blotting结果显示，Cd暴露显著上调了内质网自噬受体FAM134B以及自噬标志物LC3-II和p62的水平，同时增加了溶酶体膜蛋白LAMP1的表达。免疫荧光共定位分析进一步证实，Cd增加了FAM134B与溶酶体标记物LAMP1的共定位，表明ER-phagy被激活。此外，Cd处理增强了溶酶体活性，表现为组织蛋白酶B (Cathepsin B) 活性增强和溶酶体酸化程度（通过LysoTracker染色评估）增加。Nano-Se处理则逆转了所有这些变化，显著抑制了Cd诱导的ER-phagy激活和溶酶体过度酸化。
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Nano-Se通过抑制TFEB核转位阻断Cd诱导的ER-phagy：机制探讨发现，Cd暴露促进了转录因子TFEB从细胞质向细胞核的转位，从而激活了其下游靶基因（包括FAM134B）的转录。免疫荧光和核质分离蛋白印迹结果均证实了Cd诱导的TFEB核转位增加。Nano-Se处理有效抑制了这一过程。进一步通过siRNA敲低TFEB表达后发现，TFEB的缺失减弱了Cd诱导的FAM134B上调和LC3-II积累。相反，过表达TFEB则加剧了Cd诱导的ER-phagy。这些结果证明，TFEB的核转位是Cd激活ER-phagy的关键步骤，而Nano-Se通过阻断此步骤发挥保护作用。
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Nano-Se通过与TFEB结合并抑制其核转位发挥作用：为探究Nano-Se的直接作用靶点，研究人员进行了细胞热位移分析。结果显示，Nano-Se处理增加了TFEB蛋白的热稳定性，表明两者之间存在直接结合。分子对接模拟也支持Nano-Se与TFEB蛋白的结合潜力。这些发现表明，Nano-Se可能通过直接结合TFEB，稳定其构象，从而阻止其在Cd刺激下发生核转位，最终抑制下游FAM134B介导的ER-phagy过度激活。
讨论总结与结论
综合讨论部分，本研究将Cd的睾丸毒性、ER-phagy的激活以及Nano-Se的保护作用联系在一个清晰的分子通路中。镉作为一种环境重金属污染物，可诱导内质网应激，长期应激可能过度激活以FAM134B为受体的ER-phagy，作为清除受损内质网的一种方式，但过度激活可能导致Leydig细胞稳态失衡和功能损伤。本研究揭示，Cd通过促进TFEB入核，上调FAM134B表达，进而过度激活ER-phagy并伴随溶酶体过度酸化，最终导致睾丸损伤。Nano-Se则通过直接结合TFEB，抑制其核转位，从而下调FAM134B的表达，减弱ER-phagy和溶酶体酸化，恢复Leydig细胞功能和睾丸结构。
结论：总之，本研究表明Nano-Se减轻了Cd引起的TFEB核转位增加，从而降低了FAM134B基因转录，减轻了溶酶体酸化程度，削弱了ER-phagy，缓解了Cd诱导的Leydig细胞稳态破坏以及睾丸结构和功能损伤。这些发现为重金属诱导的生殖疾病提供了潜在的治疗策略。
