FMO1通过ROS介导的机制破坏线粒体功能稳态驱动软骨细胞衰老和肥大

《Free Radical Biology and Medicine》：FMO1 disrupts mitochondrial functional homeostasis through ROS-mediated mechanisms to drive chondrocyte senescence and hypertrophy

　　

目的：诱导膜技术是处理大段骨缺损的临床策略，其依赖软骨内成骨过程，但该过程的代谢调控机制尚不明确。研究人员利用单细胞RNA测序分析诱导膜成骨过程中的软骨-骨动态变化，重点关注FMO1的作用。方法：在完成人类诱导膜的单细胞RNA测序谱分析后，研究人员采用三碘甲状腺原氨酸（T3）诱导的软骨细胞肥大体内外模型验证FMO1功能。机制研究涵盖FMO1基因敲低与过表达、药物抑制（甲巯咪唑）、靶向线粒体功能检测及衰老细胞清除（ABT-263）。结果：FMO1是一种通常与异源物质代谢相关的酶，其在软骨细胞肥大过程中表达上调。T3刺激与直接过表达FMO1均会增加细胞内及线粒体内活性氧水平。这种局部氧化应激通过改变线粒体动力学向分裂偏移（特征为Drp1上调、Mfn1/2下调）破坏线粒体稳态。该结构失衡通过p16/p21轴诱导细胞衰老，导致异常基质矿化及分解代谢标志物（COL10A1、MMP13）表达升高。遗传敲低或药物抑制FMO1，以及清除衰老细胞，均可减轻这些肥大与衰老表型。结论：研究人员揭示了连接代谢氧化应激与软骨细胞衰老的FMO1-ROS-线粒体轴。尽管生理性骨修复过程中存在基础水平的FMO1表达，但其持续激活会驱动病理性钙化和软骨退变。靶向该轴为调控成骨微环境及治疗软骨疾病提供了潜在的生物学策略。

论文解读：《FMO1通过ROS介导的机制破坏线粒体功能稳态驱动软骨细胞衰老和肥大》

研究背景与意义

大段骨缺损的修复是临床面临的重大挑战。诱导膜（Masquelet）技术作为治疗该类缺损的两阶段策略，其核心生物学机制依赖软骨内成骨过程——即 transient 软骨模板经历软骨细胞肥大、基质矿化及血管侵入最终形成骨组织。然而，调控这一微环境的细胞与代谢机制尚未完全阐明。既往研究表明，虽然软骨细胞肥大发生于生理性骨修复，但其持续进展与骨关节炎等病理性软骨退变密切相关，这一过程涉及异常基质钙化、细胞外基质分解代谢及与氧化应激相关的细胞衰老。黄素单加氧酶（Flavin-containing monooxygenase, FMO）家族作为参与异源物质代谢与细胞氧化应激调控的酶类，其催化过程可产生解偶联活性氧。基于此，研究人员假设FMO1可能作为连接软骨细胞肥大能量需求与后续氧化损伤及衰老的代谢纽带。本研究旨在揭示FMO1在软骨细胞调控中的骨骼功能，为膜诱导成骨提供理论依据，并为应激相关软骨退变确定潜在干预靶点。该研究发表于《Free Radical Biology and Medicine》。

主要技术方法

研究人员收集陆军军医大学大坪医院患者的临床标本，包括健康对照的骨膜组织与诱导膜术后8周获取的诱导膜标本，经伦理审批后开展研究。采用10x Genomics Chromium单细胞平台进行单细胞RNA测序，利用Seurat包进行生物信息学分析。构建三碘甲状腺原氨酸（Triiodothyronine, T3）诱导的体内大鼠模型与体外ATDC5小鼠软骨细胞系肥大模型。通过FMO1遗传操作（shRNA敲低、pcDNA3.1质粒过表达）与药物干预（甲巯咪唑抑制FMO活性、N-乙酰半胱氨酸清除ROS、ABT-263清除衰老细胞）解析机制。采用流式细胞术、透射电镜、Western blot、qRT-PCR、ELISA及组织染色等技术检测相关表型。

研究结果

4.1 对骨膜、诱导膜及感染骨膜组织标本进行单细胞转录组学分析

研究人员对三类组织进行单细胞测序，鉴定出17个细胞簇并注释为7种细胞类型。差异分析显示，诱导膜中富集COL10A1⁺肥大软骨细胞亚群，该群高表达COL10A1、HAPLN1、FMO1及MATN3。功能富集分析表明该亚群参与细胞外基质组织、软骨发育及骨骼形态发生，并激活ECM-受体相互作用、PI3K-Akt及AGE-RAGE等信号通路。

4.2 FMO1抑制剂改善大鼠软骨细胞肥大模型的软骨组织

在T3诱导的大鼠模型中，研究人员发现FMO1抑制可降低血清I型前胶原N端前肽（PINP）水平，部分恢复生长板形态（逆转增殖区变薄与肥大区/增殖区比值升高），并减少矿化面积，表明抑制FMO1可缓解T3诱导的软骨细胞肥大相关改变。

4.3 FMO1抑制剂抑制大鼠T3诱导的软骨细胞肥大、氧化应激与细胞衰老

Western blot结果显示FMO1抑制降低T3诱导的肥大/分解代谢标志物COL10A1与MMP13蛋白表达。组织ROS水平检测与透射电镜观察证实，FMO1抑制可减少T3诱导的ROS积累，并改善线粒体碎片化和嵴结构破坏。此外，FMO1抑制还降低p16与p21的mRNA表达及衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）阳性细胞比例。

4.4 T3细胞模型的建立

体外实验显示，T3刺激ATDC5细胞上调FMO1、COL10A1及MMP13蛋白表达，增加ROS生成，并引起线粒体碎片化、膜电位下降、p16/p21表达升高、SA-β-Gal阳性细胞增多及基质矿化增强。过表达FMO1可直接诱导ROS积累、衰老标志物表达升高。进一步研究发现，清除衰老细胞可降低T3诱导的FMO1、COL10A1及MMP13蛋白水平。

4.5 敲低FMO1减轻T3诱导的软骨细胞肥大、氧化应激、线粒体功能障碍与细胞衰老

FMO1敲低不影响基础ROS水平，但可逆转T3诱导的细胞内与线粒体ROS积累，改善线粒体碎片化与膜电位下降。机制上，FMO1敲低逆转T3导致的Drp1、Pink1、Parkin上调及Mfn1、Mfn2下调。同时，FMO1敲低降低T3诱导的p16/p21表达、SA-β-Gal阳性细胞比例及基质矿化。

4.6 NAC与甲巯咪唑干预减轻T3诱导的软骨细胞肥大、氧化应激、线粒体功能障碍与细胞衰老

抗氧化干预（N-乙酰半胱氨酸）与FMO抑制（甲巯咪唑）均可降低T3诱导的ROS积累，减少COL10A1与MMP13蛋白表达，改善线粒体形态与功能，并抑制细胞衰老与基质矿化，但两者均未逆转T3对FMO1的上调作用。

讨论与结论

研究人员指出，FMO家族虽以异源物质代谢闻名，但本研究首次揭示其在骨骼生物学中的作用。不同于既往认知中FMO表达与应激抵抗相关，本研究发现软骨细胞中FMO1活性增加会促进病理性细胞功能障碍。FMO1催化产生的过氧化氢通过解偶联反应驱动局部氧化应激，进而破坏线粒体稳态——表现为线粒体动力学向分裂偏移（Drp1上调，Mfn1/2下调）及线粒体自噬标志物Pink1/Parkin激活，最终导致线粒体碎片化与膜电位下降，这是软骨细胞肥大与衰老的核心特征。

研究明确了FMO1的阈值依赖性效应：基础水平FMO1支持生理性骨修复所需的肥大转化，但持续激活则推动病理进程。研究人员提出FMO1-ROS-线粒体轴模型：T3作为上游驱动因子上调FMO1表达，其酶活性（而非ROS反馈环路）决定下游分解代谢级联反应。清除衰老细胞可减少肥大标志物表达，证实细胞衰老直接参与病理肥大表型。该机制与骨关节炎软骨退变具有相似性，提示FMO1可能是退变软骨纤维化转变与分解代谢的上游代谢催化剂。

研究局限性在于主要依赖T3诱导模型，未能完全模拟体内诱导膜的复杂微环境；缺乏FMO1酶活死突变体的验证；其转化潜力需在大动物模型中评估生理骨愈合的脱靶效应。

结论部分，研究人员证实FMO1通过ROS介导的分裂过程破坏线粒体稳态，进而促进软骨细胞衰老与肥大。靶向FMO1-ROS-线粒体轴为调控应激性软骨退变及优化局部微环境以促进骨再生提供了潜在的生物学策略。