《International Immunopharmacology》：Cigarette smoke-induced caspase-12 nuclear translocation compromises oral mucosal defense via RIP2 and NF-κB signaling
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香烟烟雾是损害口腔黏膜免疫的主要环境风险因素；然而，烟雾诱导上皮功能障碍的机制仍不明确。在这项研究中，研究人员将香烟烟雾诱导的caspase-12核积累确定为一个先前未被识别的事件，该事件与上皮先天免疫反应的失调有关。对临床口腔白斑组织和主动吸烟大鼠模型的分析
香烟烟雾是损害口腔黏膜免疫的主要环境风险因素；然而，烟雾诱导上皮功能障碍的机制仍不明确。在这项研究中，研究人员将香烟烟雾诱导的caspase-12核积累确定为一个先前未被识别的事件，该事件与上皮先天免疫反应的失调有关。对临床口腔白斑组织和主动吸烟大鼠模型的分析揭示了白斑样上皮改变，并伴有增强的白念珠菌（Candida albicans）定植，同时伴有caspase-12、NF-κB p65和RIP2的显著核富集。在永生化的人口腔黏膜上皮Leuk-1细胞中，暴露于香烟烟雾提取物（CSE）诱导了浓度依赖性的caspase-12、NF-κB p65和RIP2核积累，支持了香烟烟雾对上皮免疫信号的直接作用。沉默caspase-12减弱了CSE诱导的NF-κB p65核定位并改变了RIP2的分布。重要的是，caspase-12敲低恢复了上皮抗菌功能，这表现为在CSE暴露下，抗菌肽hBD1和hBD3的分泌增加，以及上皮培养上清液对白念珠菌的抗真菌活性增强。总之，这些发现表明caspase-12核积累导致了香烟烟雾诱导的上皮先天免疫功能受损。
该论文题为《香烟烟雾诱导的caspase-12核易位通过RIP2和NF-κB信号通路损害口腔黏膜防御》，发表于《International Immunopharmacology》。研究针对香烟吸烟这一广泛存在的环境暴露因素，深入探讨了其破坏口腔黏膜屏障、导致真菌感染易感性增加的分子机制。既往研究表明吸烟者口腔内白念珠菌定植显著增加，且常伴有口腔黏膜病变，但具体的内在信号转导途径尚不明确。本研究创新性地揭示了caspase-12在细胞核内的新功能，阐明了其在香烟烟雾作用下如何作为核心调节因子干扰上皮先天免疫应答，为理解吸烟相关口腔疾病的发病机制提供了重要的理论依据。
为实现上述目标，研究人员采用了多维度的研究策略与技术手段。在临床层面，收集了吸烟与非吸烟口腔白斑患者的组织样本进行对比分析。在动物实验层面，构建了雄性Wistar大鼠的主动吸烟模型以模拟人类吸烟环境。在细胞实验层面，利用永生化人口腔黏膜上皮细胞系Leuk-1，并给予不同浓度的香烟烟雾提取物（CSE）干预。关键技术方法涵盖了蛋白质印迹（Western blot）分析核蛋白提取物的表达变化、免疫荧光（IF）与共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位、免疫共沉淀（Co-IP）验证蛋白相互作用、电泳迁移率变动分析（EMSA）检测NF-κB DNA结合活性、小干扰RNA（siRNA）介导的基因沉默以及酶联免疫吸附试验（ELISA）测定抗菌肽分泌水平。
研究结果部分详细展示了从临床样本到基础实验的证据链：
首先，在临床样本分析中，研究人员通过对非吸烟者（n=12）和吸烟者（n=12）的口腔白斑组织进行H&E染色、真菌银染、PAS染色及抗白念珠菌免疫组化分析，证实了吸烟者组织中白念珠菌感染频率显著增高。同时，Western blot和免疫组化结果显示，吸烟者组织中caspase-12、NF-κB p65和RIP2的核水平明显升高，而抗菌肽hBD1和hBD3的表达则显著降低。
其次，在大鼠主动吸烟模型中，经过3个月的吸烟暴露，大鼠口腔黏膜出现了类似人类的白斑样病理改变，包括过度角化、棘层肥厚等，且PAS染色证实烟熏大鼠口腔内真菌成分增多。Western blot及免疫组化进一步验证了大鼠口腔黏膜中caspase-12、NF-κB p65和RIP2的核表达上调，伴随hBD1和hBD3表达的下降。
第三，在体外细胞实验中，研究人员发现CSE处理可呈浓度依赖性（0.5%-8%）诱导Leuk-1细胞核内caspase-12、NF-κB p65和RIP2的积累，并降低hBD1和hBD3的分泌。
第四，机制探索显示，Co-IP和免疫荧光双标证实caspase-12在细胞核内与NF-κB p65及RIP2形成复合物。EMSA结果进一步表明，CSE增强了NF-κB的DNA结合活性，且caspase-12参与了该DNA结合复合物的构成。
第五，功能回复实验表明，通过siRNA沉默caspase-12后，能够逆转CSE诱导的NF-κB p65核易位，恢复RIP2的正常分布，并显著提升hBD1和hBD3的分泌水平。
最后，抗菌实验证明，来自caspase-12沉默细胞的培养上清液表现出更强的抑制白念珠菌生长的能力，表现为吸光度降低及菌落形成减少。
在讨论部分，研究人员指出，传统观点认为caspase-12主要与内质网应激和凋亡相关，而本研究首次揭示了其在细胞核内作为NF-κB p65和RIP2的调控伙伴的新角色。尽管NF-κB DNA结合活性增强，但由于可能干扰了CBP/p300等转录共激活因子的募集，导致下游抗菌肽基因转录受阻。这一“功能性转录障碍”解释了为何吸烟环境下尽管存在炎症信号激活，黏膜防御功能反而受损的现象。此外，香烟烟雾中的活性氧（ROS）、活性醛类及尼古丁可能通过诱发内质网应激驱动了caspase-12的活化与核易位。
研究结论总结如下：本研究证明香烟烟雾诱导了caspase-12的核易位及其与NF-κB p65和RIP2的结合，导致上皮免疫信号改变。这些变化伴随着抗菌肽产生的减少和上皮防御功能的受损，从而增加了口腔黏膜对白念珠菌定植的易感性。值得注意的是，沉默caspase-12可在香烟烟雾暴露下部分恢复上皮抗菌功能，突显了caspase-12在介导烟雾相关黏膜免疫失调中的潜在作用。
