STpas2-SToxf540 碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌体内替加环素耐药演化：机制与全球流行病学视角

《International Journal of Antimicrobial Agents》：In Vivo Evolution of Tigecycline Resistance in ST540 Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii: Mechanisms and Global Epidemiological Perspective

　　

碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（Carbapenem-Resistant Acinetobacter baumannii, CRAB）是一种持续性医院获得性病原体，由于治疗选择有限而对全球健康构成重大威胁。尽管替加环素（tigecycline, TGC）对CRAB仍然有效，但其耐药性的出现已成为一个关键问题。本研究旨在阐明CRAB体内替加环素耐药的演化机制。从一名接受替加环素治疗的重症监护室（Intensive Care Unit, ICU）住院患者的直肠拭子、痰液样本及周围环境标本中，共回收了11株STpas2-SToxf540型CRAB菌株。核心基因组单核苷酸多态性（core-genome single-nucleotide polymorphism, cgSNP）分析证实了这些CRAB分离株之间存在环境到患者的传播。比较基因组分析表明，adeS、pgaA和gbsA的突变可能与替加环素耐药相关。通过原位突变和药敏试验验证，adeSN125S突变介导了替加环素耐药以及对头孢哌酮/舒巴坦（cefoperazone/sulbactam, SCF）的附带敏感性。生长曲线测定显示，adeSN125S突变对CRAB施加了适应度代价。转录分析表明，adeSN125S突变通过上调AdeABC外排泵的表达驱动了替加环素耐药的发展。通过检查45,377个公开可用的全球A. baumannii基因组序列，研究人员描述了STpas2-SToxf540谱系的分子流行病学及adeS突变的分布。这些发现强调了加强监测和合理使用抗菌药物以防止CRAB传播和抗菌药物耐药性进化的重要性，尤其是在ICU环境中。

一、研究背景与意义

碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌（CRAB）是院内感染的主要病原体，可导致呼吸机相关性肺炎、血流感染和导管相关尿路感染等，尤其在重症监护室（ICU）免疫功能低下患者中发病率和死亡率较高。由于其对多种抗菌药物耐药（多重耐药，MDR），治疗选择极为有限。替加环素作为甘氨酰环素类抗菌药物，通过结合细菌30S核糖体亚基抑制蛋白质合成，是目前对抗CRAB的最后防线之一。然而，随着替加环素的广泛应用，临床分离株中其耐药性日益增多，成为严峻挑战。当前，对替加环素耐药鲍曼不动杆菌的研究多集中于体外诱导实验、病例报告和分子流行病学调查，而针对临床分离株体内耐药演化机制的研究仍较匮乏。体内微环境与选择压力远比体外复杂，因此体内进化研究更能阐明细菌在复杂宿主压力下的耐药与致病机制。

为填补这一研究空白，本研究聚焦于一例接受替加环素治疗的CRAB定植患者，旨在揭示体内替加环素耐药的演化轨迹，并通过生物信息学分析与分子实验验证，阐明其耐药机制，为理解CRAB的耐药进化及临床防控提供新的见解。该研究发表于《International Journal of Antimicrobial Agents》。

二、主要技术方法

研究从浙江省人民医院ICU一名41岁男性患者的临床标本（痰液、直肠拭子等）及周围环境（床栏、呼吸机面板等19个位点）中分离出11株ST_pas2-ST_oxf540型CRAB菌株。采用肉汤微量稀释法进行药敏试验。通过全基因组测序（WGS）结合Illumina NovaSeq平台，进行基因组组装、注释及耐药基因鉴定，并利用Pasteur和Oxford分型方案进行多位点序列分型（MLST）。通过核心基因组SNP（cgSNP）分析菌株间的遗传关系。利用比较基因组学识别与耐药相关的突变基因。采用原位诱变技术在敏感菌株RH173中分别重建adeSN125S、pgaAN310I和gbsAL265*突变，验证其对替加环素耐药性的影响。通过生长曲线测定评估突变菌株的适应度。利用RNA-seq（转录组测序）分析突变菌株与野生型菌株的差异表达基因（DEGs），探究耐药机制。此外，从NCBI数据库下载45,377个鲍曼不动杆菌基因组序列，对ST_pas2-ST_oxf540谱系进行全球流行病学及adeS突变分布分析。

三、研究结果

3.1 患者菌株特征与耐药谱

从患者及其周围ICU环境中分离的11株ST_pas2-ST_oxf540 CRAB菌株对头孢哌酮/舒巴坦、环丙沙星、亚胺培南、美罗培南和阿米卡星均耐药，但对多黏菌素B敏感。值得注意的是，在替加环素治疗期间及治疗后（第5天和第19天）从直肠拭子样本中分离的两株CRAB菌株（RB55和RB65）表现出对替加环素耐药，而其他所有菌株（包括痰液来源的M21）对替加环素敏感。

3.2 菌株遗传关系与耐药相关基因

系统发育树显示，12株CRAB菌株分为两个簇，其中11株属于ST_pas2-ST_oxf540，携带包括碳青霉烯酶基因bla_OXA-23在内的多种耐药基因。cgSNP分析表明，这些ST_pas2-ST_oxf540菌株具有相似的遗传背景。比较基因组分析发现，两株替加环素耐药菌株（RB55和RB65）与敏感菌株RH173之间存在三个相同的点突变：adeSN125S、pgaAN310I和gbsAL265*。这三个突变仅在两株耐药菌株中存在，而在其他敏感菌株中未检测到，提示它们可能与替加环素耐药相关。

3.3 突变基因在替加环素耐药中的作用

通过在敏感菌株RH173中分别重建上述三个突变，研究人员发现adeSN125S突变使替加环素最低抑菌浓度（MIC）升高超过两个倍比稀释度，而pgaAN310I和gbsAL265*各升高一个倍比稀释度。此外，adeS突变株对头孢哌酮/舒巴坦表现出附带敏感性。生长曲线测定显示，adeSN125S突变显著降低了细菌的最大生长速率、曲线下面积（AUC）和最大OD₆₀₀值，表明该突变对细菌施加了适应度代价。转录组分析显示，与野生型相比，adeSN125S突变株中有20个差异表达基因（DEGs），其中编码RND外排泵AdeABC的三个基因（adeA、adeB、adeC）显著上调，表明该突变通过上调AdeABC外排泵的表达介导了替加环素耐药。

3.4 ST_pas2-ST_oxf540的全球流行病学与AdeS突变分布

对全球45,377个鲍曼不动杆菌基因组序列的分析显示，共鉴定出28,610株ST_pas2菌株，其中ST_oxf208最为流行，ST540在ST_pas2菌株中排名第9。ST_pas2-ST_oxf540菌株仅在中国和美国被发现，其中中国占绝大多数（94.6%），且主要来源于血流感染（31.1%）。在533株ST_pas2-ST_oxf540菌株中，18株（3.4%）存在adeS突变，包括两株携带adeSN125S突变的菌株。系统发育树和cgSNP相似性矩阵分析显示，这些菌株之间存在显著的遗传变异，而本研究的11株菌均位于最大的分支内。

四、讨论与结论

讨论总结：

CRAB被列为关键优先级病原体，其出现和传播对临床感染管理构成严峻挑战。替加环素作为第三代四环素类药物，能规避由四环素特异性外排泵和核糖体保护蛋白介导的耐药，对包括CRAB在内的多种MDR病原体具有强效活性。然而，细菌已进化出多种策略对抗替加环素，导致耐药菌株的出现。本研究通过比较基因组学、原位突变和转录组学等方法，系统揭示了体内替加环素耐药的演化机制，并聚焦于adeSN125S这一新发现的突变。

AdeS与其同源反应调节蛋白AdeR构成双组分系统AdeRS，广泛调节细菌的抗菌药物耐药性、适应性和毒力。AdeS感知环境信号并传递给AdeR，从而激活转录并调节下游基因（包括adeABC）的表达。AdeRS功能域的突变与替加环素耐药相关，是鲍曼不动杆菌产生该耐药性的主要机制。本研究发现，adeSN125S突变通过上调AdeABC外排泵的表达介导替加环素耐药，同时赋予对头孢哌酮/舒巴坦的附带敏感性，并导致细菌适应度降低。这种附带敏感性表型提示，针对AdeS激酶活性或信号转导的小分子抑制剂可能抑制AdeABC的过表达，恢复替加环素对耐药菌株的活性。此外，快速检测该突变可使临床医生及时采用含舒巴坦的治疗方案，从而改善临床结局并减少不必要的抗生素使用。

从全球视角看，ST_pas2-ST_oxf540谱系分布相对局限，主要集中在中国和美国，且绝大多数菌株携带OXA-23碳青霉烯酶。该谱系在血流感染中占比突出，提示其可能具有较强的突破局部黏膜屏障、侵入循环系统引起全身性感染的能力。因此，需持续监测该谱系，并及时采取针对性治疗和干预策略以降低血流感染相关的临床风险。

ICU中CRAB定植或感染的发生率高于其他病房，这与ICU患者病情危重、常接受侵入性操作和强化抗菌治疗有关。此外，CRAB菌株具有较强的环境定植能力，这会加速环境到患者的传播及后续感染。本研究中多数ST_pas2-ST_oxf540 CRAB分离株来自患者的直肠拭子和周围环境样本，cgSNP差异表明存在活跃的环境到患者传播。值得注意的是，一株分离自痰液的菌株（M21）与两株替加环素耐药的定植菌株（RB55和RB65）属于同一克隆型，提示从定植菌株进展为感染菌株的潜在风险。鉴于替加环素耐药进一步限制了CRAB的临床治疗选择，这些发现强调了在ICU入院患者中常规筛查MDR细菌、加强ICU环境清洁消毒以及对定植患者主动去定植的必要性。同时，替加环素治疗施加的抗菌压力可能是驱动鲍曼不动杆菌体内替加环素耐药进化的关键因素。因此，密切监测治疗后细菌分离株的抗菌药物敏感性变化并及时调整治疗方案至关重要。

本研究存在一定局限性，如菌株来自单一ICU中心、样本量有限，全球流行病学分析依赖于公开基因组序列可能存在抽样偏差，且功能验证主要集中于adeSN125S突变，而pgaA和gbsA突变的具体作用有待进一步探索。尽管如此，本研究结果增进了对CRAB体内替加环素耐药进化的理解，为临床经验性治疗、抗菌药物管理和感染控制实践提供了关键证据。

结论翻译：

总之，研究人员在ICU住院患者中实施了CRAB筛查计划，识别了环境储存库与患者之间的CRAB传播以及CRAB体内替加环素耐药的演化。数据表明，adeSN125S突变通过上调AdeABC外排泵的表达介导了体内替加环素耐药的发展，同时赋予对头孢哌酮/舒巴坦的附带敏感性并施加适应度代价。从全球视角，研究人员描述了ST_pas2-ST_oxf540谱系的分子流行病学特征以及该谱系内adeS突变的分布。总之，这些发现为ICU环境中抗菌药物的合理使用和CRAB病原体的监测提供了重要基础。