《International Immunopharmacology》：Celastrol alleviates LPS-induced acute lung injury by suppressing neutrophilic inflammation burst through targeting AKT
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张宇|杨云|林志锋|陈日坤|强新华|李畅|郭伟光|曹军|叶银农|周立新中国广东省佛山市第一人民医院（南方科技大学附属医院）重症医学科，南方科技大学医学院摘要背景急性肺损伤（ALI）是一种严重的、危及生命的炎症性疾病，其特征是无法控制的中性粒细胞炎症和组织损伤。这突显了创新药物治疗
张宇|杨云|林志锋|陈日坤|强新华|李畅|郭伟光|曹军|叶银农|周立新
中国广东省佛山市第一人民医院（南方科技大学附属医院）重症医学科，南方科技大学医学院
摘要
背景
急性肺损伤（ALI）是一种严重的、危及生命的炎症性疾病，其特征是无法控制的中性粒细胞炎症和组织损伤。这突显了创新药物治疗方法的迫切需求。本研究的目的是探讨从雷神藤中提取的主要生物活性化合物Celastrol对ALI的影响及其作用机制。
方法
在本研究中，我们使用C57BL/6小鼠的脂多糖（LPS）诱导的ALI模型来评估Celastrol的效果。通过整合网络药理学和转录组学（RNA-seq）技术筛选潜在的治疗靶点。此外，还评估了中性粒细胞的功能，包括呼吸爆发、脱颗粒、趋化性及中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成。NETs的释放通过MPO-DNA复合物ELISA进行定量。关键的是，使用特定的AKT激活剂SC79进行了实验，以验证其对AKT信号通路的功能依赖性。
结果
研究结果表明，Celastrol通过降低肺泡毛细血管膜功能障碍并抑制中性粒细胞的招募和活化，从而对LPS诱导的ALI发挥保护作用。多组学分析表明AKT是Celastrol的关键靶点。Venn图分析进一步确定了网络药理学和转录组学之间的10个核心共通靶点，其中包括AKT1。分子对接显示Celastrol与AKT1、AKT2和AKT3之间具有高结合亲和力，激酶实验也证实了Celastrol能显著抑制AKT激酶活性。Western blotting进一步证实了这种特异性靶向作用，表明Celastrol降低了AKT（Ser473和Thr308）的磷酸化程度，而不影响上游的PI3K。此外，Celastrol还抑制了LPS诱导的中性粒细胞活化，表现为ROS生成、弹性蛋白酶释放、趋化性和NETs形成的减少。机制上，Celastrol通过PAD4/citH3轴抑制NETs的形成，并通过FAK/Rac1/Cdc42通路抑制趋化性。值得注意的是，AKT激活剂SC79显著逆转了这些抑制效应，证实Celastrol主要通过靶向AKT来缓解中性粒细胞的活化和NETs的形成。
结论
Celastrol有可能作为治疗LPS诱导的ALI的候选药物，通过靶向AKT来抑制中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒、趋化性和NETs的形成。这些发现为Celastrol的免疫调节作用提供了新的机制见解，尽管其临床应用仍需进一步验证。
引言
急性呼吸窘迫综合征（ARDS）是一种严重的急性肺损伤（ALI）形式，其特征是急性低氧血症和非心源性肺水肿，医院死亡率高达30%以上[1] [2]。尽管支持性护理有所进展，但死亡率仍然居高不下[3]。ALI的发病机制涉及复杂的炎症级联反应，其中中性粒细胞的过度激活和招募起着核心作用[4]。激活后，中性粒细胞不仅释放细胞毒性颗粒和活性氧（ROS），还会排出DNA形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）[5]。NETosis是一种由肽基精氨酸脱亚胺酶4（PAD4）介导的组蛋白瓜氨酸化（如citH3）严格调控的特化细胞死亡过程[6]。虽然NETs对捕获病原体至关重要，但其在无菌炎症或严重感染中的不受控制的形成会加重组织损伤并促进血栓形成[7] [8]。因此，针对中性粒细胞激活和NETs形成是治疗ALI的有希望的治疗策略。
Celastrol，也称为三萜酚，是从雷神藤中提取的主要生物活性化合物[9]。Celastrol具有广泛的医疗价值，被认为是有潜力开发成现代药物的五大传统天然化合物之一[10]。研究表明，它具有抗炎[11]、抗肿瘤[12]、抗肥胖[13]、抗糖尿病[14]作用。近期研究证明其在多种炎症性疾病中的疗效。Celastrol通过减少炎症细胞因子的表达、抑制结肠细胞凋亡、促进巨噬细胞极化以及清除ROS来改善溃疡性结肠炎[15]。同样，Celastrol通过激活Keap1/Nrf2介导的抗炎反应减轻糖尿病血管损伤[16]。在肺损伤方面，证据表明Celastrol可通过改善线粒体功能和激活AMPK/PGC-1α/Nrf1信号通路来减轻LPS诱导的ALI[17]。其他研究也强调其通过NF-κB信号通路抑制炎症的能力[18]。尽管有这些令人鼓舞的发现，但Celastrol调节中性粒细胞行为的特定分子靶点和机制，特别是在ALI期间NETs的形成和呼吸爆发方面，仍不完全清楚。深入了解Celastrol对ALI/ARDS影响的机制可能加速其应用以及ARDS药物治疗的进展。
在本研究中，我们整合了网络药理学和转录组学来识别Celastrol在LPS诱导的ALI中的潜在治疗靶点。我们确定AKT为核心靶点，并利用分子对接和激酶活性试验探讨了Celastrol与AKT之间的相互作用。此外，我们还阐明了Celastrol-AKT轴在调节中性粒细胞呼吸爆发、脱颗粒、趋化性和NETs形成中的作用。关键的是，我们使用特定的AKT激活剂SC79进行了挽救实验，证实Celastrol通过靶向AKT介导的中性粒细胞活化发挥保护作用。
节片段
试剂
Celastrol（纯度≥98%）购自MedChemExpress（美国新泽西州蒙茅斯联合市）。特定的AKT激活剂SC79购自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿）。脂多糖（LPS）（大肠杆菌 O55: B5）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。免疫组化实验中使用的抗体购自Servicebio（中国武汉）。Western blotting实验中使用的抗体包括针对AKT、磷酸化AKT Ser473、磷酸化AKT Thr308、PI3K的抗体。
Celastrol保护小鼠免受LPS灌注诱导的ALI
为了确定Celastrol在LPS灌注诱导的ALI中的作用，雄性C57BL/6小鼠在气管内灌注LPS之前接受了Celastrol处理或未接受处理。结果表明，与对照组相比，Celastrol处理显著提高了ALI小鼠的存活率（图1A）和体重减轻（图1B）。此外，Celastrol预处理显著改善了LPS诱导的病理变化（图1D，F），并减少了通过MPO染色确定的中性粒细胞积聚
讨论
本研究证明Celastrol对LPS诱导的ALI具有强大的保护作用。我们发现Celastrol显著减轻了肺水肿、病理损伤和炎症细胞浸润。通过整合多组学分析和实验验证，我们阐明了Celastrol通过靶向AKT来抑制中性粒细胞的呼吸爆发、脱颗粒、趋化性和NETs的形成，从而减轻肺组织损伤。
长期以来，中性粒细胞...
结论
总之，我们的研究表明Celastrol通过特异性靶向AKT，有效抑制中性粒细胞的激活和NETosis。这些发现不仅扩展了我们对Celastrol药理学的理解，也支持其作为ALI/ARDS精准治疗候选药物的潜力。
CRediT作者贡献声明
张宇：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、可视化、验证、项目管理、方法学、实验设计、资金获取、数据分析、概念构思。杨云：撰写 - 审稿与编辑、撰写 - 原稿、可视化、验证、方法学、实验设计、数据分析。林志锋：撰写 - 审稿与编辑、软件使用、资源准备、方法学、实验设计、数据分析。陈日坤：可视化、验证
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家自然科学基金会（编号：82502643）的广东省科技计划（编号：202018782）以及广东省医学科学研究基金（编号：B2025331）的支持。
