间充质干细胞在疫苗接种后调控一个低氧微环境，该环境有助于骨髓中生成特异性抗原识别的CD8+组织驻留记忆T细胞

《International Immunopharmacology》：Mesenchymal stem cells orchestrate a hypoxic niche that supports the generation of antigen-specific CD8+ tissue-resident memory T cells in bone marrow after vaccination

　　

王书毅|林张梅|朱洁英|苏瑞婷|李锦|阮新元|庄莉莉|钱一超|文静萍|赖艺梅|杨年生|张志基|张慧

广州中山大学第一附属医院风湿病学与临床免疫学系，510080

摘要

虽然骨髓（BM）微环境在长期体液免疫中的作用已经得到充分证实，但其在疫苗诱导的长期T细胞记忆中的作用仍不甚明了。本研究证明，在接种灭活SARS-CoV-2疫苗后长达307天的时间内，骨髓仍维持着一库活跃的刺突特异性CD4⁺和CD8⁺ T细胞。值得注意的是，骨髓中的刺突特异性CD8⁺ T细胞频率显著高于外周血液。单细胞RNA和TCR测序显示，骨髓中存在一种独特的刺突特异性CD8⁺组织驻留记忆T（T_RM）细胞亚群，其特征为独特的转录特征、克隆扩增能力和强烈的细胞毒性。进一步研究发现，骨髓微环境与间充质干细胞（MSCs）共同参与了长期T细胞记忆的建立，为抗原特异性CD8⁺ T_RM细胞的发育提供了重要环境。机制上，MSCs通过HIF1信号通路为CD8⁺ T_RM细胞提供缺氧环境并促进其分化。我们的发现表明，骨髓是疫苗诱导的持久性T细胞记忆的关键储存库，并揭示了以前未被充分认识的保护机制——即由基质细胞引导、适应微环境的T_RM细胞发挥作用。这项工作重新定义了骨髓作为接种后细胞免疫记忆建立的重要场所。

引言

免疫记忆包括T细胞和B细胞，对于抵御病原体至关重要[1], [2]。在疫苗学中，诱导强大且持久的T细胞记忆是一个关键目标，尤其是针对快速变异的病毒。记忆T细胞能够靶向病毒内部的保守表位，提供广泛的细胞保护，即使在体液免疫被规避的情况下也能减轻疾病严重程度[3], [4]。长期记忆T细胞在初次接触抗原后产生，并作为多样化的、自我更新的细胞群持续存在，具备快速而强烈的反应能力[5], [6]。研究表明，接种十年后的记忆T细胞仍保留效应阶段的表观遗传特征，在病原体重新暴露时能迅速响应，这是记忆T细胞提供长期免疫保护的关键机制[7]。

记忆T细胞主要分为四类循环亚群：T干细胞样记忆细胞（T_SCM）、中枢记忆T细胞（T_CM）、效应记忆T细胞（T_EM）和CD45RA⁺效应记忆T细胞（T_EMRA），以及一种非循环的细胞群——组织驻留记忆T细胞（T_RM[8]。T_RM细胞驻留在外周组织中，充当屏障部位的哨兵，提供即时的局部免疫防御[1], [9]。由于其解剖位置，T_RM细胞比循环中的T_CM或T_EM细胞能更快地应对再次感染。流感感染后产生的肺CD4⁺和CD8⁺ T_RM细胞已被证明能有效清除病毒、增强致命挑战下的生存能力并提供异亚型保护[10], [11]。有趣的是，虽然减毒流感疫苗能促进保护性肺T_RM细胞的形成，但灭活疫苗在诱导此类反应方面效果较差[12]，这引发了关于灭活疫苗是否以及如何在骨髓中建立持久性T_RM储存库的关键问题。

骨髓是白细胞产生的主要场所，也是免疫记忆细胞的长期储存库[13]。骨髓中含有抗原特异性记忆T细胞[14]，并在T细胞动态中发挥双重作用：既是活跃增殖的场所[15], [16]，也是细胞静息的适宜环境[17]。此外，骨髓基质细胞具有强大的免疫调节作用，包括抑制异基因和有丝分裂原诱导的T细胞增殖[18]、诱导T细胞无应答[19]和凋亡[20]，以及调节T细胞细胞因子的产生[21]。在该微环境中，CD69⁺ T细胞约占CD4⁺记忆T细胞的30%和CD8⁺记忆T细胞的60%，这些细胞通常处于静息状态，同时保持数十年的抗原特异性记忆[22]。鉴于T_RM细胞被认为是长期免疫的有希望的介导者[23]，目前尚不清楚灭活疫苗是否能促进骨髓中抗原特异性T_RM细胞的生成，以及这一过程是如何调控的。

我们之前的研究证实，在接种灭活SARS-CoV-2疫苗后六个月内，外周血液中仍能检测到刺突特异性T细胞反应。然而，这些反应是否在骨髓中也得以维持尚不明确。因此，本研究旨在分析灭活SARS-CoV-2疫苗在人骨髓和外周血液中诱导的记忆T细胞反应。我们试图确定骨髓是否为刺突特异性CD8⁺ T_RM细胞提供功能性的微环境，并阐明其背后的基质支持机制。研究发现表明，骨髓是诱导细胞免疫的活跃场所，并揭示了骨髓间充质干细胞（MSCs）通过HIF1α信号通路调控CD8⁺ T_RM细胞的分化，为理解疫苗介导的保护作用提供了新的视角。

部分摘要

研究设计和参与者

所有参与者均完成了灭活SARS-CoV-2疫苗的第二剂接种。骨髓样本和外周血液样本在同一天采集，平均在接种后307.67 ± 75.62天。六名参与者中有四名为女性，平均年龄为62.50 ± 20.90岁。两名参与者有高血压史，一名患有2型糖尿病。所有参与者均未报告与接种相关的不良事件或之前的SARS-CoV-2感染。

灭活疫苗在周围血液和骨髓中诱导长期抗原特异性CD4⁺ T细胞记忆

为了研究疫苗诱导的T细胞记忆的持久性，我们在接种灭活SARS-CoV-2疫苗后采集了血液和骨髓样本，并测量了抗原特异性T细胞。通过使用刺突肽池刺激细胞，以确定刺突特异性T细胞的水平及其记忆表型（门控策略见补充图1）。与之前的数据[24]一致，AIM⁺ CD4⁺ T细胞在所有外周血液样本中可持续检测到，持续时间长达12个月。

讨论

本研究证明，灭活SARS-CoV-2疫苗在人类骨髓中建立了持久的T细胞记忆场所。我们发现，骨髓中维持着多样的抗原特异性CD4⁺ T细胞（包括T_CM、T_EM、T_SCM亚型），其数量与外周血液中的相当。值得注意的是，骨髓是抗原特异性CD8⁺ T细胞的主要储存库，其频率显著高于外周血液。通过scRNA-seq分析，发现一个功能活跃的CD8⁺ T_RM亚群

CRediT作者贡献声明

王书毅：撰写——初稿、方法学、研究设计、资金获取、数据分析、概念构建。林张梅：撰写——初稿、验证、研究设计、数据分析。朱洁英：数据可视化、验证、研究协助。苏瑞婷：撰写——初稿、数据可视化、验证。李锦：数据验证、数据分析。阮新元：研究协助。庄莉莉：研究协助。钱一超：数据验证。文静萍：研究协助。

资金声明

本工作得到国家非传染性疾病重大科技项目（2023ZD0507600）和国家自然科学基金（82471764、92474103）对H.Z.的支持；以及国家自然科学基金（82302023）对S.W.、国家自然科学基金（82171770、82471818）对N.Y.的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文研究的财务利益或个人关系。