《International Immunopharmacology》：Tempol alleviates autoimmune uveitis by targeting the oxidative stress-mediated cGAS-STING-NF-kB signaling pathway to restore M1/M2 macrophage polarization balance
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目的：评估Tempol是否通过减轻氧化应激相关的线粒体损伤、减少胞浆线粒体DNA（mtDNA）积累、抑制环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激蛋白-核因子κB（cGAS-STING-NF-κB）通路激活，从而限制M1巨噬细胞极化，以缓解自身免疫性葡萄膜炎。
目的：评估Tempol是否通过减轻氧化应激相关的线粒体损伤、减少胞浆线粒体DNA（mtDNA）积累、抑制环状GMP-AMP合成酶-干扰素基因刺激蛋白-核因子κB（cGAS-STING-NF-κB）通路激活，从而限制M1巨噬细胞极化，以缓解自身免疫性葡萄膜炎。
方法：收集葡萄膜炎患者和健康对照者的外周血样本，并建立实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型。将大鼠分为正常对照组（NC）、EAU组、EAU联合cGAS shRNA敲低组（sh-cGAS）、EAU联合空载体组（Vector）、EAU联合STING抑制剂H151组（H-151）及EAU联合Tempol组（Tempol）。通过Western blotting、定量PCR、流式细胞术、Seahorse XF代谢分析、透射电镜等方法评估氧化应激、线粒体状态、胞浆mtDNA、cGAS-STING通路激活及巨噬细胞极化。
结果：与对照组相比，葡萄膜炎患者和EAU大鼠表现出活性氧（ROS）增加、线粒体膜电位丧失、线粒体呼吸功能受损、胞浆mtDNA升高，并伴有cGAS-STING-NF-κB轴激活（cGAS、STING、p-TBK1、p-p65和IFN-β增加）及下游促炎输出增强（TNF-α和iNOS增加），以及向M1巨噬细胞极化的转变。Tempol可降低氧化应激，改善线粒体功能、超微结构及线粒体自噬（mitophagy），减少胞浆mtDNA，并减弱cGAS-STING-NF-κB激活。类似地，sh-cGAS或H-151抑制通路激活后，恢复了抗氧化防御（Nrf2/Keap1/HO-1），改善了与线粒体自噬相关的质量控制（PINK1/Parkin增加，p62减少），减少了M1巨噬细胞极化，并减轻了眼部炎症损伤。
结论：Tempol通过改善线粒体稳态、减少胞浆mtDNA、降低cGAS-STING-NF-κB激活、增强线粒体自噬相关质量控制，同时减少M1巨噬细胞极化和眼组织损伤，从而缓解自身免疫性葡萄膜炎。cGAS敲低和STING抑制的结果为这一氧化应激-mtDNA-cGAS-STING轴作为免疫介导性葡萄膜炎的治疗靶点提供了机制支持。
一、研究背景与问题
自身免疫性葡萄膜炎（Autoimmune Uveitis, AU）是一种免疫介导的眼部炎症性疾病，是导致不可逆性视力损害和失明的主要原因之一。其发病机制不仅涉及过度的免疫应答，还与免疫细胞能量代谢和氧化还原稳态的深度紊乱相关。氧化应激作为代谢紊乱的标志，可触发线粒体功能障碍、线粒体DNA（mtDNA）泄漏和脂质过氧化，从而持续加剧炎症级联反应和组织损伤。cGAS-STING（cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes）轴是将线粒体代谢应激转化为下游天然免疫信号的关键分子桥梁，但其在葡萄膜炎中如何链接氧化应激驱动的mtDNA感知与巨噬细胞炎症极化，尚未完全明确。巨噬细胞在自身免疫性葡萄膜炎中起关键作用，其极化状态（促炎的M1型与抗炎/修复的M2型）决定炎症严重程度和疾病进展。因此，本研究旨在系统探究cGAS-STING信号是否通过扰动线粒体功能和氧化还原稳态驱动巨噬细胞M1极化，从而放大葡萄膜炎的炎症反应，并为靶向该通路提供治疗新策略。
二、研究概况与意义
本研究整合临床葡萄膜炎样本和实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型，结合分子功能实验，阐明了一条连接氧化应激驱动的线粒体损伤、胞浆mtDNA积累、cGAS-STING-NF-κB激活与巨噬细胞极化的免疫代谢轴。研究证实，Tempol（一种具有催化抗氧化活性的膜通透性氮氧自由基）可作为上游干预手段，通过减轻线粒体氧化损伤、抑制mtDNA驱动的cGAS-STING激活和炎症性巨噬细胞编程，从而缓解葡萄膜炎。该工作发表于《International Immunopharmacology》，为理解葡萄膜炎的免疫代谢机制提供了新视角，并为临床干预提供了潜在靶点。
三、关键技术方法
研究采用以下主要技术方法：1. 临床样本分析：收集葡萄膜炎患者和健康对照者的外周血样本。2. 动物模型建立：建立实验性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型，并分组进行干预（包括正常对照、EAU、cGAS shRNA敲低、STING抑制剂H151处理、Tempol处理等）。3. 分子与细胞检测：通过Western blotting、定量PCR、流式细胞术、Seahorse XF细胞能量代谢分析、透射电镜等技术，评估氧化应激指标、线粒体功能、胞浆mtDNA水平、cGAS-STING-NF-κB通路蛋白表达及磷酸化、巨噬细胞极化标志物等。
四、研究结果
1. cGAS-STING-NF-κB信号通路在自身免疫性葡萄膜炎中被激活
通过对比葡萄膜炎患者和健康对照者外周血样本，发现患者组cGAS、STING、磷酸化TBK1（p-TBK1）和磷酸化p65（p-p65）表达显著上调，表明cGAS-STING-NF-κB通路在葡萄膜炎中被激活。
2. Tempol减轻氧化应激并改善线粒体功能
在EAU大鼠模型中，Tempol处理显著降低了活性氧（ROS）水平，改善了线粒体膜电位、线粒体呼吸功能和超微结构，并增强了线粒体自噬（表现为PINK1/Parkin表达增加、p62减少）。
3. Tempol减少胞浆mtDNA积累并抑制cGAS-STING-NF-κB激活
Tempol处理后，胞浆mtDNA水平下降，cGAS、STING、p-TBK1、p-p65等通路蛋白表达降低，下游促炎因子TNF-α和iNOS也随之减少。
4. cGAS敲低或STING抑制模拟了Tempol的保护效应
在EAU模型中，通过shRNA敲低cGAS或使用STING抑制剂H151，均能抑制cGAS-STING-NF-κB通路激活，恢复抗氧化防御（Nrf2/Keap1/HO-1轴），改善线粒体自噬，减少M1巨噬细胞极化，并减轻眼部炎症损伤。
5. Tempol恢复巨噬细胞极化平衡
流式细胞术等分析显示，葡萄膜炎状态下巨噬细胞向M1型极化（高表达iNOS、TNF-α）增强，而Tempol处理可逆转这一趋势，促进M2型极化（高表达Arg-1、IL-10），从而恢复M1/M2平衡。
五、讨论与结论
讨论总结：本研究揭示了一条“氧化应激-线粒体损伤-胞浆mtDNA泄漏-cGAS-STING-NF-κB激活-巨噬细胞M1极化”的炎症放大轴在自身免疫性葡萄膜炎中的核心作用。临床样本和动物模型一致显示，葡萄膜炎伴随氧化应激加剧、线粒体功能障碍、胞浆mtDNA积累以及cGAS/STING信号激活，这些变化共同驱动巨噬细胞向促炎的M1表型极化。Tempol通过其抗氧化活性，上游抑制氧化应激，进而改善线粒体稳态、减少mtDNA泄漏、削弱cGAS-STING通路激活，最终恢复巨噬细胞极化平衡。cGAS敲低和STING抑制实验进一步证实了该通路的枢纽地位。这些发现为以氧化应激-mtDNA-cGAS-STING轴为靶点治疗免疫介导的葡萄膜炎提供了机制依据。
结论翻译：本研究确定Tempol作为一种有效的上游干预手段，可通过破坏氧化应激-mtDNA-cGAS-STING-NF-κB炎症回路来减轻自身免疫性葡萄膜炎。在葡萄膜炎患者和EAU大鼠模型中，氧化应激均伴随线粒体功能障碍和胞浆mtDNA增加，同时出现cGAS-STING-NF-κB信号激活和M1相关巨噬细胞极化增强。Tempol降低了ROS负荷，改善了线粒体稳态，减少了胞浆mtDNA，并抑制了cGAS-STING-NF-κB的激活。这些变化与巨噬细胞极化从促炎M1表型向抗炎M2表型的转变相关。cGAS敲低和STING药理学抑制在体外和体内实验中均重现了Tempol的保护作用，进一步证实cGAS-STING信号是连接氧化应激、线粒体损伤和巨噬细胞驱动的炎症的关键节点。因此，靶向该氧化应激-mtDNA-cGAS-STING轴可能为自身免疫性葡萄膜炎提供一种新的治疗策略。
