吡啶嗪-3-甲酰胺衍生物作为有效STING激动剂的发现及其抑制伪狂犬病病毒复制的作用

《International Immunopharmacology》：Discovery of Pyridazine-3-carboxamide derivatives as potent STING agonists that suppress pseudorabies virus replication

　　

摘要 背景：干扰素基因刺激蛋白（STING）通路是宿主抵御病毒感染的关键组成部分，是开发广谱抗病毒疗法的一个有吸引力的靶点。虽然基于环二核苷酸（CDN）的STING激动剂已被广泛研究，但非CDN小分子激动剂的开发仍然有限，特别是在兽医学应用领域。 方法：为了开发具有微摩尔级激动活性、抗病毒活性、稳定性和安全性的STING激动剂，研究人员采用了组合策略。通过基于结构的方法，对先导化合物SR717进行改造，合成了一系列吡啶嗪-3-甲酰胺衍生物。研究人员评估了这些类似物的抗病毒活性、细胞毒性、作用机制、体内安全性和疗效。 结果：ST26显著提高了人源和小鼠源STING蛋白的热稳定性，并在THP1细胞中引发了有效的免疫刺激效应，表现为干扰素β（IFNβ）和促炎趋化因子CXCL10的表达上调，以及关键下游信号蛋白的磷酸化。ST26显示出良好的细胞毒性特征，并在体外具有显著的抗病毒活性。重要的是，ST26抑制了PK15细胞中的病毒复制，并在体内对主要兽医病原体——伪狂犬病病毒（PRV）表现出强大的功效。 结论：机制研究证实，ST26特异性地激活cGAS-STING通路，在细胞和动物模型中诱导有效的先天免疫反应，且未观察到细胞毒性。ST26是一种有前景的宿主导向抗PRV感染药物，为兽医学中控制PRV爆发提供了一种新的治疗策略。

研究背景、问题与研究动机

伪狂犬病病毒（PRV）是一种属于疱疹病毒科的DNA病毒，最初在美国发现，随后在全球传播。猪是其主要的宿主，但PRV也能导致牛、羊、狗、猫等多种哺乳动物发生致命疾病。在猪中，PRV感染表现为神经系统症状、呼吸系统问题和生殖障碍，导致新生仔猪高死亡率。尽管gE基因缺失的Bartha-K61疫苗已成功用于控制经典PRV毒株，但野生型和变异毒株的不断出现仍对全球养猪业构成持续威胁，凸显了开发更有效疫苗和治疗方法的需求。

宿主的先天免疫应答是抵御病毒病原体的第一道防线。当感染发生时，宿主通过模式识别受体（PRRs）的激活启动先天免疫，从而诱导I型干扰素（IFN-I）的产生。cGAS-STING轴是先天抗病毒免疫的核心通路，其激活可导致IFN-I和促炎细胞因子的产生。STING作为内质网膜蛋白，其信号转导连接了细胞内在防御与适应性免疫。包括PRV在内的α疱疹病毒，已进化出多种策略来靶向破坏cGAS-STING信号通路的各个组分，从而逃逸宿主的先天免疫应答。因此，外源激活STING可以对抗这些病毒逃逸策略，恢复IFNs和炎性细胞因子的强效产生。STING激动剂的开发已成为药物研发的一个焦点。

天然环二核苷酸激动剂，如2‘3’-cGAMP，在临床应用中存在局限性，包括细胞靶向性不足、膜通透性差和稳定性低等问题。后续开发的改良CDN激动剂如ADU-S100和MK-1454，也面临着局部给药限制、清除快、治疗窗窄、全身毒性风险高和疗效有限等挑战。因此，具有广泛应用潜力的全身性非CDN小分子STING激动剂被开发出来，例如diABZI、化合物53、MSA-2等。然而，STING激动剂的开发仍面临挑战，包括平衡生物活性与类药性质的困难，以及过度免疫激活可能引发自身免疫性疾病的风险。尽管SR717代表了一类新结构，但对其构效关系的研究较少，吡啶嗪-3-甲酰胺类似物也需要更系统的结构修饰和构象分析。因此，本研究旨在设计合成具有改良抗病毒活性的吡啶嗪-3-甲酰胺衍生物作为有效的STING激动剂。

关键技术方法概述

本研究采用基于结构的设计方法，以前体类似物SR001为起点，合成了24个吡啶嗪-3-甲酰胺衍生物。研究人员评估了这些化合物的STING激动活性和抗病毒活性，使用了包括STING热位移实验、报告基因检测、ELISA、Western blot、RT-qPCR、免疫荧光等多种体外和体内技术。在THP1-Dual报告细胞、PK15细胞系以及BALB/c小鼠模型中，对候选化合物ST26的免疫刺激效应、细胞毒性、抗病毒效力、作用机制、体内安全性和疗效进行了综合评价。所有动物实验均获得河南牧业经济学院实验动物伦理审查委员会的批准。

研究结果

1. ST26的设计、合成与STING激动活性评估

基于对先导化合物SR001的结构分析，研究人员设计了一系列吡啶嗪-3-甲酰胺衍生物。ST26是其中优化得到的化合物。在STING热位移实验中，ST26显著提高了人源和小鼠源STING蛋白的热稳定性，表明其能与STING蛋白结合。在THP1-Dual报告基因细胞中，ST26表现出强大的STING激动活性，其半数有效浓度（EC₅₀）为0.14 μM，约为SR001（EC₅₀= 8.4 μM）激动活性的60倍。ST26能显著上调干扰素β（IFNβ）、CXCL10等下游效应分子的表达水平，并诱导IRF3、TBK1、STING等关键信号蛋白的磷酸化，且该效应具有剂量依赖性。这些结果表明ST26是有效的STING激动剂。

2. ST26的体外抗病毒活性

研究人员评估了ST26对伪狂犬病病毒（PRV）的体外抗病毒活性。实验结果显示，ST26在PK15细胞中能有效抑制PRV的复制，其抗病毒活性呈剂量依赖性。ST26的治疗指数（SI）高于阳性对照药物阿昔洛韦，表明其在有效浓度下具有更好的安全性。机制研究表明，ST26的抗病毒作用依赖于STING的激活，因为在使用STING敲低的细胞中，其诱导的干扰素表达和抗病毒效果被显著削弱。此外，ST26在多种细胞系中对另一种DNA病毒——塞内卡病毒A（SVV）也显示出抑制作用，提示其可能具有广谱抗DNA病毒活性。

3. ST26的体内安全性与疗效

在BALB/c小鼠模型中评估了ST26的体内安全性。经腹腔注射或静脉注射后，ST26处理组小鼠的体重、主要脏器（心、肝、脾、肺、肾）系数、血液学参数和血清生化指标与对照组相比均无显著差异，且主要脏器病理切片未观察到明显损伤，表明ST26在体内具有良好安全性。在PRV感染的小鼠模型中，与感染对照组相比，ST26治疗显著提高了小鼠的存活率，降低了肺组织中的病毒载量，减轻了肺组织的病理损伤。这表明ST26在体内能有效对抗PRV感染，发挥保护作用。

4. 作用机制研究

为阐明ST26的作用机制，研究人员进行了一系列实验。结果证实，ST26特异性激活cGAS-STING通路。在THP1细胞中，ST26处理诱导了IRF3的核转位，这是STING通路激活的下游关键事件。此外，ST26诱导的IFNβ和ISGs（干扰素刺激基因）表达上调，可被TBK1抑制剂（BX795）或IRF3抑制剂（BX795）所阻断。在STING敲除的细胞中，ST26失去诱导干扰素和抗病毒的能力。这些数据综合表明，ST26通过激活cGAS-STING-IRF3信号轴，引发强大的先天免疫反应，从而发挥抗病毒作用。

讨论与结论总结

讨论部分指出，PRV的频繁突变极大地削弱了疫苗诱导的免疫保护，并限制了对新发变异株的交叉保护。因此，迫切需要开发新的广谱抗病毒药物，作为补充疫苗免疫的最后一道防线。小分子药物因其广泛可得性和低毒性，已成为抗病毒药物研发的关键焦点。本研究结果证实，所设计的化合物ST26作为一种高效、低毒的非CDN小分子STING激动剂，在体外和体内均显示出显著的抗PRV活性，其机制是通过特异性激活cGAS-STING通路。这为开发针对PRV及其他病毒感染的宿主导向疗法提供了新的候选分子和策略。

结论

STING的激活在免疫疗法和疫苗开发方面显示出巨大前景，迫切需要新型、低毒、高效且稳定的非CDN小分子STING激动剂。在本研究中，研究人员以前药6-(1H-咪唑-1-基)吡嗪-3-甲酰胺苯甲酸酯为起点，合理设计并合成了一系列新型的基于吡啶嗪-3-甲酰胺的STING激动剂。在这些化合物中，ST26（EC₅₀= 0.14 μM）的激动活性约为SR001的60倍，并显著提高了人源和小鼠源STING蛋白的热稳定性。机制研究表明，ST26特异性地激活cGAS-STING通路，诱导IRF3磷酸化和核转位，从而引发先天免疫反应。重要的是，ST26在体外和体内对PRV均表现出强大的抗病毒活性，且未观察到明显的细胞毒性或体内毒性。因此，ST26代表了一类有前景的宿主导向抗病毒药物，可用于控制PRV感染。这项研究为兽医学领域开发新型抗病毒疗法提供了新的思路和化合物实体。