胞外70 kDa热休克蛋白在血浆中结合胰岛素并体内调节血糖控制

《Cell Stress and Chaperones》：Extracellular 70 kDa heat shock protein in blood plasma binds insulin and modulates glycaemic control in vivo

　　

背景与假说：70 kDa热休克蛋白家族（HSP70）在细胞内通过维持蛋白质三维完整性，防止形成激活炎症通路的细胞毒性聚集体，从而保护蛋白稳态。组成型和应激诱导型HSP70亚型均在热休克反应（HSR）中维持蛋白稳态，这是一种在蛋白质毒性应激和代谢紊乱后恢复细胞稳态的进化保守抗炎机制。在稳态受威胁的条件下（如热休克和交感神经系统被强烈激活的体力活动），HSP70可能分泌到胞外空间，作为免疫调节剂和促炎危险信号发挥作用。包括肥胖和2型糖尿病在内的慢性炎症性疾病，其特征是血液循环中胞外HSP70水平持续升高，这与胰岛素抵抗和β细胞功能障碍相关。值得注意的是，葡萄糖摄入可阻断运动诱导的HSP70分泌，提示了胞外HSP70可能通过结合胰岛素来调节血糖的新作用。 结果：研究人员在此揭示了一种新的反向调节机制，即血浆HSP70以高亲和力（Kd~3 pM）结合胰岛素，损害胰岛素依赖组织的葡萄糖摄取，但不影响受体信号传导。在经历热休克的禁食大鼠中，升高的血浆HSP70在葡萄糖耐量试验中（30分钟时）使血糖升高约3 mM，从而增强了非胰岛素依赖组织的葡萄糖可用性。热休克诱导的葡萄糖不耐受在热休克后12小时达到峰值，此过程依赖于HSP70相互作用蛋白（HIP）。然而，热休克增强了胰岛素生成指数和胰岛素敏感性，在24小时后达到峰值。 结论：这一观察挑战了HSP70仅作为分子伴侣在细胞内发挥作用的范式，揭示了其在血浆中通过HIP辅助的蛋白质-蛋白质相互作用在胞外血糖调节中的作用，从而为血糖管理提供了一个新的临床视角。 转化前景：这些发现表明，人源化抗HSP70单克隆抗体可以减轻胰岛素隔离，并为恢复胰岛素敏感性、改善血浆HSP70升高的疾病（如2型糖尿病、肥胖、非酒精性脂肪性肝病和心血管疾病）的代谢结果提供了一种新的治疗策略。

研究背景与问题：

热休克蛋白70（HSP70）家族以其在细胞内的分子伴侣功能而闻名，负责维持蛋白质的正确折叠和防止应激下的蛋白质聚集。然而，在各种生理应激条件下，如热休克（HS）、剧烈运动和低血糖，HSP70不仅可在细胞内表达升高，还可被分泌到细胞外空间进入血液循环。慢性炎症性疾病，如2型糖尿病（T2DM）和肥胖，患者体内常观察到血浆胞外HSP70水平持续升高，并与胰岛素抵抗和β细胞功能障碍相关。虽然胞内HSP70具有抗炎和保护作用，但胞外HSP70通常被视为促炎的危险信号分子。值得注意的是，葡萄糖摄入可抑制运动诱导的HSP70分泌，暗示胞外HSP70可能在血糖调节中扮演角色。目前的研究对胞外HSP70在系统性代谢，特别是血糖稳态调节中的直接作用尚不清楚，传统的观点也认为HSP70的分子伴侣功能局限于胞内环境。因此，探究胞外HSP70是否以及如何与胰岛素相互作用，进而影响血糖控制，对于理解代谢应激反应和代谢性疾病的病理生理机制具有重要意义。

研究概要与目的：

本研究发表在《Cell Stress and Chaperones》上，旨在探究胞外HSP70是否通过结合胰岛素来调节其生物利用度，从而在应激状态下影响血糖控制。研究人员通过计算机模拟、体外结合实验、体内动物模型及分子生物学技术，系统验证了血浆HSP70与胰岛素的高亲和力结合，并阐明其在热休克应激下对血糖水平的调节作用及其潜在机制。

主要关键技术方法：

研究人员采用了多层次的技术体系。在计算机模拟方面，利用分子对接和分子动力学（MD）模拟分析了人源和鼠源HSP70亚型与胰岛素的相互作用构象及结合能。在体外结合实验中，通过免疫共沉淀、免疫印迹、竞争结合分析（Eadie-Hofstee图）和Scatchard图，在含有血浆成分的环境中测定了HSP70与胰岛素之间的亲和力（K_d）和半抑制浓度（IC₅₀）。在动物体内实验中，使用雄性Sprague-Dawley大鼠建立模型。通过腹腔注射葡萄糖耐量试验（ipGTT）和胰岛素耐量试验（ipITT）评估热休克（HS，42°C 15分钟）处理对大鼠血糖和胰岛素敏感性的动态影响。利用放射标记的2-脱氧葡萄糖（[³H]-2DG）和[¹⁴C]-葡萄糖追踪组织葡萄糖摄取和利用。通过酶联免疫吸附测定法（ELISA）和免疫印迹检测血浆中HSP70（包括诱导型HSP72和组成型HSP73）、HIP及胰岛素水平。此外，还使用了抗HSP70单克隆抗体、HIP蛋白、HSP70蛋白进行干预，以验证功能。通过ex vivo培养大鼠比目鱼肌，在含有血清和不同浓度HSP70、胰岛素的培养基中评估2-DG摄取，以探究对胰岛素信号通路的影响。

研究结果：

2.1. HSP70在计算机、体外和体内与胰岛素结合并隔离

分子对接和动力学模拟显示，胰岛素精准地结合在HSP70（HSPA1A）的底物结合域（SBD）裂隙中，该结合是稳定的，涉及特定的氨基酸残基相互作用。大鼠体内实验证实，在禁食和胰岛素诱导的低血糖状态下，血浆中HSP70与胰岛素存在共免疫沉淀，且结合在血浆环境中更为显著，表明需要血浆成分参与。进一步的结合分析显示，HSP70与胰岛素的亲和力极高，解离常数K_d约为2.80 pM，半抑制浓度IC₅₀为0.91 pM。这些结果证明，HSP70在血浆中能以高亲和力结合胰岛素。

2.2. 热休克促进热处理后12小时的葡萄糖不耐受，但改善长达24小时的胰岛素敏感性

对禁食和摄食大鼠进行热休克处理后，在ipGTT中发现，热休克显著升高了血糖峰值（30分钟时升高约2.7 mM），此效应在热休克后12小时达到最大，表现为葡萄糖不耐受。然而，在ipITT中，胰岛素敏感性在热休克后12至24小时得到改善。血浆HSP70（尤其是组成型HSP73）水平在热休克后12-24小时达到峰值，并且热休克处理的大鼠在ipGTT期间胰岛素分泌显著增加（胰岛素生成指数升高）。这表明，热休克初期通过某种机制降低了葡萄糖耐受，但随后增强了胰岛素敏感性。

2.3. 热休克诱导的高血糖反应可被抗HSP70单克隆抗体消除，并可被HSP70加HIP联合静脉注射模拟

为了验证HSP70在上述高血糖反应中的作用，研究人员在ipGTT前12小时注射抗HSP70单克隆抗体（mAb），结果完全消除了热休克诱导的血糖峰值升高。单独静脉注射HSP70（无论是139 pM还是5 nM浓度）并不能重现热休克的高血糖效应。然而，对血浆样本的筛查发现，在热休克后大鼠血浆中存在HSP70相互作用蛋白（HIP）。当将HIP与HSP70共同注射时，成功再现了热休克诱导的高血糖反应。计算机模拟进一步显示，HIP的存在增强了HSP70与胰岛素的结合亲和力，并可能改变了胰岛素的结合位点。这首次证明HIP可以在胞外环境中辅助HSP70功能。

2.4. 热休克和HSP70注射损害胰岛素依赖组织的葡萄糖摄取和利用，但不影响胰岛素受体信号传导

利用放射性标记示踪剂的研究表明，热休克处理降低了内脏脂肪组织对葡萄糖的摄取和利用。单独注射HSP70也能重现对脂肪组织葡萄糖摄取的抑制效应，并降低了心脏的葡萄糖利用，但不影响骨骼肌。对ex vivo培养的比目鱼肌研究显示，在接近生理浓度的葡萄糖（5.5 mM）和胰岛素存在下，HSP70可抑制胰岛素的促2-DG摄取作用，但去除胰岛素后此效应消失，表明抑制作用源于HSP70与胰岛素的相互作用。进一步实验提示，HSP70对胰岛素作用的抑制需要血清成分（可能是HIP）和ADP的存在。重要的是，热休克处理并未改变骨骼肌中胰岛素受体的表达或其Tyr972位点的磷酸化水平，表明HSP70的作用机制是通过隔离胰岛素、降低其生物利用度，而非直接干扰受体信号通路。

讨论与结论：

本研究的结果支持一个新的模型：在急性应激（如热休克、运动）下，通过肾上腺素能信号通路释放到血浆中的HSP70，作为一种胞外分子伴侣，以高亲和力结合胰岛素，从而暂时降低胰岛素对靶组织的生物利用度。这导致一过性葡萄糖不耐受，可能是一种在应激状态下防止潜在低血糖的反向调节保护机制。这种相互作用依赖于共伴侣蛋白HIP的存在。该发现挑战了HSP70分子伴侣功能仅限于胞内的传统观点，揭示了其在系统性血糖调节中的新角色。研究人员指出，胞内HSP70具有抗炎和细胞保护作用，而胞外HSP70则常与促炎反应相关。在慢性代谢性疾病中，持续升高的血浆HSP70水平，结合其与胰岛素的结合能力，可能通过减少胰岛素有效浓度和促进炎症，共同加剧胰岛素抵抗和高胰岛素血症，形成恶性循环。因此，针对胞外HSP70（例如使用人源化抗HSP70单克隆抗体）可能成为改善此类疾病代谢结果的新治疗策略。论文最后强调了本研究的局限性，包括未能完全重现血浆环境的复杂性，以及结合动力学和化学计量学的细节有待进一步阐明。总之，这项研究为理解应激反应与代谢调节之间的联系提供了新的视角，并为代谢性疾病的干预开辟了潜在的新途径。

论文结论（翻译）：

总的来说，我们证明HSP70以HIP依赖的方式隔离胰岛素。虽然经典的胞外分子伴侣保护蛋白质免受恶劣的血浆环境影响，但我们的研究结果揭示了HSP70作为血浆分子伴侣的新作用，并首次将HIP鉴定为一种胞外辅助因子。尽管需要进一步的机制研究来阐明HSP70、HIP和其他潜在辅助伴侣的作用，但我们的结果提供了清晰且可重复的证据：联合给予HSP70和HIP可模拟热休克对血糖曲线的影响，并且重要的是，给予抗HSP70单克隆抗体可完全消除热休克诱导的葡萄糖不耐受。此外，我们证明胰岛素与HSP70可相互免疫共沉淀，支持了胰岛素与HSP70之间存在直接且功能相关的相互作用，无论是否存在任何其他未知的特异性机制。再者，据我们所知，这是首次在血浆中检测到HIP的报告，在血浆中它可能与胞外HSP70协同作用。与其已知的细胞内功能一致，HIP可能通过延长底物结合来帮助稳定HSP70-胰岛素复合物，这种可能性将在我们实验室正在进行的机制研究中进一步探索。