封装在多孔聚合物微粒中的金属氧化物纳米颗粒用于调节硫化氢浓度

《Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects》：Metal Oxide Nanoparticles Encapsulated in Porous Polymer Microparticles for Modulation of Hydrogen Sulfide Concentrations

　　Theatin van Leeuwen|Marwan E. Majzoub|Yingzhu Zhou|Nadeem O. Kaakoush|Per B. Zetterlund|Rona Chandrawati
新南威尔士大学（UNSW Sydney）化学工程学院，澳大利亚新南威尔士州悉尼，2052

**摘要**
硫化氢（H2S）是一种重要的气体信号分子，能够调节结肠中的炎症反应，但据报道，其浓度升高会促进结直肠癌的发生和发展。目前用于调节细菌产生的H2S浓度的治疗方法包括亚硫酸铋和抗生素；然而，这些方法存在不良副作用。本研究提出了一种使用聚甲基丙烯酸甲酯/氧化铜（PMMA/CuO）颗粒来降低H2S浓度的方法。通过油包水包水双乳液法合成了封装了CuO纳米颗粒的PMMA微粒，利用了PMMA的生物相容性和CuO对H2S的亲和力。通过调节CuO纳米颗粒的负载量，H2S浓度可以在30分钟内降至生物学上可接受的水平，这一点通过亚甲蓝实验得到了验证。红外等离子体质谱法证实CuO纳米颗粒确实被保留在PMMA微粒内部。PMMA/CuO颗粒具有极低的毒性，并且对由与结直肠癌发病相关的产H2S细菌——福赛杆菌（Fusobacterium nucleatum）产生的H2S具有显著降低效果。这些发现表明，PMMA/CuO微粒是降低结直肠癌等肠道疾病中H2S水平的有希望的候选物质。

**1. 引言**
硫化氢（H2S）是一种气体信号分子，几乎存在于所有人体组织中，其浓度范围从纳摩尔到毫摩尔不等。H2S调节多种生理过程，如新陈代谢和炎症。在适当浓度下，H2S有助于维持健康状态；然而，当其浓度超出正常范围时，会对健康产生不良影响[1]、[2]。在结肠中，健康个体的H2S浓度通常在0.25 μM到3.4 μM之间[3]、[4]。结肠中的H2S既可以通过细胞活动内源性产生，也可以通过摄入含硫食物或细菌途径外源性产生[5]。像福赛杆菌这样的还原硫细菌主要通过酶促途径（例如半胱氨酸代谢）产生H2S[5]。外源性H2S浓度升高与多种肠道疾病相关，包括非炎症性肠道疾病（如小肠细菌过度生长SIBO和肠易激综合症IBS）[5]，以及炎症性肠道疾病（如溃疡性结肠炎UC）[7]、[8]。UC患者由于长期暴露于H2S而出现黏膜损伤[9]，其粪便中的H2S浓度比健康个体高1.5-2倍[11]。研究表明，患有以腹泻为主的IBS（IBS-D）的小鼠体内产H2S的福赛杆菌和脱硫弧菌（Desulfovibrio）数量增加[12]。肠道疾病是结直肠癌（CRC）的风险因素[13]，H2S浓度升高已被证实会促进CRC的进展、转移和化疗耐药性[14]、[15]。在澳大利亚和其他西方国家，CRC是第二大常见癌症[16]、[17]。H2S浓度升高会通过形成有利于更多H2S产生的条件，从而加剧疾病进程[18]，这突显了其作为治疗目标的重要性。

目前降低结肠中过量H2S的治疗方法主要集中在吸附H2S或用抗生素靶向产H2S的细菌。基于吸附的方法，例如使用亚硫酸铋（常见商品名Pepto-Bismol?），已被证明在H2S占比较高的情况下能有效降低H2S浓度[19]。但由于可能存在不良副作用[20]、[21]，这种治疗方法不能连续使用超过两天，因此不适合长期应用。此外，由于这些风险，亚硫酸铋在包括澳大利亚在内的某些国家已被禁用。虽然抗生素可以有效治疗H2S，但它们是非特异性的，会同时消灭有害和有益细菌[22]、[23]。此外，使用抗生素还与5-10年内患CRC的风险增加有关[24]。抑制H2S生物合成途径的抑制剂是另一种潜在方法，但由于毒性高和特异性低，目前尚不可行[25]。饮食调整（如减少富含硫的加工肉类的摄入量）常被推荐作为降低H2S浓度和缓解胃肠道症状的首选或联合策略。尽管从理论上改变饮食看似简单，但在实践中却非常困难。即使CRC得到缓解，患者也很难采纳健康的饮食[26]、[27]。因此，亟需寻找替代解决方案。

为了克服这些挑战，我们提出了一种利用金属氧化物纳米颗粒吸附H2S的新方法。金属氧化物因其与硫化物物种的强化学相互作用而被广泛用于H2S的检测和清除应用。特别是氧化铜（CuO）已被广泛报道可以与H2S反应生成硫化铜（CuS）[28]、[29]、[30]：
(1) CuO + H2S → CuS + H2O
在各种金属氧化物中，CuO表现出较高的H2S捕获亲和力和能力，使其成为H2S去除的有希望的候选材料[31]。然而，由于铜的毒性，直接将CuO纳米颗粒给药给人体并使其在结肠中释放是不可取的[32]、[33]。建议的每日铜摄入量为0.07 mg/kg体重（例如，70公斤成人每天5毫克）[34]，而有效降低H2S浓度所需的浓度可能高出10-20倍，因此直接给药并不合适。为降低这种风险，封装技术提供了一个可行的解决方案，可以防止CuO纳米颗粒的直接接触。聚合物由于其易于合成和多种生物相容性选项（如聚甲基丙烯酸甲酯PMMA）的广泛可用性，成为理想的封装介质。油包水包水（W1/O/W2）双乳液技术可用于制备具有内部孔隙的颗粒。在乳液制备过程中将金属氧化物掺入油相，可将其有效嵌入多孔聚合物网络中。通过添加孔形成剂可以增加内部孔隙的数量和表面孔隙，从而增加可用表面积[35]、[36]。颗粒大小、内部孔隙大小和表面孔隙率可根据乳液参数（如W1与O的比例以及W1/O与W2的比例）及所选孔形成剂进行调整。

在研究层面，特别是在处理涉及纳米颗粒和微粒的聚合物时，采用可持续的做法非常重要，因为这些做法可能对人类健康和环境产生下游影响。据估计，女性和男性每年无意中摄入的微塑料颗粒数量分别为约46,000个和52,000个[37]，这些颗粒已在粪便、人类胎盘甚至大脑中被检测到[38]、[39]、[40]、[41]。废水处理技术的进步提高了对大于27-149 μm聚合物颗粒的捕获效率[42]。当聚合物密度超过1070 kg/m3时，这种效果尤为显著（如PMMA的密度为1170-1200 kg/m3），因此治疗性传递大于150 μm的微粒可能有助于减轻人类和水体的毒性。

本研究提出了一种生物相容、高选择性和可持续的方法，用于吸附由化学供体（硫化钠Na2S）或福赛杆菌产生的H2S。使用低能耗的油包水包水双乳液技术将CuO纳米颗粒封装在多孔PMMA颗粒（PMMA/CuO颗粒）中。通过扫描电子显微镜（SEM）、透射电子显微镜（TEM）和光学显微镜对PMMA/CuO颗粒进行了全面表征，以检查表面形态、孔隙大小和结构；利用激光衍射测量颗粒大小分布，并通过红外等离子体质谱（ICP-MS）测定铜的加载量并评估潜在的泄漏情况。还进行了细胞毒性研究以评估其生物相容性。通过亚甲蓝实验定量确定了CuO纳米颗粒和PMMA/CuO颗粒的H2S吸附能力，并定性评估了福赛杆菌产生的H2S及其被PMMA/CuO颗粒吸附的情况。

**2. 结果与讨论**
**2.1 CuO纳米颗粒对H2S的吸附**
首先，对CuO纳米颗粒及其吸附H2S的能力进行了表征。动态光散射（DLS）显示，水中的CuO纳米颗粒的流体力学直径为256 nm，粒径分布范围为108 nm至661 nm（多分散指数：0.217）（图1）。这一流体力学直径显著大于制造商报告的主要粒径（约50 nm），表明即使经过稀释和超声处理，纳米颗粒在水悬浮液中仍会形成聚集体。纳米颗粒表现出-11.8 ± 1.1 mV的负电荷ζ电位。

CuO纳米颗粒（0 – 350 μg/mL）与H2S（0 – 550 μM）共孵育，使用亚甲蓝实验（一种成熟的H2S检测方法）测量H2S浓度[43]、[44]。该方法允许快速肉眼观察颜色变化，随后通过分光光度法进行定量。在H2S存在下，含有N,N-二甲基-对苯二胺、醋酸锌和氯化铁的亚甲蓝前体溶液会变为蓝色（图2A）。蓝色的强度与H2S浓度相关，从浅蓝逐渐变为深蓝，肉眼容易观察到。吸光度与H2S浓度直接相关，可在670 nm处使用板读数仪进行定量（图S1）。为了确认CuO纳米颗粒确实吸附了H2S，如果H2S被完全吸附，溶液保持粉红色；否则会根据吸附程度呈现不同深浅的蓝色（图2B）。使用硫化钠（Na2S）作为H2S供体，其摩尔浓度与H2S相等。随着CuO纳米颗粒浓度的增加，H2S浓度逐渐降低，350 μg/mL的CuO几乎能立即完全吸附550 μM的H2S（图2C）。相比之下，MgO纳米颗粒没有吸附任何H2S（数据未显示）。人体消化过程通常需要10-59小时[45]、[46]。由于H2S在长时间内不稳定，我们选择2小时时间窗口来评估吸附动力学（图2D）。1、10和50 μg/mL的CuO分别吸附了550 μM H2S的14.8%、72.4%和98.2%。对照组在2小时内H2S仅降低了3.8%（图2D）。

**2.2 通过W/O/W双乳液技术制备颗粒**
为了解决直接将吸附H2S的CuO纳米颗粒给药到结肠的潜在毒性问题，开发了一种封装方法。选择油包水包水（W1/O/W2）双乳液技术来合成多孔PMMA颗粒（图3），因为该技术可以调节颗粒大小和表面孔隙大小。首先将含有碳酸氢钠（孔形成剂）的第一水相（W1）加入含有PMMA、CuO纳米颗粒（在油相中易分散）和二氯甲烷的第二油相（O）中。所得W1/O相在40°C下超声处理10分钟并涡旋30秒，然后立即滴加到含有聚乙烯醇（PVA）作为稳定剂的第三水相（W2）中。该混合物在室温下搅拌2-4小时以使二氯甲烷蒸发。选择微米级颗粒有两个原因：（1）它们不会被肠道吸收；（2）与纳米颗粒相比，它们具有更好的环境可持续性，因为它们足够大，可以被废水处理厂捕获。水包油包水双重乳液PMMA/CuO纳米粒子合成（NPs = 纳米粒子，DCM = 二氯甲烷，W1相中的蓝色圆圈代表孔形成剂，油相中的黑色圆圈代表CuO纳米粒子）。基于文献[35]、[36]中报道的W1/O/W2双重乳液配方用于合成多孔微粒子的方法，我们将我们的配方（表1）调整至21毫升的闪烁玻璃小瓶中。为了确定最佳配方，系统评估了四个参数：（1）W1:O比例，（2）W1/O:W2比例，（3）W2中的PVA浓度，以及（4）W1中的孔形成剂含量。通过SEM和光学显微镜进行了筛选，以评估粒子大小、表面孔径和内部孔网络。最佳配方需要满足以下条件：⑴粒子大小≥100微米，且分布的下限也高于此阈值，以防止系统性吸收并确保在废水处理中的保留；⑵高表面孔隙率，以促进H2S的扩散；⑶明确的内部孔网络，使H2S能够传输到包封的CuO中；⑷粒子机械结构完整，没有塌陷或破碎。

**表1. PMMA粒子合成参数。**

| 配方 | 油（O） | 水1（W1） | 水2（W2） | 加入W2的W1比例（v/v%） | CuO:PMMA比例（w/w%） | PMMA与O的比例（w/v%） | W1中的孔形成剂（mol%） | W2中的PVA（w/v%） |
|--------------|------------------|------------------|------------------|-----------------|------------------|------------------|-------------------|
| 1 | 20 | 30 | 40 | 6.7 | 0.5 | 3.4 | 0.5 | 3.4 |
| 2 | 20 | 30 | 40 | 6.7 | 0.5 | 1.6 | 3.4 | 5.3 |
| 3 | 20 | 30 | 40 | 6.7 | 0.1 | 0.5 | 3.4 |
| 4 | 20 | 30 | 40 | 6.7 | 12.5 | 17.7 | 0.5 | 3.4 |
| 5 | 20 | 30 | 40 | 6.7 | 0.5 | 3.4 | 5.3 |

在配方1中，改变了W1相与油相的体积比（20 v/v%、30 v/v%和40 v/v%）（图S2）。随着W1与油的比例从20 v/v%增加到40 v/v%，粒子形态变差，结构完整性降低，破碎现象增加。40 v/v%的W1:O比例下，粒子表面不光滑，呈现不均匀的卷曲状。表面孔径随着W1:O比例的增加而减小。因此，选择20 v/v%作为最佳W1:O比例。在配方2中，改变了加入W2的W1/O的体积比（1.6 v/v%、3.4 v/v%和5.3 v/v%）（图S3）。1.6 v/v%和3.4 v/v%之间没有明显变化，因此选择3.4 v/v%以最大化粒子产量。5.3 v/v%粒子的SEM图像显示了更多的小粒子簇，乳液的视觉观察呈现乳白色，表明存在小粒子，而大微粒子肉眼可见，表明存在两个不同的粒子尺寸范围。最佳乳液的视觉观察显示，在含CuO的透明溶液中微粒子肉眼可见，在灰色（非乳白色）溶液中微粒子不可见（图S12）。在配方3中，改变了W2中的PVA浓度（0.1 w/v%和0.5 w/v%）（图S4）。0.1 w/v% PVA配方在SEM下显示有更多的100微米大小的粒子；然而，与0.5 w/v% PVA配方相比，乳液的乳白色没有明显增加。因此，选择0.5 w/v% PVA以保持平均粒子尺寸接近500微米，从而增加总体表面积。在配方4中，改变了孔形成剂相对于W1/O的质量（6.7 mol%、12.5 mol%和17.7 mol%）（图S5）。评估了两种产生CO2的孔形成剂，碳酸氢铵和碳酸氢钠（NaHCO3）。也研究了氯化钠作为一种惰性孔形成剂，但在所用条件下它产生的表面孔隙率极低，因此未进一步研究。最初选择碳酸氢铵是因为它在低温（<36°C）下分解，产生CO2，有助于形成多孔网络。然而，碳酸氢铵导致CuO溶解，表现为蓝色溶液，因此在其后的配方中被排除。相比之下，NaHCO3不会导致CuO溶解，CuO在整个处理过程中保持其特有的黑色。尽管NaHCO3通常需要较高温度（80-100°C）进行热分解[47]，但超声波处理（10分钟，40°C） primary W1/O乳液产生了可见的气泡。我们假设超声波处理在较低温度下促进了局部CO2的生成，并且在粒子形成和溶剂蒸发过程中气体释放继续进行。这种产气行为对于产生内部孔隙率和高密度表面孔至关重要。最初选择6.7 mol%的NaHCO3加入W1。尽管这超过了其在W1相中的溶解限度，但超声处理后没有观察到NaHCO3沉淀。进一步增加孔形成剂含量对孔隙或粒子大小没有显著影响。因此，确定6.7 mol%的NaHCO3加入W1是最优的。图5后期讨论了非多孔（0 mol% NaHCO3）和多孔（6.7 mol% NaHCO3）粒子之间的比较。配方5是通过整合配方1-4中确定的最佳参数开发而来的，将每个优化步骤中的最佳条件组合成一个配方。配方5用于所有后续实验。

2.3. PMMA和PMMA/CuO粒子的表征
使用激光衍射分析粒子大小，发现PMMA粒子的平均尺寸为529 ± 23微米，PMMA/CuO（5 wt.% CuO）粒子的平均尺寸为465 ± 25微米（图4A）。PMMA粒子和PMMA/CuO粒子的平均表面孔径分别为1 ± 1.3微米和1 ± 1.2微米（图4B），需要注意的是，由于表面孔径范围从0.1微米到20-30微米，尽管平均值为1微米，标准差较大。添加CuO对孔径没有影响。

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**图4.** A) 使用激光衍射对PMMA和PMMA/CuO（5 wt.% CuO）粒子进行粒子大小表征。D10、D50和D90分别代表第10、50和90百分位数，例如，50%的PMMA粒子小于529.3微米。数据以平均值±标准差的形式呈现。统计分析使用双因素ANOVA进行。B) 使用ImageJ分析SEM图像对PMMA和PMMA/CuO（5 wt.% CuO）粒子的表面孔径进行表征，插图显示了对数x轴上的孔径分布，以便更好地观察整个孔径范围。

使用SEM研究粒子形态和表面孔隙，使用光学显微镜评估内部孔结构（图5和图6）。添加NaHCO3作为孔形成剂导致粒子变大，孔径增加。具体来说，当添加孔形成剂时，平均粒子直径从100微米增加到500微米。未添加孔形成剂的粒子要么没有孔隙，要么孔隙很少（≤2微米），偶尔有亚微米孔隙（约0.5微米）（图5，左下角）。相比之下，含有孔形成剂的粒子大多数都有孔隙，孔径范围在1至5微米之间（图5，右下角）。非多孔PMMA粒子的内部孔结构显示出不均匀的水泡，而多孔PMMA粒子显示出更小且更均匀的孔结构（图5，插图）。

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**图5.** 使用SEM和光学显微镜对PMMA粒子进行表征。插图显示了代表性的非多孔和多孔PMMA粒子，直径分别为117.1微米和110.8微米。选择小于平均尺寸的多孔粒子用于插图光学图像，因为平均尺寸的粒子太大，无法完全放入图像框架内。此外，较大的粒子尺寸限制了孔结构的可视化，因为光线传输不足。

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**图6.** 使用SEM和光学显微镜对含2 wt.%、5 wt.%和9.5 wt.% CuO的PMMA/CuO粒子进行表征。插图显示了代表性的粒子，直径分别为170微米、244微米和264微米（从左到右）。选择小于平均尺寸的粒子用于插图光学图像，因为平均尺寸的粒子太大，无法完全放入图像框架内。此外，较大的粒子尺寸限制了孔结构的可视化，因为光线传输不足。

使用SEM和光学显微镜定性评估不同CuO纳米粒子浓度对PMMA粒子的影响。SEM分析显示，含有2 wt.%、5 wt.%和9.5 wt.% CuO的粒子在形态上没有明显差异（图6）。同样，光学显微镜（插图，图6）显示不同CuO浓度下的多孔内部网络没有显著变化。多孔网络存在于多个焦平面上，表明其在整个粒子中连续存在。尽管PMMA/CuO（9.5 wt.% CuO）粒子的多孔结构没有变化，但观察到大量“碎片”围绕粒子，可能是未包封的CuO聚集体或PMMA/CuO聚集体混合物（图S6）。此外，在所有粒子中都观察到了小的黑色团块。这些在PMMA/CuO（9.5 wt.% CuO）粒子中最为明显，并且与其他wt.%的粒子相比更大（图S7），后来确认为CuO纳米粒子簇（图7）。

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**图7.** A) 纯树脂、B) 非多孔PMMA/CuO（5 wt.% CuO）粒子和C) 多孔PMMA/CuO（5 wt.% CuO）粒子的TEM截面图像。显示了两种放大倍数，一种是5微米尺度的图像（顶部），另一种是更高放大倍数的图像（粒子样本为2微米；树脂为1微米）。在B面板中，深色区域对应于CuO纳米粒子簇；这些簇的放大视图见图S8。

为了评估内部多孔网络的存在，使用TEM观察嵌入树脂中的粒子截面。将多孔PMMA/CuO（5 wt.% CuO）粒子与非多孔PMMA/CuO（5 wt.% CuO）粒子和纯树脂作为对照进行比较（图7）。纯树脂表面光滑（图7A）。与非多孔粒子的光学显微镜图像（图5插图）一致，在5微米尺度的TEM视图中可以看到大水滴的区域（图7B）。有趣的是，在更高放大倍数下（500纳米尺度视图，图S8A）还观察到了直径约为500纳米的较小孔隙区域。这表明超声波处理诱导了广泛的滴液尺寸分布，从500纳米（在TEM中可见）到微米级（在光学显微镜中可见）。多孔粒子的TEM截面更难以解释。根据对多孔粒子的SEM和光学显微镜观察，预计内部存在高度多孔的网络。孔形成剂在粒子形成过程中产生CO2，可能有助于形成SEM中可见的表面孔隙。基于平均表面孔径为1微米，预计内部孔径会更大。TEM图像表明，在2微米尺度图像中孔径可能约为3-4微米。观察到多孔粒子在浸入树脂后变得透明，表明树脂渗透到了内部多孔网络中。这可能掩盖了TEM图像中孔隙的可见性，而非多孔粒子由于缺乏表面孔隙，因此限制了树脂的渗透。

基于TEM截面、光学显微镜和SEM图像的综合分析，似乎粒子具有多孔的内部网络。这一结论基于四个具体观察结果：（1）光学显微镜允许微调焦平面，可以将3D粒子内的不同深度聚焦；由于光线通过粒子多孔网络，观察到了不同深度和孔径的孔隙；（2）由于粒子尺寸较大，SEM制备技术导致粒子被压平或挤压，除了边缘外没有表面裂纹，表明粒子高度多孔；（3）通过SEM放大大的表面孔时，通常可以看到内部更小的孔隙；（4）多孔和非多孔粒子的TEM截面图像显示了不同的内部结构，轮廓可能是被树脂渗透的内部孔隙。

在5微米尺度的非多孔TEM截面（图7B）的左上角和右下角可以看到CuO纳米粒子簇。这表明，在非多孔粒子中，CuO纳米粒子分布不均匀，而是形成局部簇。CuO纳米粒子似乎没有聚集，即它们在簇内分离（图S8B）。这一观察结果与光学显微镜图像一致，其中也观察到整个粒子中的纳米粒子簇（或多孔和非多孔粒子）。通过ICP-MS确定了CuO纳米粒子在PMMA粒子中的包封程度。分析前，粒子用Milli-Q水洗涤两次以去除未包封的CuO。由于它们的大小，微粒子比自由纳米粒子沉降得更快，从而可以去除富含CuO的上清液。铜的质量百分比（y轴）与配方中CuO的质量百分比（x轴）之间的关系在图8中展示，结果显示有23-36%的CuO纳米颗粒被包裹起来，这分别对应于最初加入乳液中的2%、5%和9.5%的CuO（表S1）。假设CuO纳米颗粒浓度的增加会促进聚集，形成更大的聚集体。这一趋势可能解释了包裹效率的变化。在5%的CuO浓度下，由于聚集体的大小较小，可能会导致包裹效率较低。相比之下，在9.5%的CuO浓度下观察到的显著聚集似乎增强了包裹效果。这一趋势与PMMA/CuO（9.5% CuO）颗粒性能下降的现象有关（第2.4节）。下载：下载高分辨率图片（41KB）下载：下载全尺寸图片

图8. 通过ICP-MS测定的含2%、5%和9.5% CuO的PMMA/CuO颗粒中CuO的包裹效率。数据以平均值±标准差（n=3）表示。统计分析使用了普通单因素方差分析（one-way ANOVA），其中ns表示不显著。

SEM-EDS映射确认了PMMA/CuO颗粒中存在铜。考虑到SEM-EDS的深度灵敏度（3-28 μm；计算S1），这意味着分析了颗粒半球体积的大约3.8-32%。在对照组颗粒中没有检测到铜，而在PMMA/CuO（5% CuO）颗粒中检测到了铜（图9）。PMMA/CuO（5% CuO）颗粒的铜图显示了明确的颗粒边界和颗粒内的均匀分布，表明铜有效地嵌入了颗粒中。对照组铜图中的背景噪声（红色点）是EDS的特征，并不表示铜的存在。下载：下载高分辨率图片（416KB）下载：下载全尺寸图片

图9. PMMA颗粒和PMMA/CuO（5% CuO）颗粒的铜的定性SEM-EDS映射。对于每个样本，分别显示了铜元素图、相应的SEM图像和叠加的SEM-EDS图像（从左到右）。相应的光谱可在图S9中找到。SE表示用于表面可视化的二次电子（secondary electrons）。

2.4. 使用Na2S生成的H2S的PMMA/CuO颗粒的H2S吸附能力通过亚甲蓝测定法进行了定量评估。含有5% CuO的颗粒展现出最高的吸附效率，而对照组PMMA颗粒几乎不吸收H2S（图10A）。含有9.5% CuO的颗粒与含有2% CuO的颗粒显示出相似的吸附能力，可能有两个原因：（1）由于CuO纳米颗粒浓度较高，形成的聚集体程度更大；（2）较大的聚集体可能无法完全包裹在颗粒内，或者即使被包裹，其可吸附H2S的表面积也减少了。我们评估了最佳配方在60分钟内的吸附动力学，发现93%的H2S被吸附（图10B）。考虑到颗粒的孔径范围为1–10 μm，可以合理假设H2S能够扩散到颗粒的内部多孔网络中。由于在使用前颗粒已经干燥，因此在早期时间点（0-60分钟）观察到较大的颗粒漂浮，这表明存在内部气穴和初始的表面级吸附。在人体中，H2S通过结肠的传输时间为10-59小时，这比颗粒下沉的8小时时间要长得多，即颗粒几乎达到完全饱和的状态。

图10. A) 在暴露于2毫克PMMA或2毫克PMMA/CuO颗粒后的30分钟内，吸附的H2S（550 μM）百分比。数据以平均值±标准差（n=3）表示。统计分析使用了普通单因素方差分析。B) 2毫克PMMA/CuO（5% CuO）颗粒在0、15、30和60分钟内的H2S吸附动力学。数据以平均值±标准差（n=3）表示。统计分析使用了普通单因素方差分析。C和D) 2毫克PMMA/CuO（5% CuO）颗粒在24小时内的H2S吸附动力学，H2S浓度代表了正常和疾病状态。C)显示了随时间变化的剩余H2S浓度，D)显示了相应的H2S吸附百分比。Na2S被用作H2S的供体。

接下来，我们研究了颗粒的最大吸附能力（图10C&D）。选择了三种H2S浓度（2.5 mM、5 mM和7.5 mM），这些浓度低于和高于健康个体的上限（3.4 mM）[3]、[4]，并考虑了疾病状态下可能的变化。所有H2S浓度在24小时内都达到了完全吸附（100%）（图10D）。有趣的是，吸附速率随着浓度的增加而增加，即颗粒吸附7.5 mM H2S的速率比吸附2.5 mM H2S的速率更快（图10C）。随着H2S浓度的增加，它变得更碱性，使平衡偏向水合HS-而不是气态H2S（有关平衡方程式的详细讨论，请参见第2.5节）。HS-可能与CuO纳米颗粒的相互作用更有效，因为分散性更好，碰撞频率更高。这表明根据个体的H2S浓度，可能需要调整颗粒的剂量。作为对照，合成了PMMA/MgO（5% MgO）并使用与CuO配方相同的程序进行了测试，在60分钟内没有观察到H2S吸附。虽然亚甲蓝测定法证实了H2S的有效去除，但它无法区分物理吸附、表面络合或化学转化（例如CuS的形成）。要确认潜在的机制，需要对颗粒进行反应后的表征；然而，基于CuO与H2S的已知反应性[28]、[29]、[30]，化学转化成CuS被认为是最可能的主要途径。

2.5. 使用F. nucleatum生成的H2S的PMMA/CuO颗粒的H2S吸附

高水平的外源性H2S与非炎症性肠道疾病（如SIBO和IBS）[5]以及炎症性肠道疾病（如UC）[7]、[8]有关。选择F. nucleatum作为关键的硫还原细菌，因为它与多种肠道疾病有关，包括CRC进展、转移和化疗耐药性[14]、以腹泻为主的IBS和以H2S为主的SIBO[5]、[6]以及IBD[7]、[8]。F. nucleatum还因其通过半胱氨酸代谢途径产生大量H2S的能力而被选中[48]、[49]。首先，我们确认了F. nucleatum在L-半胱氨酸存在下会产生H2S。大约6.5×10^7 CFU/mL的F. nucleatum在PBS中与20 mM L-半胱氨酸共培养30分钟后产生了178 μM的H2S，而在没有L-半胱氨酸的情况下未检测到H2S（图11A）。亚甲蓝测定中的粉红色表示没有H2S，而蓝色表示存在H2S（图11B）。这些值与Basic等人的发现[49]的结果成线性关系，他们使用更高浓度的F. nucleatum（约1×10^9 CFU/mL）和相同的20 mM L-半胱氨酸浓度及30分钟培养时间，通过铋检测方法检测到了约3 mM的H2S。确认F. nucleatum产生H2S后，将PMMA/CuO颗粒与上清液一起培养，发现它们在60分钟内吸附了98%的H2S（图11C）。为了评估潜在的细菌干扰，在将颗粒加入之前，先将F. nucleatum与L-半胱氨酸一起培养在（i）去除细菌后的上清液中，或（ii）含有F. nucleatum和L-半胱氨酸的完整悬浮液中。30分钟后，从上清液中共吸附了92.5%的H2S，而当F. nucleatum仍然存在时吸附了80.6%的H2S（图11D），表明对吸附效率有轻微的干扰。虽然F. nucleatum的共同培养实验初步表明细菌细胞可能影响H2S的吸附，但这些测定代表了一个简化的体外模型，并没有捕捉到胃肠道环境的全部生化和微生物复杂性。结肠中含有多样化的微生物群，以及各种代谢物和腔内成分，这些可能进一步调节H2S吸附材料的性能。因此，本研究中估计的有效剂量应被视为体外基线值，而不是体内剂量的预测。未来的工作将包含更复杂的微生物群落、模拟的胃肠道液体和体内模型，以更准确地评估生理相关条件下的吸附效率。我们观察到F. nucleatum在PBS中表现出足够的代谢活性，在30分钟内产生H2S；然而，长时间的培养后代谢活性下降。对照实验确认H2S浓度在15分钟后趋于平稳，30分钟和60分钟时没有显著变化（图S10），表明细菌可能只产生少量的H2S或与颗粒的结合较弱。

图11. A) F. nucleatum在37°C的PBS中与20 mM L-半胱氨酸共培养30分钟后产生的H2S浓度。统计分析使用了普通单因素方差分析。B) 亚甲蓝测定显示了在F. nucleatum培养30分钟后（左）和存在（右）20 mM L-半胱氨酸的情况下颜色变化。C) F. nucleatum在30分钟与L-半胱氨酸共培养后产生的H2S，以及随后与PMMA/CuO（5% CuO）颗粒共培养后的H2S吸附情况。统计分析使用了普通单因素方差分析。D) PMMA/CuO（5% CuO）颗粒在仅含上清液（离心去除F. nucleatum后）或含有F. nucleatum的完整悬浮液中的H2S吸附情况。统计分析使用了非配对t检验（双尾），其中ns表示不显著。在所有图表中，数据以平均值±标准差（n=3）表示。

当使用Na2S作为H2S供体时，亚甲蓝测定在30分钟内产生了强烈的蓝色。相比之下，F. nucleatum生成的H2S在同一时期产生的蓝色非常轻微或没有（吸光度约为0.08vs. 粉红色的对照约为0.04）。探索了三种可能的情景来解释为什么F. nucleatum产生的H2S会导致亚甲蓝颜色发展减弱：（1）WC培养基的干扰；（2）F. nucleatum释放的化合物延迟了颜色发展；（3）F. nucleatum主要释放HS-而不是H2S。首先，我们确认WC培养基确实降低了蓝色的强度，但这只在较长的时间内发生。例如，24小时后，WC培养基中的Na2S颜色从深蓝色显著变为淡蓝色，但在1-2小时内，溶液的深蓝色强度与H2O中的Na2S相似。基于这一观察，我们通过将F. nucleatum立即转移到含有L-半胱氨酸的PBS中来调整方法以启动H2S的产生。尽管方法发生了变化，亚甲蓝的强度保持不变。接下来，我们通过加入不同浓度的Na2S和F. nucleatum（不含L-半胱氨酸）来测试情景（2）是否可能（图S11）。观察到标准的30分钟快速亚甲蓝颜色发展曲线，其梯度与原始校准曲线相似（图S1）。这表明F. nucleatum本身并不分泌抑制亚甲蓝形成的分子，尽管PBS中的代谢活动可能与WC培养基不同。因此，情景（3）似乎最有可能。支持这一点的还有Ang等人的研究[50]，他们发现亚甲蓝只能检测到HS-。当Na2S溶解在水中时，会在H2S(aq) ? HS-(aq) ? S2-(aq)之间形成平衡，其中比例取决于pH值。通过查看[HS-]和[H2S]之间关系的pH曲线[51]，可以观察到在酸性条件下[H2S]倾向于达到100%，在pH 7时[H2S]和[HS-]的比例为50:50，在碱性条件下[H2S]倾向于达到100%。随着浓度的增加，Na2S变得碱性更强，观察到3 mM Na2S的pH约为9，550 μM的pH约为7.5。因此，确定“时间”是需要变化的因素。通过允许H2S在5天内转化为HS-，吸光度从约0.08增加到约0.60，第6天没有进一步变化。包括了适当的对照以确保颜色发展是由于H2S转化为HS-所致。因此，F. nucleatum 很可能主要产生 H2S（无论是气态还是水态），并在几天内通过从气态 H2S 溶解到水态 H2S 和/或从水态 H2S 通过平衡方程式（方程式 2-4）转化为 HS-。（2）H2S (g) → H2S (aq)（3）H2S (aq) ? H+ + HS-（4）HS- ? H+ + S2-由于实验是在密封的 Eppendorf 管中进行的，挥发性的 H2S 被 trapping 并逐渐转化为 HS?，这被亚甲蓝检测到。总之，亚甲蓝颜色的变化是由于 F. nucleatum 产生了气态 H2S，而亚甲蓝对水态 H2S 有反应，因此需要时间将气态 H2S 转化为水态 H2S，从而导致亚甲蓝反应的延迟。

PMMA/CuO 颗粒的生物相容性由于 CuO 纳米颗粒是物理封装而不是化学结合到 PMMA 基质上，预计有一小部分颗粒可能会脱落或发生表面溶解，释放 Cu2? 离子。ICP-MS 可以精确测量溶液中的选定元素/离子。它被用来定量测定 PMMA/CuO 颗粒在72小时内释放的铜离子量，这个时间可能超过了颗粒通过肠道的时间，具体取决于便秘的程度。在这个时间段内，从 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒和清洗两次以去除未封装 CuO 颗粒的颗粒中观察到的 Cu2+ 离子释放量都很少（图 12A）。从2毫克 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒中，24小时后只检测到0.223微克的铜。这些结果表明，在受控的体外条件下，这些颗粒的铜离子释放量很小。然而，在体内，胃肠道的 pH 范围很广（约1.5–7.5），这可能会影响铜离子的释放程度。因此，未来的工作将使用模拟的胃肠道液体在生理相关 pH 条件下评估 Cu2? 的释放情况，并进行体内研究以评估生物分布和铜的排泄。

成人推荐的每日铜摄入量为5毫克。250毫克的 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒预计在24小时内会释放55.8微克的铜离子，仅相当于可耐受上限摄入量的4.5%。然而，铜在结肠癌（CRC）中起着重要作用，与 H2S 一样，铜与 CRC 有着双重关系。低水平的铜可以促进癌细胞的增殖和肿瘤生长、迁移和转移、新陈代谢、血管生成（新血管的形成）和肿瘤发生，这是由于癌细胞的代谢需求。[52]，[53] 相反，高浓度的铜（例如，250–500微摩尔）[54] 可以导致一种称为铜死亡（cuproptosis）的现象，导致 CRC 细胞死亡。[55] 55.8微克的铜离子相当于每250毫克 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒中的878微摩尔，这可能有助于铜死亡的发生。这些计算突显了铜离子释放的治疗潜力，但强调了在动物研究和临床试验中进行彻底评估的必要性。未来的工作还可以研究铜螯合剂（如四硫钼酸或姜黄素[56]）的共递送，以调节铜的生物利用度和安全性。

鉴于其微米级的大小，PMMA/CuO 颗粒很可能会主要通过管腔移动；然而，一些颗粒可能会吸附到黏膜上，从而可能与结肠的上皮层接触，特别是在黏膜受损的情况下，如炎症性肠病（IBD）。为了确保 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒没有细胞毒性，它们与 NIH 3T3 成纤维细胞共同培养了24小时。选择成纤维细胞是因为它们为上皮层和深层组织提供结构支持。此外，成纤维细胞在肠道状况中起着重要作用，可以以有益或有害的方式作出反应。[57] PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒在细胞培养基中培养24小时后再转移到细胞中；随后发现这些颗粒对成纤维细胞没有细胞毒性（图 12B）。使用600纳米的浊度测量来评估 F. nucleatum 在有无 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒存在下的生长情况。在0、15、30和60分钟时使用平板读数仪进行读数。在 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒存在的情况下，F. nucleatum 的浊度在1小时内没有显著变化（图 12C）。最后，F. nucleatum 在室温下与 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒共同培养0、15、30和60分钟，然后在37°C下培养48小时后评估菌落形成情况。与 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒共同培养后，F. nucleatum 的生长没有显著变化（图 12D）。成人推荐的每日铜摄入量为5毫克。250毫克的 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒预计在24小时内会释放55.8微克的铜离子，仅为可耐受上限摄入量的4.5%。然而，铜在 CRC 中起着关键作用，与 H2S 一样，铜与 CRC 有着双重关系。低量的铜可以促进癌细胞的增殖和肿瘤生长、迁移和转移、新陈代谢、血管生成（新血管的形成）和肿瘤发生，这是由于癌细胞的代谢需求。[52]，[53] 相反，高浓度的铜（例如，250–500微摩尔）[54] 可以导致铜死亡（cuproptosis）现象，从而导致 CRC 细胞死亡。[55] 55.8微克的铜离子相当于每250毫克 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒中的878微摩尔，这可能有助于铜死亡的发生。这些计算突显了铜离子释放的治疗潜力，但强调了在动物研究和临床试验中进行彻底评估的必要性。未来的工作还可以研究铜螯合剂的共递送，如四硫钼酸或姜黄素[56]，以调节铜的生物利用度和安全性。

鉴于它们的微米级大小，PMMA/CuO 颗粒很可能会主要通过管腔移动；然而，一些颗粒可能会吸附到黏膜上，从而可能与结肠的上皮层接触，特别是在黏膜受损的情况下，如炎症性肠病（IBD）。为了确保 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒没有细胞毒性，它们与 NIH 3T3 成纤维细胞共同培养了24小时。选择成纤维细胞是因为它们为上皮层和深层组织提供结构支持。此外，成纤维细胞在肠道状况中起着重要作用，可以以有益或有害的方式作出反应。[57] PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒在细胞培养基中培养24小时后再转移到细胞中；随后，发现这些颗粒对成纤维细胞没有细胞毒性（图 12B）。使用600纳米的浊度测量来评估 F. nucleatum 在有无 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒存在下的生长情况。在0、15、30和60分钟时使用平板读数仪进行读数。在 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒存在的情况下，F. nucleatum 的浊度在1小时内没有显著变化（图 12C）。最后，F. nucleatum 在室温下的机械旋转器上与 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒共同培养0、15、30和60分钟，然后在琼脂板上培养。在37°C下培养48小时后评估菌落形成情况。与 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒共同培养后，F. nucleatum 的生长没有显著变化（图 12D）。30分钟时的生长减少可能反映了实验变异性或由微量未封装 CuO 产生的活性氧（ROS）的短暂干扰。[58]，[59] 与之前报道的对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌活性的 PMMA/CuO 复合材料[60]，[61]，[62]不同，本研究开发的 PMMA/CuO 微粒并未显示出对 F. nucleatum 的杀菌效果。这种差异可以归因于 CuO 的结构和掺入方式。在我们的系统中，CuO 纳米颗粒嵌入了大 PMMA 微粒的内部多孔网络中，这一点通过 SEM、TEM 和 ICP-MS得到了证实，导致 Cu2? 的释放量很少，细菌接触自由的 CuO 纳米颗粒的机会也有限。相比之下，文献中报道的抗菌活性[60]，[61]，[62]通常来自暴露在聚合物表面或部分可访问的 CuO 纳米颗粒，使得纳米颗粒与细菌直接接触并产生活性氧。此外，目标微生物 F. nucleatum 是一种厌氧生物，其易感性不同于常用的细菌如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

3. 结论使用 W/O/W 双乳液技术成功合成了 PMMA/CuO 颗粒，得到了平均直径为465微米的颗粒。CuO 纳米颗粒和 PMMA/CuO 颗粒都能够吸附临床相关水平的 H2S，其中 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）被认为是最佳配方。2毫克的 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒在60分钟内吸附了93%的550微摩尔 H2S。在72小时内观察到的 Cu2+ 离子释放量很少，并且 PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒对成纤维细胞没有细胞毒性。使用改进的亚甲蓝方法，确认 F. nucleatum 在与 L-半胱氨酸共同培养30分钟后产生了178微摩尔的 H2S。PMMA/CuO（5 wt.% CuO）颗粒在60分钟内去除了98%的这种细菌产生的 H2S，显示出在生物学相关系统中的强吸附能力。这项工作为未来的工作开辟了多个方向，包括阐明外源性 H2S 对 H2S 主导的肠道状况、CRC 细胞和肠道微生物群的影响机制。虽然本研究中使用的体外条件并没有完全捕捉到胃肠道环境的生理复杂性，但它们提供了一个控制框架，用于表征 PMMA/CuO 微粒的固有 H2S-吸附性能和生物相容性。未来的工作将结合更多生理相关的模型，包括共培养系统、生物膜模型和体内验证，以确认这一平台的转化潜力。从转化角度来看，本研究中使用的制造方法为扩大生产提供了可行的途径，因为 W/O/W 双乳液工艺可以适应试点和工业化规模的生产，并通过适当的参数优化。对于结肠特异性的递送，PMMA/CuO 微粒可以被配制成肠溶涂层胶囊或嵌入到pH响应性聚合物基质中，这些基质设计为在胃和小肠中保持完整，但在结肠中分解。监管考虑因素，包括材料安全性、纳米颗粒表征、释放动力学和潜在的金属离子积累，将是进一步开发和临床转化这一口服聚合物-纳米颗粒平台的核心。总的来说，这些发现突显了 PMMA/CuO 微粒作为结肠中 H2S 吸附的安全有效策略的前景，并为未来的转化研究奠定了基础。

4. 实验方法除非另有说明，所有材料均从 Sigma Aldrich 购买。颗粒合成：PMMA（分子量120,000）、PVA（分子量13,000 – 23,000）、50纳米 CuO 纳米颗粒、MgO（BDH Chemicals Ltd）、NaHCO3 和 DCM。亚甲蓝方法：N,N-二甲基-p-苯撑二胺、Na2S•9H2O、Zn(OAc)2、FeCl3、HCl、HNO3。细胞培养：NIH 3T3 细胞（美国典型培养物收藏（ATCC））、Dulbecco’s Modified Eagle 培养基（Life Technologies）、胎牛血清、L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素（Pen-Strep）和 CCK-8（Abcam）。细菌培养：Wilkins-Chalgren 厌氧菌肉汤（Oxoid）、琼脂（Oxoid）、L-半胱氨酸（98.5%）。TEM表征：Procure 812 树脂（ProSciTech）。多种方法中使用的材料：PBS、超纯 Milli-Q? 水（18.2 M Ω）。4.1. CuO 纳米颗粒的表征使用 Zetasizer Ultra（Malvern, UK；10 mW He-Ne 激光，λ0 = 632.8 nm，θ = 173°）确定 CuO 纳米颗粒的大小和表面电荷。分析之前，CuO 纳米颗粒（40 mg/mL 在 Milli-Q 水中）超声处理10分钟，稀释至最终浓度0.53 mg/mL，再超声处理45分钟。请注意，在这些条件下未能完全分散 CuO 纳米颗粒在水介质中。CuO 溶液立即转移到一次性比色皿（用于尺寸测量）或可重复使用的石英比色皿（用于ζ电位测量）中。所有测量均在室温下进行三次重复，结果为三次运行的平均值。4.2. 通过 W/O/W 双乳液合成非多孔 PMMA 颗粒、多孔 PMMA 颗粒和 PMMA/CuO 颗粒将63.3毫克 PMMA 溶解在1.5毫升 DCM（油相，O）中，加入或不加入2、5或9.5 wt.%的 CuO 纳米颗粒（相对于 PMMA 的质量）。成孔剂碳酸氢钠（NaHCO3）以33.5 w/v%的浓度加入水（水相，W1）中，注意这超过了其溶解限度。通过将0.5 w/v%的 PVA 在80°C的加热板上搅拌约30分钟直至完全溶解，制备大量（例如，500-1000毫升）PVA 溶液（W2），然后存储在室温下。向油相中加入0.3毫升 MilliQ 水以形成初级 W1/O 乳液，涡旋2秒，然后放入超声浴中10分钟，再涡旋30秒，然后立即将0.65毫升逐滴加入大量 W2 相（0.5 w/v% PVA，19毫升）中，该溶液在室温下以300 RPM搅拌。溶剂蒸发大约4小时后完成。颗粒在室温下存储或清洗两次，并在40°C的真空烤箱中干燥过夜，根据实验情况在合成后或干燥后立即使用。关于合成后颗粒的照片，请参见图 S12。4.3. 亚甲蓝测定使用 Xiao 等人[63] 报告的方法作为指导。所有库存材料都是新鲜制备的：1% w/v 的 Zn(OAc)2 在 H2O 中，0.03 M 的 FeCl3 在 1.2 M HCl 中，以及 0.02 M 的 N,N-二甲基-p-苯撑二胺在 7.2 M HCl 中。亚甲蓝前体通过向1.5毫升 Eppendorf 管中加入100微升 Zn(OAc)2，然后加入200微升 FeCl3 和 200微升 N,N-二甲基-p-苯撑二胺来制备。4.3.1. Na2S 校准方法将100微升逐级稀释的 Na2S（550, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 12.5微摩尔）加入含有500微升亚甲蓝前体的 Eppendorf 管中。然后用900微升 PBS 加满溶液，并在 Eppendorf 搅拌器中以22°C，500 RPM混合30分钟。4.3.2. CuO 校准方法将350微克/mL的 CuO 在 MilliQ H2O 中超声处理10分钟，然后进行逐级稀释。然后，将900微升浓度为350、250、200、100、50、25、10、0微克/毫升的CuO（溶解在MilliQ去离子水中）加入100微升浓度为550微摩尔/毫升的Na2S（溶解在PBS中）中，混合物置于1.5毫升的Eppendorf管中，轻轻振荡后以15,000转/分钟的速度离心5分钟。注意不要搅动CuO颗粒，取1毫升上清液加入500微毫升的亚甲蓝前体溶液中，在22摄氏度、500转/分钟的Eppendorf搅拌器中混合30分钟。4.3.3 CuO对H2S的吸附作用：将0、1、10和50微克/毫升的CuO（溶解在MilliQ去离子水中）各900微升加入100微升浓度为550微摩尔/毫升的Na2S中，混合液置于1.5毫升的Eppendorf管中，将管子固定在旋转平台上确保充分混合0、15、30和120分钟后，以15,000转/分钟的速度离心5分钟。注意不要搅动CuO颗粒，取1毫升上清液加入500微毫升的亚甲蓝溶液，在22摄氏度、500转/分钟的Eppendorf搅拌器中混合30分钟。注意：如果将CuO纳米颗粒直接加入PBS（而非MilliQ去离子水中），会导致亚甲蓝前体与CuO/PBS之间发生反应，最终呈现绿色而非蓝色；因此将CuO纳米颗粒加入去离子水中。无论Na2S是溶解在PBS还是去离子水中，其校正曲线均无变化，因此选择使用PBS。4.3.4 PMMA/CuO颗粒对H2S的吸附作用：将2毫克经过两次洗涤的PMMA颗粒或含有2%、5%或9.5% CuO的PMMA/CuO颗粒（溶解在900微升去离子水中）加入100微升浓度为550微摩尔/毫升的Na2S中，混合液置于1.5毫升的Eppendorf管中，置于旋转平台上混合30分钟后，以15,000转/分钟的速度离心5分钟。注意不要搅动颗粒，取1毫升上清液加入500微毫升的亚甲蓝溶液，在22摄氏度、500转/分钟的Eppendorf搅拌器中混合30分钟。4.3.5 亚甲蓝吸光度的测定：将上述每种方法得到的150微升样品转移到96孔板上，在SpectraMax M5微孔板读数仪上于670纳米波长处测定吸光度。4.4 通过激光衍射测定颗粒大小：分别使用Malvern Mastersizer 3000仪器分析19.65毫升的PMMA颗粒和含有5% CuO的PMMA/CuO颗粒的颗粒大小分布，该仪器可测量10纳米至3.5毫米范围内的颗粒大小。样品通过搅拌法注入仪器，使用仪器提供的标准软件记录颗粒大小分布数据（图S13），包括三种颗粒大小百分位数：D10、D50和D90（即D10表示10%的颗粒直径小于该尺寸）。4.5 通过光学显微镜观察颗粒和孔隙：使用移液器将一滴未洗涤的颗粒溶液转移到玻璃载玻片上，并用玻璃盖片覆盖。使用配备AmScope FMA050固定显微镜适配器和AmScope MU1000数码相机的AmScope生物光学显微镜对颗粒进行观察。图像采用AmScope 3.7软件拍摄，放大倍数为10倍、20倍或40倍。4.6 通过扫描电子显微镜（SEM）观察颗粒和孔隙并通过扫描电子显微镜-能量色散光谱（SEM-EDS）分析Cu的分布：分别使用场发射扫描电子显微镜（FEI Nova NanoSEM 230，加速电压为5 kV）和能量色散光谱（EDS，Bruker SDD-EDS）对PMMA/CuO颗粒的表面形态和元素组成进行表征。颗粒通过1毫升塑料移液器滴加到硅片上，过夜干燥后，分别用Leica ACE600溅射仪涂层10纳米铂或15纳米碳（采用EDS方法）。4.7 通过透射电子显微镜（TEM）观察颗粒和孔隙截面：将含有5% CuO的PMMA/CuO颗粒（含或不含孔隙生成剂）2毫克加入Procure 812树脂中，并在60摄氏度下烘烤48小时后进行TEM观察。使用金刚石刀片切割样品制备孔隙截面。4.8 通过ImageJ软件测定孔隙大小：通过手动测量每个可见孔隙的宽度来确定孔隙大小。这种方法被认为是最准确的方法，因为基于面积的测量方法往往无法检测到较小的孔隙或准确捕捉孔隙边缘。在ImageJ软件中分析了PMMA颗粒的三个SEM图像和七个PMMA/CuO（5% CuO）颗粒的图像，每个孔隙的最大直径均被手动测量，结果数据导出到Excel进行分析。PMMA颗粒和PMMA/CuO（5% CuO）颗粒的总孔隙测量值分别为2353个和2255个。4.9 通过ICP-MS测定PMMA/CuO颗粒中CuO的包裹效率：颗粒要么经过两次洗涤，要么保持未洗涤状态。将约5毫升样品置于15毫升试管中，干燥后记录质量。样品用HNO3和HCl在开放的容器中消化，然后通过ICP-MS进行分析。4.10 通过ICP-MS测定PMMA/CuO颗粒中铜的浸出量：新鲜制备的PMMA/CuO（5% CuO）颗粒经离心、洗涤两次后干燥，将2毫克样品加入1.5毫升Eppendorf试管中，再加入1.2毫升PBS。样品在37摄氏度、500转/分钟的条件下振荡8、24、48或72小时，然后通过100微米筛子分离颗粒和浸出液。收集1毫升浸出液并在ICP-MS中进行分析。4.11 Fusobacterium nucleatum的培养：将Fusobacterium nucleatum subsp. nucleatum ATCC 25586菌株在厌氧条件下（37摄氏度、5% CO2环境中）在Wilkins-Chalgren（WC）厌氧培养基中培养18-22小时。通过测量浊度来评估生长情况：将300微升WC培养基（作为对照）和F. nucleatum培养液1:1稀释后的混合液加入孔板中，然后在SpectraMax M5微孔板读数仪上于600纳米波长处测量吸光度，程序振荡5秒后读取数据。生长情况根据Tavares等人的生长曲线（[64]推算得出，其中600纳米处的吸光度与CFU/mL成正比）。4.12 F. nucleatum在L-半胱氨酸中的培养：按照上述方法培养F. nucleatum，并在每次使用前记录浊度。将F. nucleatum在50毫升烧瓶中稀释10倍，以3000 x g离心2分钟，去除上清液后替换为20 mM L-半胱氨酸PBS溶液。细菌在37摄氏度下轻轻振荡培养30分钟。需要注意的是：虽然F. nucleatum不能在PBS中生长，但在L-半胱氨酸/PBS培养基中可以产生足够的H2S。去除WC培养基的原因是它会对亚甲蓝测定产生轻微干扰（导致吸光度降低）。4.13 亚甲蓝测定：无法使用Xiao等人[63]报道的方法，因为添加乙酸锌会导致溶液呈现红色而非蓝色（即使在上清液加入亚甲蓝前体时也是如此，即细菌未直接加入反应体系中）。因此采用了Basic等人[49]提出的稍微修改过的方法。所有试剂均新鲜配制：37毫摩尔FeCl3溶解在6摩尔的HCl中，17.1毫摩尔N,N-二甲基-p-苯二胺溶解在6摩尔的HCl中。亚甲蓝前体的制备方法是向1.5毫升Eppendorf试管中加入90微升FeCl3和90微升N,N-二甲基-p-苯二胺。含有或不含F. nucleatum的试管以3000 x g离心2分钟，然后向前体溶液中加入100微毫升上清液，再加入720微毫升经过高压灭菌的MilliQ去离子水。试管在室温下黑暗环境中机械旋转30分钟，进一步修改试验步骤后，将试管在室温下黑暗环境中放置6天，最后在SpectraMax M5微孔板读数仪上于670纳米波长处测定吸光度。最后，将三份样品各150微升转移到孔板中，并在相同波长处读取吸光度。4.14 使用NIH 3T3细胞评估PMMA/CuO颗粒的生物相容性：根据ISO 10993标准，使用美国类型培养收集中心（ATCC）提供的NIH 3T3细胞（传代次数小于20代）进行生物相容性测试。NIH 3T3细胞在Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Life Technologies）中培养，添加10%（体积比）胎牛血清（FBS，Sigma Aldrich）、0.25毫克/毫升L-谷氨酰胺（Sigma Aldrich）和1%（体积比）青霉素/链霉素（Pen-Strep，Sigma Aldrich）。细胞接近汇合时进行传代培养，以5 × 103细胞/100微升的密度接种到96孔板中，在37摄氏度、5% CO2环境下培养过夜。将经过两次洗涤和干燥的PMMA/CuO颗粒（2毫克）在紫外灯下消毒15分钟后，加入完整的细胞培养基以制备不同浓度（0.5、1和5毫克/毫升）的样品。24小时后收集上清液用于生物相容性分析，然后用100微毫升收集的上清液替换细胞培养基，继续培养24小时。之后吸取上清液，用无菌PBS洗涤细胞以去除死细胞。向每个孔中加入100微升含有10% CCK-8（Abcam）的新鲜细胞培养基，在黑暗环境中培养3小时，最后使用SpectraMax M5微孔板读数仪测定OD值（460纳米波长处），计算细胞存活率：细胞存活率% = (As ? Ac) / (Ap ? Aprep) × 100%，其中As代表实验组的吸光度，Ac代表对照组的吸光度，Aprep代表不含细胞的10% CCK-8 DMEM培养基的空白对照值。所有实验重复三次。4.15 使用F. nucleatum评估PMMA/CuO颗粒的生物相容性：4.15.1 混浊度：按照4.12节的方法培养F. nucleatum，并在PBS中稀释10倍。将1毫升稀释后的F. nucleatum加入含有2毫克PMMA/CuO（5% CuO）颗粒的Eppendorf试管中，另设一个不含颗粒的对照组。试管在旋转平台上旋转15、30或60分钟后，将300微升样品转移到孔板中，立即在程序振荡5秒后于600纳米波长处读取吸光度。重复三次不同培养实验。4.15.2 琼脂培养：按照4.12节的方法培养F. nucleatum，并在PBS中稀释10倍。将1毫升稀释后的F. nucleatum加入含有2毫克PMMA/CuO（5% CuO）颗粒的Eppendorf试管中，另设一个不含颗粒的对照组。试管在旋转平台上旋转15、30或60分钟后，将300微升样品转移到孔板中，立即在程序振荡5秒后于600纳米波长处读取吸光度。重复三次不同培养实验。4.15.3 琼脂培养：按照4.12节的方法培养F. nucleatum，并在PBS中稀释10倍。将1毫升稀释后的F. nucleatum加入含有2毫克PMMA/CuO（5% CuO）颗粒的Eppendorf试管中，另设一个不含颗粒的对照组。试管在旋转平台上旋转15、30或60分钟后，将每个时间的稀释液分别进行10^-1至10^-8的连续稀释，每种稀释度重复四次，每次向每个网格中心加入5微升样品。琼脂板倒置放入厌氧培养箱中，在37摄氏度下培养48小时后进行菌落计数。最佳生长条件为2-20个菌落。4. 统计分析：图11D采用双尾t检验（unpaired t-test）进行分析，图8、10A、10B、11A、11C和12A采用单因素方差分析（ordinary one-way ANOVA）进行分析，图4A、12B、12C和12D采用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行分析。所有分析使用GraphPad Prism v10.4软件完成。作者声明：Theatin负责项目构思、概念化、方法设计、实验实施、初稿撰写、审阅和编辑；Marwan负责方法设计、指导、写作、审阅和编辑；Yingzhu负责方法设计、实验实施、写作、初稿撰写；Nadeem负责方法设计、资源准备、指导、写作、审阅和编辑；Per负责项目构思、概念化、方法设计、资源准备、指导、写作、审阅和编辑；Rona负责项目构思、概念化、方法设计、资源准备、指导、写作、审阅和编辑；CRedI的作者贡献声明：Rona Chandrawati负责写作、审阅与编辑、指导、资源准备、方法设计；Nadeem O. Kaakoush负责写作、审阅与编辑、指导、资源准备、方法设计；Per B. Zetterlund负责写作、审阅与编辑、指导、资源准备、方法设计；Theatin van Leeuwen负责写作、审阅与编辑、初稿撰写、方法设计、实验实施、概念化；Marwan E.Majzoub：写作——撰写与修订、指导、方法论。
Yingzhu Zhou：写作——初稿撰写、方法论、调查。