《ACS Biomaterials Science & Engineering》：Assessment of Bovine Collagen Manufactured via Cellular Agriculture
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细胞农业提供了一种变革性的蛋白质生产方式，能够创造生物衍生的动物源性生物材料替代品。本研究聚焦于通过细胞农业技术生产的牛源胶原蛋白的综合表征。研究人员利用优化用于胶原蛋白生产的牛成纤维细胞系，在定制生物反应器系统中培养以生产胶原蛋白（≥95% I型），经提取、
细胞农业提供了一种变革性的蛋白质生产方式，能够创造生物衍生的动物源性生物材料替代品。本研究聚焦于通过细胞农业技术生产的牛源胶原蛋白的综合表征。研究人员利用优化用于胶原蛋白生产的牛成纤维细胞系，在定制生物反应器系统中培养以生产胶原蛋白（≥95% I型），经提取、纯化、冻干后，重悬于8 mg/mL浓度并在中性pH及37 °C条件下自组装形成纤维状水凝胶（?8 × 4 mm2）。该细胞基（CB）胶原蛋白的功能特性与传统动物源性（AD）牛胶原蛋白进行了基准比对。SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）证实了两者的分子相似性，显示出特征性的α链（～120 kDa）、β二聚体（～240 kDa）和γ三聚体（～300 kDa）。氨基酸分析显示两者谱图几乎一致，差示扫描量热法（DSC）分析强调了它们具有同等的的热稳定性。此外，圆二色谱（CD）光谱证实了CB胶原蛋白三螺旋结构的保留。力学测试表明，CB水凝胶比AD水凝胶具有显著更高的压缩模量和动态模量（分别为1260 ± 191 Pa和6250 ± 1031 Pa vs 890 ± 255 Pa和3134 ± 1857 Pa）（p < 0.05），表明其具有更好的结构完整性和形状保持能力。流变学分析支持了这些发现，CB水凝胶的储能模量（G'）和损耗模量（G''）（分别为48.40 ± 8.5 Pa和13.20 ± 1.3 Pa）高于AD水凝胶（分别为25 ± 2.12 Pa和10 ± 1.58 Pa）（p < 0.05）。表面润湿性测试显示CB和AD胶原蛋白具有相当的亲水性。最后，CB水凝胶的生物相容性通过培养的成纤维细胞密度、活细胞面积和代谢活性在第7天的显著增加得到证实。这项比较评估强调了CB胶原蛋白与传统动物源性来源在功能上的等效性，并为未来优化细胞农业生产系统和针对应用特定要求的凝胶配方提供了关键见解。
该研究发表于《ACS Biomaterials Science》，针对细胞农业生产的胶原蛋白（CB）与传统动物源性胶原蛋白（AD）进行了全面的对比评估。研究背景源于全球对医疗和美容应用所需的高质量蛋白质生物材料的需求增长，而传统的动物源性胶原蛋白面临供应限制、批次间差异以及病原体传播风险等挑战。细胞农业作为一种利用细胞培养技术生产无动物蛋白的互补方法，能够确保蛋白质量和纯度的一致性。尽管微生物发酵常用于重组蛋白生产，但复制全长、具有脯氨酸和赖氨酸羟基化等关键翻译后修饰的三螺旋胶原蛋白仍具挑战性，哺乳动物细胞培养平台则能克服这些限制。然而，文献中缺乏关于CB胶原蛋白是否能准确重现AD胶原蛋白关键特性的比较数据，因此本研究旨在填补这一空白。研究人员通过系统的理化及功能表征，证明了CB胶原蛋白在结构、流变学、力学及细胞生长特性上与AD胶原蛋白具有广泛的等效性，确立了其作为生物医学、食品和化妆品应用中无动物替代品的潜力。
在研究技术方法上，研究人员采用了多项关键技术手段。首先，利用专有的细胞农业技术在定制固定床生物反应器中培养牛皮肤成纤维细胞系以生产胶原蛋白。随后，通过SDS-PAGE分析分子量分布，圆二色谱（CD）验证三螺旋二级结构，氨基酸分析量化生化组成，以及DSC测定热稳定性。在材料表征方面，制备了浓度为8 mg/mL的圆柱形水凝胶，利用流变仪进行振幅扫描以测定储能模量（G'）和损耗模量（G''），通过万能试验机进行非受限压缩测试以确定压缩模量和动态模量，并通过接触角测量评估表面润湿性。最后，利用NIH/3T3成纤维细胞进行为期7天的体外培养，结合Live/Dead assay和alamarBlue（aB）assay评估材料的生物相容性。
研究结果部分详细展示了各项表征数据。在分子组成方面，SDS-PAGE结果显示CB胶原蛋白显示出与AD对照一致的条带模式，包括α1链（～130 kDa）、α2链（～120 kDa）及β、γ多聚体，证实了其天然分子组成的保留。氨基酸组成分析表明，CB和AD胶原蛋白具有几乎相同的氨基酸谱，甘氨酸、脯氨酸和羟脯氨酸最为丰富，符合I型胶原蛋白特征。二级结构分析中，圆二色谱显示CB胶原蛋白具有典型的聚脯氨酸II（PPII）螺旋构象特征峰，表明其三螺旋结构完整。热性能方面，DSC热分析图显示两组样品的起始温度（Tonset）和峰值温度（Tpeak）几乎相同（约150-153 °C），表明CB胶原蛋白保留了与AD胶原蛋白相当的热稳定性。
流变学性能测试显示，CB水凝胶的储能模量（G'）和损耗模量（G''）显著高于AD对照组，且损耗角正切（tan δ）更低，表明其具有更高的弹性和更低能量耗散，结构稳定性更强。力学性能方面，CB水凝胶的压缩模量和动态模量均显著高于AD组，显示出更高的刚度和抗变形能力。表面润湿性测试中，CB胶原蛋白的接触角（35 ± 2°）略低于AD对照（40 ± 3°），表现出更高的亲水性。细胞活力与增殖评估显示，两组水凝胶在7天内均支持细胞存活与增殖，细胞密度、活细胞面积覆盖率和代谢活性均随时间显著增加，虽然CB组在某些指标上统计显著低于AD组，但仍显示出良好的生物相容性。
讨论部分深入分析了上述结果的意义。研究人员指出，CB胶原蛋白在分子、生化、结构和热性能上与AD胶原蛋白高度相似，这归功于哺乳动物细胞平台能够有效复制胶原蛋白的关键生物合成步骤。CB水凝胶表现出的优异流变学和力学性能，使其特别适用于挤出式生物3D打印等生物制造工艺，能够在剪切力下流动并在沉积后恢复形状。尽管CB胶原蛋白的生物相容性指标略低于AD组，但其标准化的生产过程消除了传统来源的批次间变异性和病原体风险，这在长期应用中具有显著优势。结论部分总结道，本研究证明通过细胞农业生产的I型牛胶原蛋白在结构和功能特性上可紧密匹配传统动物源性胶原蛋白，为生物医学、食品和化妆品应用提供了一种受控的无动物生产替代方案。未来的工作应优先通过上游工艺优化来提高材料的固有生物相容性、产量和纯度，并系统地评估生物打印适用性、支架设计、长期稳定性和制造可扩展性，以促进CB胶原蛋白在各行业领域的可靠转化应用。
