高葡萄糖饮食对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）关键生物功能及抵御细菌感染能力的影响

《ACS Omega》：Effects of a High-Glucose Diet on Caenorhabditis elegans Key Biological Functions and Survival to Bacterial Infections

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高葡萄糖饮食的广泛消费和抗菌素耐药性的增加凸显了理解这类饮食如何影响宿主生物及其对细菌病原体的免疫反应的重要性。在这项研究中，我们探讨了高葡萄糖饮食对秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）关键生物功能的影响，以及该线虫在摄入相同饮食后对金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）感染的反应。迄今为止，这是首个提供高葡萄糖饮食与铜绿假单胞菌感染之间关联证据的研究。线虫在L1至L4发育阶段被喂食2%的葡萄糖饮食。结果显示，与对照组相比，高葡萄糖饮食下的线虫排便频率增加、体长延长、后代数量减少、脂滴积累增多、GST-4表达升高，并且ROS和衰老色素的产生也发生变化。此外，高葡萄糖组中多巴胺能神经元受损的比例更高。DAF-16蛋白质的定位未受影响。有趣的是，先前接触过高葡萄糖饮食的线虫在感染金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌后，其生存时间比对照组更长。此外，高葡萄糖饮食还能保护肠道屏障免受铜绿假单胞菌的侵害，并提高免疫缺陷的C. elegans RB1573菌株对铜绿假单胞菌感染的存活率。这些发现表明高葡萄糖饮食对C. elegans的关键生物功能有影响，并显示出其对细菌感染的保护作用。

1. 引言
近几十年来，富含碳水化合物的饮食的消费量激增。这类饮食会增加体内的葡萄糖水平，导致包括昆虫、线虫和哺乳动物在内的多种生物出现代谢紊乱，从而影响其寿命和免疫力。(1?3) 最近一项使用黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的研究发现，高葡萄糖饮食会增加对Providencia rettgeri和Serratia marcescens感染的易感性。(4) 然而，高葡萄糖饮食与细菌感染反应之间的许多方面仍需进一步研究。鉴于抗菌素耐药性的挑战以及富含葡萄糖的饮食的普遍消费，研究高葡萄糖饮食对身体的影响及其如何影响对细菌感染的反应至关重要。深入理解饮食与细菌感染之间的关系可能带来新的预防和治疗策略。(5,6) 秀丽隐杆线虫是非常适合进行这些研究的模型，因为它维护成本低、体积小、生命周期短、能产生大量后代，并且其基因组已完全测序。(7) 此外，这种线虫的神经系统特性明确，而且由于可以构建带有GFP标记的菌株，因此可以观察线虫的神经回路并评估其潜在损伤。(8) 线虫对细菌感染的反应涉及多种保守的细胞信号通路，如p38 MAPK、胰岛素/IGF-1信号通路、DBL-1/TGF-β通路、抗菌肽的产生以及活性氧（ROS）的释放。(9) DAF-16和SKN-1转录因子在防御细菌病原体方面起着重要作用。这两种因子在应激条件下及宿主-病原体相互作用过程中被激活，从细胞质转移到细胞核，诱导先天免疫基因的表达。(10,11) 此外，神经系统通过调节免疫反应来影响线虫对细菌感染的应对。例如，多巴胺能系统可能抑制C. elegans的免疫防御。(12,13) 许多研究利用C. elegans来评估细菌的致病性，因为许多人类病原体也感染线虫，且通常使用相同的致病因子。(14) 铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌因难以治疗而备受关注，尤其在医院环境中，它们被列入世界卫生组织最新的细菌优先病原体名单中。(15) 在C. elegans中，金黄色葡萄球菌感染首先表现为肠道定植，随后导致肠道细胞裂解和全身细胞损伤，最终导致死亡。在铜绿假单胞菌感染中，除了肠道定植外，产生的吡奥维丁等分子还会损害线虫的身体功能，导致细胞损伤和死亡。(16,17) 在线虫中，高糖饮食主要与寿命缩短、繁殖能力下降、学习能力受损和神经退化相关。(3,18?24) 有两项研究直接将细菌感染与葡萄糖饮食联系起来，但在C. elegans中的结果相反。一项研究表明，0.5%的高葡萄糖饮食对沙门氏菌（Salmonella typhimurium）感染的反应有负面影响；另一项研究则表明2%的高葡萄糖饮食对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌（Escherichia coli）感染的反应有积极作用。(25,26) 目前尚未有研究评估铜绿假单胞菌感染与C. elegans中葡萄糖饮食之间的关联。因此，本研究旨在探讨2%高葡萄糖饮食对C. elegans关键生物功能及其对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染反应的影响。高葡萄糖饮食影响了线虫的关键生物功能，包括排便、体长、后代数量和多巴胺能神经元的完整性。高葡萄糖饮食下的线虫脂滴含量增多、GST-4表达升高、ROS产生和衰老色素形成也发生变化。该饮食还保护线虫免受金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌的感染。

2. 结果
2.1. 高葡萄糖饮食对C. elegans关键生物功能的影响
我们测量了喂食高葡萄糖饮食的线虫的每分钟泵送次数（ppm），并与未喂食葡萄糖的对照组线虫进行了比较。喂食高葡萄糖饮食的线虫的咽部泵送频率（274.5 ppm）与对照组（267.3 ppm）没有统计学上的差异，说明高葡萄糖饮食并未影响线虫的摄食行为（图1A）。

图1：高葡萄糖饮食未影响咽部泵送频率，但缩短了排便周期。(A) 喂食对照饮食（Control）的线虫和喂食高葡萄糖饮食（Glucose）的线虫的每分钟咽部泵送次数平均值。(B) 喂食对照饮食（Control）和高葡萄糖饮食（Glucose）的线虫每次排便之间的平均时间（秒）。对于(A, B)，实验进行了七次独立重复（N = 70）。组间（葡萄糖和对照组）的差异使用Student’s t检验进行分析，ns：无显著性，**p: 0.0032。

然而，高葡萄糖饮食影响了线虫的排便周期。喂食葡萄糖的线虫排便周期时间比对照组较短。喂食葡萄糖的线虫每次排便之间的平均时间为35秒，而对照组为40秒（图1B）。由于营养素对线虫的生长至关重要，高葡萄糖饮食可能会影响线虫的体长。在我们的研究中，葡萄糖摄入量导致喂食葡萄糖的线虫体长比对照组长约12%（图2A）。然而，在喂食葡萄糖和对照组食物的线虫之间，体面积没有统计学差异（图2B）。

图2：喂食高葡萄糖饮食的线虫比喂食对照饮食的线虫更长。(A) 喂食高葡萄糖饮食（Glucose）和对照饮食（Control）的线虫的体长平均值（μm）。(B) 喂食高葡萄糖饮食（Glucose）和对照饮食（Control）的线虫的体面积平均值（μm2）。对于(A, B)，实验至少进行了三次独立重复。组间（葡萄糖和对照组）的差异使用Student’s t检验进行分析，**p: 0.0088，ns：无显著性。

此外，高葡萄糖饮食对C. elegans的后代数量有负面影响。我们测量了喂食葡萄糖的线虫直到L4阶段的后代数量，并将其与对照组进行了比较。与对照组相比，高葡萄糖饮食导致后代数量减少了27%（图3）。

图3：高葡萄糖饮食减少了线虫的后代数量。喂食高葡萄糖饮食（Glucose）和对照饮食（Control）的线虫每条虫的平均后代数量。后代数量测定进行了三次独立实验。组间（葡萄糖和对照组）的差异使用Student’s t检验进行分析，*p: 0.0165。

使用带有GFP标签的BY200菌株（图4A），我们分析了喂食高葡萄糖饮食的线虫的多巴胺能神经元，并与喂食对照饮食的线虫进行了比较。我们统计了至少有一种神经元损伤的线虫数量，发现喂食高葡萄糖饮食的线虫中神经元损伤的数量（58.9%）高于喂食对照饮食的线虫（36.7%）（图4B）。

图4：多巴胺能神经元损伤分析。(A) 两组中均存在的无多巴胺能神经元损伤（1和2）和有神经损伤（3–5）的线虫的代表性图像。使用ImageJ软件进行编辑以便更好地可视化。(B) 高葡萄糖饮食组的线虫中有任何类型多巴胺能神经元损伤的比例高于对照组。高葡萄糖饮食后和对照饮食后至少有一种类型多巴胺能神经元损伤的线虫平均百分比。每组（葡萄糖和对照组）分析了三十幅图像，来自三次独立实验。组间（葡萄糖和对照组）的差异使用Student’s t检验进行分析，**p: 0.0075。

2.2. 脂滴含量和GST-4表达
在我们的研究中，我们使用尼罗红（Nile Red）染料测量线虫体内的脂滴含量（图5A）。然后测量了个别线虫体的荧光强度（图5B），并通过CTCF计算考虑了动物的体面积。如图5C所示，喂食高葡萄糖饮食的线虫体内的脂滴含量比正常饮食的线虫更多。

图5：喂食高葡萄糖饮食的线虫体内脂滴含量高于对照饮食的线虫。(A) 用尼罗红染色的C. elegans N2的代表性图像。使用ImageJ软件进行编辑以便更好地可视化。比例尺：275 μm。(B) 用于计算CTCF（线虫积分密度）的个别线虫体的荧光表示。(C) 喂食高葡萄糖饮食（Glucose）和对照饮食（Control）的线虫的脂滴含量。结果以校正面积后的线虫荧光强度（CTCF）表示，并按对照组进行了标准化。进行了四次独立实验（N = 80）。组间（葡萄糖和对照组）的差异使用Student’s t检验进行分析，*p: 0.0138。

GST-4（谷胱甘肽S转移酶4）是参与C. elegans第二阶段解毒的酶。(27) 我们通过荧光强度（图6A,B）量化GST-4基因（gst-4）的表达，采用与脂滴含量（CTCF计算）相同的方法。结果显示，喂食高葡萄糖饮食的线虫中GST-4的表达略有增加（图6C）。

图6：喂食高葡萄糖饮食的线虫比对照饮食的线虫有更高的GST-4荧光表达。(A) 用尼罗红染色的C. elegans CL2166的代表性图像。使用ImageJ软件进行编辑以便更好地可视化。比例尺：275 μm。(B) 用于计算CTCF（线虫积分密度）的个别线虫体的荧光表示。(C) 喂食高葡萄糖饮食（Glucose）和对照饮食（Control）的线虫的GST-4荧光表达。结果以校正面积后的线虫荧光强度（CTCF）表示，并按对照组进行了标准化。进行了三次独立实验（N = 60）。组间（葡萄糖和对照组）的差异使用Student’s t检验进行分析，*p: 0.0421。

2.3. ROS产生和衰老
活性氧（ROS）的产生是氧化应激的重要标志物，也与线虫对病原体的反应有关。(28) 我们使用H2DCFDA测量了喂食高葡萄糖饮食和对照饮食的L4线虫随时间变化的ROS产生情况。最初分析的时间点（0小时和6小时）两组之间没有统计学差异。然而，在后期时间点（24小时和48小时），喂食对照饮食的线虫产生的ROS高于之前喂食高葡萄糖饮食的线虫（图7A）。

图7：喂食高葡萄糖饮食和对照饮食的线虫的ROS产生和衰老评估。(A) 之前喂食高葡萄糖饮食和对照饮食的线虫随时间的ROS产生情况。(B) 随时间变化的荧光蓝色素监测（AGE形成）。对于(A, B)，数据以荧光强度的平均值（±SD）表示。至少进行了四次技术重复实验，来自7次独立实验（N = ～2800）。组间（葡萄糖组与对照组）的差异通过双因素方差分析（two-way ANOVA）进行检测，随后使用Sidak的多重比较测试进行验证。ns：无显著性；*** p：0.0003；**** p < 0.0001；*0.0108。下载高分辨率图片；下载MS PowerPoint幻灯片。

通过监测与晚期糖基化终产物（AGEs）形成相关的蓝色自动荧光蛋白来评估衰老过程。先前喂食两种饮食的线虫显示出相似的AGE形成情况，没有统计学差异。然而，在最后一个评估时间点（48小时），观察到统计学差异：喂食对照饮食的线虫的AGE形成略高于喂食高葡萄糖饮食的线虫（图7B）。

2.4. DAF-16的细胞定位
我们研究了高葡萄糖饮食对转录因子DAF-16核定位的影响，使用了C. elegans TJ356品系（图8A）。研究发现，在高葡萄糖饮食（68.3%）和对照饮食（77%）中，有较高比例的线虫被归类为中间状态。在高葡萄糖饮食的线虫中，26.3%的DAF-16定位于细胞核内，而在对照组线虫中这一比例为3.6%。在高葡萄糖饮食的线虫中，5.3%的DAF-16定位于细胞质内，而在对照组线虫中这一比例为19.3%。然而，当我们将高葡萄糖饮食组与对照组线虫在每个细胞定位方面进行比较时，没有观察到统计学差异（图8B）。

图8. C. elegans TJ356品系在高葡萄糖饮食下DAF-16的细胞定位主要是中间状态。(A) 使用ImageJ软件编辑的DAF-16核定位的代表性图像，以便更好地观察。比例尺：125 μm。(B) 在高葡萄糖饮食（Glucose）和对照饮食（Control）后，DAF-16定位于细胞核、中间状态和细胞质的线虫的平均百分比。每组（葡萄糖组和对照组）分析了20张图像，共三次独立实验（N = 60）。使用双因素方差分析（two-way ANOVA）进行比较，随后使用Sidak的多重比较测试，ns：无显著性。下载高分辨率图片；下载MS PowerPoint幻灯片。

2.5. S. aureus和P. aeruginosa感染
使用液体杀灭实验对线虫进行细菌感染，实验条件与P. aeruginosa和S. aureus感染时使用的相同（M9缓冲液，添加胆固醇和FUDR）。通过GFP标记的E. coli OP50（图9A, 9B）和mCherry标记的P. aeruginosa PA14（图9C和7D）的图像来确认线虫在这些实验条件下的细菌摄取情况。首先使用Kaplan–Meier曲线比较了暴露于未感染对照（E. coli OP50）的线虫与暴露于S. aureus和P. aeruginosa的线虫（图10A–D），以确保两组（葡萄糖组和对照组）都发生了感染过程。

图9. (A, B) 对照饮食喂养的C. elegans摄取GFP标记的E. coli OP50的代表性图像（来自液体生存实验）。(C) 和 (D) 对照饮食喂养的C. elegans感染mCherry标记的P. aeruginosa的代表性图像。(C) 整体线虫图像；(D) 身体中部，显示部分肠道。使用EVOS FL Auto 2成像系统（Thermo Fisher Scientific）拍摄，并使用ImageJ软件编辑。比例尺：125 μm。下载高分辨率图片；下载MS PowerPoint幻灯片。

图10. 2%的高葡萄糖饮食提高了线虫在细菌感染中的生存率。使用Log-rank（Mantel-Cox）和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验比较生存曲线。P值使用Holm-Bonferroni方法进行了多重比较的调整。(A) 对照饮食喂养的线虫感染S. aureus。感染S. aureus的线虫中位生存期为6天，而喂食E. coli OP50的线虫中位生存期为8天。曲线之间的差异具有统计学意义（Log-rank检验和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验；p < 0.0007）。(B) 对照饮食喂养的线虫感染P. aeruginosa。感染P. aeruginosa的线虫中位生存期为6天，而喂食E. coli OP50的线虫中位生存期为8天。曲线之间的差异具有统计学意义（Log-rank检验和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验；p < 0.0007）。(C) 高葡萄糖饮食喂养的线虫感染S. aureus。感染S. aureus的线虫中位生存期为7天，而喂食E. coli OP50的线虫中位生存期为8天。曲线之间的差异具有统计学意义（Log-rank检验和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验；p < 0.0007）。(D) 高葡萄糖饮食喂养的线虫感染P. aeruginosa。感染P. aeruginosa的线虫中位生存期为7天，而喂食E. coli OP50的线虫中位生存期为8天。曲线之间的差异具有统计学意义（Log-rank检验和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验；p < 0.0007）。(E) 高葡萄糖饮食喂养后和对照饮食喂养后感染S. aureus的线虫。高葡萄糖饮食的线虫中位生存期为7天，而对照饮食喂养的线虫中位生存期为6天。曲线之间的差异具有统计学意义；Log-rank检验（p: 0.006）和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验（p: 0.0027）。(F) 高葡萄糖饮食喂养后和对照饮食喂养后感染P. aeruginosa的线虫。高葡萄糖饮食的线虫中位生存期为7天，而对照饮食喂养的线虫中位生存期为6天。曲线之间的差异不具有统计学意义；Log-rank检验（p: 0.0702）和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验（p: 0.0802）。三次独立实验中进行了四次技术重复（N = ～180）。下载高分辨率图片；下载MS PowerPoint幻灯片。

组间比较显示，在感染实验前喂食高葡萄糖饮食的线虫比喂食对照饮食的线虫对两种病原体的抵抗力更强。然而，只有S. aureus感染的比较在经过Holm-Bonferroni校正后具有统计学意义（图10E和8F）。Kaplan–Meier曲线分析表明，喂食对照饮食的感染S. aureus或P. aeruginosa的线虫中位生存期为6天，而喂食高葡萄糖饮食的线虫中位生存期为7天。在实验的最后一天（第9天），两种饮食的S. aureus感染组中仍有约5%的线虫存活，而在P. aeruginosa感染组中，没有线虫存活；喂食葡萄糖饮食的组中仅有约2%的线虫存活。

当我们在S. aureus感染第三天使用erioglaucine评估线虫的肠道屏障功能时（类似通常使用E. coli OP50喂养的情况，图11B），先前喂食高葡萄糖饮食的线虫显示出与喂食对照饮食的线虫相似的肠道泄漏情况（图11C）。然而，在P. aeruginosa感染第三天，先前喂食高葡萄糖饮食的线虫的肠道泄漏情况比先前喂食对照饮食的线虫少（图11D）。

图11. 高葡萄糖饮食保护C. elegans的肠道屏障功能免受P. aeruginosa感染。在感染实验第三天，喂食高葡萄糖饮食或对照饮食的线虫的肠道屏障功能分析。(A) 无泄漏和有泄漏情况的代表性图像；比例尺：200 μm。(B) 喂食E. coli OP50的对照线虫；(C) 感染S. aureus的线虫；(D) 感染P. aeruginosa的线虫。从三次独立实验中抽取每组15条线虫（N = 45）进行拍摄。使用Fisher’s exact检验比较高葡萄糖饮食（Glucose）和对照饮食（Control）组之间的差异。ns：无显著性；*p: 0.0161。下载高分辨率图片；下载MS PowerPoint幻灯片。

此外，我们还使用了缺乏免疫相关基因dod-22（位于DAF-16下游；WBGene00010125）的C. elegans RB1573品系进行了生存实验，该基因与对抗革兰氏阴性细菌的防御有关。当我们将RB1573感染的线虫与N2品系进行比较时，Kaplan–Meier曲线分析显示，在P. aeruginosa感染期间，N2品系的线虫存活时间比RB1573品系的线虫更长，这证实了该基因在抵抗革兰氏阴性病原体中的作用（图12A）。先前喂食高葡萄糖饮食的RB1573线虫比喂食对照饮食的线虫存活时间更长（图12B）。此外，先前喂食高葡萄糖饮食的N2品系线虫也比喂食相同饮食的RB1573品系线虫存活时间更长（图12C）。在感染S. aureus的线虫中，RB1573线虫的存活时间也超过N2线虫（图12D），并且没有观察到先前喂食高葡萄糖饮食的RB1573线虫与喂食对照饮食的RB1573线虫之间的存活差异（图12E）。

图12. 高葡萄糖饮食增强了免疫缺陷型C. elegans RB1573品系感染P. aeruginosa后的存活能力。(A) N2和RB1573（dod-22缺失）品系的线虫被喂食对照饮食并感染P. aeruginosa；(B) 喂食高葡萄糖饮食的RB1573线虫与感染P. aeruginosa后的RB1573线虫进行比较；(C) 喂食高葡萄糖饮食的N2和RB1573线虫感染P. aeruginosa进行比较；(D) N2和RB1573线虫分别感染S. aureus（对照饮食）。(E) 喂食高葡萄糖饮食的RB1573线虫与感染S. aureus后的RB1573线虫进行比较。三次独立实验中进行了四次技术重复（N = ～180）。使用Log-rank（Mantel-Cox）和Gehan–Breslow–Wilcoxon检验比较生存曲线。P值使用Holm-Bonferroni方法进行了多重比较的调整；ns：无显著性；*p: 0.0312；***p: < 0.0004。下载高分辨率图片；下载MS PowerPoint幻灯片。

3. 讨论
尽管已经研究了高葡萄糖饮食对C. elegans的影响，但之前的研究使用了不同的葡萄糖浓度（0.5至8%）和不同的线虫发育阶段（3,18?24），使得直接比较变得具有挑战性。因此，在本研究中，我们使用了C. elegans研究中最常用的葡萄糖浓度之一（2%；110 mM），并让线虫从L1到L4发育阶段都暴露于这种饮食。在高葡萄糖饮食之后，线虫又暴露于S. aureus和P. aeruginosa感染，观察到葡萄糖的的保护作用。

在C. elegans N2 S. aureus感染实验中，先前暴露于高葡萄糖饮食的线虫的生存率显著高于对照饮食喂养的线虫。虽然在P. aeruginosa感染实验中的差异未达到统计学显著性阈值，但观察到了一致的保护效应趋势，高葡萄糖组的生存曲线在质量上优于对照饮食组。重要的是，观察到的中位生存时间一天内的增加代表了显著的生物学变化，考虑到线虫的短暂寿命。此外，Mantel–Haenszel置信区间（1.021–1.761）没有包括1，表明相对风险可能有所降低，从而支持了这种生物学效应的存在。我们的发现进一步证实了先前葡萄糖喂养可以保持肠道完整性，并显著提高了RB1573突变体在P. aeruginosa感染中的存活率，这表明早期葡萄糖暴露增强了对该细菌的抵抗力。

此外，我们还评估了高葡萄糖饮食对C. elegans的关键生物功能的影响，如咽部泵送能力、排便、体形、繁殖能力和神经多巴胺系统。测量每分钟的泵送次数有助于识别不同饮食之间的食物摄入差异。（30）我们没有发现喂食高葡萄糖和对照饮食的线虫在咽部泵送能力上存在统计学差异。这表明高葡萄糖喂养观察到的其他效应并非仅由食物摄入问题引起，尤其是依赖于线虫摄取病原体的细菌感染。然而，在评估排便周期时，观察到喂食高葡萄糖的线虫的排便周期持续时间缩短。排便周期的改变可能会影响线虫的感染模式。（31）虽然无法确认葡萄糖的效应在线虫从葡萄糖培养基转移到生存实验后是否仍然存在，但排便频率的增加可能解释了对照组和喂食葡萄糖组之间存活率的差异，特别是在感染初期。排便频率的增加可能会影响肠道内的细菌定植。

高葡萄糖摄入还影响了另一个关键生物功能——体形。先前的研究也发现喂食葡萄糖的C. elegans的体形存在差异。De Guzman等人（32）给线虫喂食250 mM的葡萄糖，发现在成年线虫的第一天，体长增加了10%（与未喂食葡萄糖的线虫相比）。Alcántar-Fernández等人（3）的研究中，喂食100 mM葡萄糖的L1至L4期线虫比未喂食葡萄糖的线虫更长更粗。高葡萄糖饮食还影响了后代数量。这些结果与Salim和Rajini的研究（33）一致，他们在从卵期到L4期的线虫中使用了相同的葡萄糖浓度，发现卵产数减少了36%。在Morton等人（29）的研究中也发现了繁殖能力下降的现象，其中喂食高葡萄糖（100 mM）的成年蠕虫产卵量平均减少了17%，相比之下，对照组蠕虫的产卵量没有变化。然而，Alcántar-Fernández等人（3）使用L1至L4阶段的蠕虫进行研究时，以及Teshiba等人（34）使用L4阶段蠕虫进行研究时，并未观察到喂食葡萄糖（100 mM）的蠕虫产卵量减少。秀丽隐杆线虫的神经系统控制着其体内的各种生物功能，包括免疫反应。多种神经递质通路，如乙酰胆碱、章鱼胺和多巴胺，参与肠道对细菌病原体的防御。（35,36）我们观察到高葡萄糖饮食增加了表现出神经元损伤的蠕虫比例。De Guzman等人（32）通过分析荧光强度的损失也发现了喂食高葡萄糖饮食的成年蠕虫中神经元退化的证据。不过，他们使用的是更高的葡萄糖浓度（250 mM）。在Pinkas等人（22）的研究中，喂食400 mM葡萄糖的晚期L4阶段蠕虫的荧光信号减少了40%。有趣的是，Morton等人（29）发现喂食葡萄糖（100 mM）的成年蠕虫并未出现神经元退化现象。此外，根据Cao和Aballay（13）的研究，多巴胺信号可以通过调节p38 MAP激酶活性来控制免疫。研究表明，多巴胺能神经元可以调节秀丽隐杆线虫对铜绿假单胞菌的反应，并且其缺失会使蠕虫对铜绿假单胞菌更具抵抗力。因此，在我们的研究中，超过一半喂食葡萄糖的蠕虫的多巴胺能神经元受到了损伤。在暴露于铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌后，可以假设多巴胺信号可能有助于蠕虫对这些病原体具有更强的耐受性，相比之下，对照组的多巴胺能神经元损伤较少。

考虑到高葡萄糖饮食引起的机体变化可能会影响蠕虫对铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌感染的耐受性，我们进一步研究了高葡萄糖饮食导致的脂滴丰度和氧化应激反应。由于秀丽隐杆线虫没有脂肪组织，高葡萄糖饮食引起的多余能量可以以脂滴的形式储存在肠道和皮下组织细胞中。（37）在病原体感染期间，蠕虫的整体代谢会发生变化以应对病原体造成的损伤，包括脂质的重新分配。（38）我们发现喂食高葡萄糖饮食的蠕虫的脂滴丰度高于对照组蠕虫。因此，当蠕虫被金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染时，那些之前喂食高葡萄糖饮食的蠕虫拥有更多的脂质资源来应对病原体损伤，从而比对照组蠕虫存活时间更长。在病原体感染过程中，秀丽隐杆线虫会产生ROS作为其先天防御反应的一部分。然而，病原体引起的细胞损伤也会促进ROS的生成。（28）因此，诱导抗氧化酶的产生对于维持氧化还原平衡和保护蠕虫免受感染至关重要。在本研究中，我们观察到喂食高葡萄糖饮食的蠕虫中gst-4的表达量高于对照组蠕虫。我们推测这里观察到的gst-4表达增加可能有助于减轻与细菌感染相关的ROS生成。在评估随时间变化的ROS生成情况时，早期时间点（0小时和6小时）喂食高葡萄糖饮食的蠕虫与对照组蠕虫之间没有统计学上的显著差异。然而，在24小时和48小时时，喂食高葡萄糖饮食的蠕虫的ROS水平显著低于对照组蠕虫。这些发现与大多数研究高葡萄糖饮食的结果不同，后者通常报告ROS生成增加。（39?41）尽管如此，Wang等人（42）证明了葡萄糖可以抑制ROS生成和SKN-1活性，而Morton等人（29）则报告葡萄糖对成年蠕虫具有保护作用。转录因子SKN-1（哺乳动物转录因子Nrf2的蠕虫同源物）在秀丽隐杆线虫的应激反应中起核心作用，包括对病原体的抵抗力，并调节gst-4的表达。（11,43）胰岛素/IGF-1信号通路是秀丽隐杆线虫生理的主要调节因子，作为转录因子DAF-16的上游调节因子，胰岛素信号增强会减少DAF-16的核转移。（10）此外，氧化应激可以促进DAF-16的核定位。在本研究中，虽然观察到喂食高葡萄糖饮食的蠕虫的DAF-16核定位略有增加，但喂食高葡萄糖饮食的蠕虫与对照组蠕虫之间没有统计学上的显著差异。这些发现表明，在我们的实验条件下，葡萄糖暴露对氧化应激反应的影响可能不是主要通过DAF-16激活的重大变化来介导的，或者可能涉及更微妙的调节机制。

由于蠕虫在早期发育期间暴露于高葡萄糖饮食，并随后表现出gst-4表达增加和对细菌感染的抵抗力增强，我们可以推断葡萄糖在这种情况下并不直接抑制SKN-1活性。相反，早期接触葡萄糖可能会诱导轻微的代谢应激，从而增强蠕虫应对后续挑战的能力，可能通过促进SKN-1的激活来实现。这种适应性反应可能促进gst-4表达的增加，进而降低ROS水平并提高对细菌感染的抵抗力。此外，虽然我们使用的非致病性对照是大肠杆菌OP50，但它仍可能对蠕虫造成轻微的生理损伤。（44,45）因此，早期对压力的适应性反应可以解释对照组蠕虫中ROS逐渐增加的现象以及后期对照组与之前喂食葡萄糖的蠕虫之间的差异。其他支持应激适应性反应假设的结果包括关于衰老的研究。我们监测了与AGE相关的蓝色色素的形成，AGE是衰老的标志物。先前的研究表明高葡萄糖饮食会促进AGE的形成。（39?41）在我们的研究中，我们发现在48小时时喂食高葡萄糖的蠕虫与对照组蠕虫之间的蓝色色素水平存在差异。对照组蠕虫的色素形成量高于喂食高葡萄糖的蠕虫，这表明即使经过48小时，之前喂食葡萄糖的蠕虫对年龄压力的反应更好。与此假设类似，Tauffenberger等人（46）研究了高葡萄糖饮食对秀丽隐杆线虫寿命的影响，发现早期发育期间的高葡萄糖饮食可以延长寿命，而成年期的高葡萄糖饮食则会缩短寿命。根据Moreno-Arriola等人（47）的研究，ROS已被描述为人类和秀丽隐杆线虫适应性反应的信号分子。总的来说，需要进一步的研究来评估SKN-1表达及其激活调控的免疫效应器，以确认这一提出的机制。此外，这项研究也存在一些局限性，需要加以承认。我们没有在L1幼虫或成年喂食组等早期发育阶段评估氧化应激，这些阶段可能提供有关葡萄糖暴露初始效应和适应性应激反应开始的重要见解。此外，在细菌感染期间没有评估ROS的生成，从而无法直接评估葡萄糖暴露、病原体诱导的氧化应激和宿主防御机制之间的动态相互作用。在未来的研究中解决这些问题将有助于更好地阐明早期葡萄糖暴露在秀丽隐杆线虫的氧化还原调节和免疫反应中的作用。

我们研究中观察到的高葡萄糖饮食后的细菌感染抵抗力与Lavigne等人（25）的报告相似。他们通过进行秀丽隐杆线虫DH26（fer-15 (b26)II；在15°C下可繁殖，在25°C下不育）感染大肠杆菌和金黄色葡萄球菌临床分离株的固体杀灭实验来研究葡萄糖饮食对细菌感染的影响。作者使用了L4阶段的蠕虫并在葡萄糖平板上进行感染实验。尽管实验条件存在差异，这些作者也发现喂食高葡萄糖（2%）的蠕虫对这两种病原体的抵抗力更强。我们使用了液体培养基生存实验，并未观察到在葡萄糖存在的情况下金黄色葡萄球菌的生长，因为蠕虫在实验前已经喂食了葡萄糖。因此，喂食高葡萄糖饮食的蠕虫存活率的增加可能与葡萄糖的吸收效应有关，而非葡萄糖对金黄色葡萄球菌生长的影响。Lavigne等人（25）在daf-16突变体秀丽隐杆线虫中进行感染实验，未观察到其对病原体的敏感性有显著变化。作者将这一发现归因于DAF-16在秀丽隐杆线虫中的功能冗余，表明其他免疫调节因子可能补偿了其缺失。与此假设一致，我们评估了一种缺乏Dod-22的菌株，Dod-22是DAF-16的下游目标。在我们的实验中，缺乏Dod-22的蠕虫对金黄色葡萄球菌感染的敏感性没有增加，事实上，其存活率甚至比N2菌株更好。当RB1573蠕虫之前喂食高葡萄糖饮食时，与对照组蠕虫相比没有统计学上的显著差异。我们推断，其他与DAF-16平行的免疫途径在保护蠕虫免受金黄色葡萄球菌感染方面更为有效。p38 MAP激酶通路和转录因子HLH-30已被描述为在秀丽隐杆线虫抵御金黄色葡萄球菌中起作用的因素，这些通路在葡萄糖喂食后可能会被过度激活。（48）Dod-22基因先前已被认为参与秀丽隐杆线虫对革兰氏阴性病原体的免疫反应。（49）我们的生存实验使用了缺乏Dod-22的RB1573突变体菌株，并将其对铜绿假单胞菌感染的反应与N2菌株进行比较。在标准饮食下，缺乏Dod-22会降低蠕虫在铜绿假单胞菌感染后的存活率，证实了它对宿主防御的贡献。然而，在突变体菌株中，先前葡萄糖暴露的保护作用并未消失，表明葡萄糖对铜绿假单胞菌的保护作用并不完全依赖于这一免疫效应器。这些结果进一步表明，葡萄糖暴露可能通过替代或互补的免疫途径（如p38 MAP激酶通路）来增强宿主抵抗力。（50）尽管结果相似，但我们的研究在高葡萄糖饮食的施用方式上与Lavigne等人不同：他们使用L4阶段的蠕虫进行葡萄糖处理和细菌暴露，而我们则是从L1到L4阶段喂食葡萄糖，然后在没有葡萄糖的情况下进行感染实验。这也与我们和李等人（26）的工作不同。当李等人（26）使用0.5%葡萄糖喂食蠕虫并进行沙门氏菌的固体培养基杀灭实验时，他们观察到喂食葡萄糖的蠕虫对沙门氏菌感染的敏感性更高。作者将此归因于葡萄糖对SKN-1的抑制作用。葡萄糖施用的不同可能是我们关于ROS生成适应性假设讨论的不同点。李等人还在不同的葡萄糖浓度（0.5%）下进行了实验，我们研究的局限性在于没有调查其他葡萄糖浓度对细菌感染反应的影响。此外，当我们评估感染蠕虫的肠道屏障功能时，早在第三天就观察到了不同病原体之间的差异。虽然在金黄色葡萄球菌感染中没有发现差异，但在铜绿假单胞菌感染中，之前喂食高葡萄糖的蠕虫的肠道泄漏较少。尽管我们的发现表明高葡萄糖饮食对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌感染具有保护作用，但高葡萄糖饮食对秀丽隐杆线虫对细菌感染敏感性的影响似乎也取决于感染蠕虫的细菌类型（或种类）。到目前为止，我们的研究是首次研究高葡萄糖饮食对秀丽隐杆线虫感染铜绿假单胞菌的影响。由于我们不能在蠕虫喂食过程中分离出大肠杆菌，因此不能排除这种细菌对观察结果的影响。考虑到大肠杆菌是蠕虫的微生物群的一部分，Kingsley等人（51）试图使用预先用葡萄糖预培养的活细菌来分离微生物群的影响。他们的结果显示寿命缩短、ROS生成增加、gst-4上调、免疫力变化以及对铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌感染的敏感性增加。然而，我们发现很难比较这些细菌检测结果，因为在我们的感染实验中并不使用葡萄糖。总体而言，这项工作提供了新的数据，将饮食与秀丽隐杆线虫（C. elegans）的感染抵抗力联系起来，表明在早期发育过程中高葡萄糖摄入会改变其对细菌感染的抵抗力，这表明宿主的代谢状态可以调节先天免疫反应。秀丽隐杆线虫的关键代谢和先天免疫途径在进化过程中高度保守，其应激反应程序在哺乳动物中具有很强的功能相似性。(9) 因此，这项研究为未来的研究奠定了基础，特别是关于糖尿病等代谢疾病和感染易感性的哺乳动物系统。因此，进一步研究高葡萄糖饮食对抗细菌病原体的保护作用背后的分子机制对于阐明细胞信号通路和代谢应激的作用至关重要。总之，我们的结果表明，排便周期、多巴胺能神经元健康、脂质代谢和氧化应激反应的变化可以促进秀丽隐杆线虫在摄入葡萄糖后的存活率提高。值得注意的是，迄今为止，这是首次在RB1573品系中模拟金黄色葡萄球菌（S. aureus）和铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）感染的研究，也是首次将高葡萄糖饮食的保护作用与秀丽隐杆线虫中对铜绿假单胞菌的感染联系起来。

4. 方法
4.1. 秀丽隐杆线虫品系和同步化
秀丽隐杆线虫野生型N2 Bristol (dvIs19 [pAF15]gst-4p:GFP:NLS])、TJ356 (zIs356 [daf-16p:daf-16a/b:GFP + rol-6(su1006])、BY200 (Pdat-1::GFP) 和 RB1573 (dod-22 (ok1918) IV) 在含有大肠杆菌OP50的线虫生长培养基（NGM）中培养，培养温度为20°C。(52) 通过使用碱性次氯酸盐溶液（“漂白”）来实现不同发育阶段线虫的同步化。(53)
4.2. 高葡萄糖饮食
高葡萄糖饮食的配制方法参考Alcántar-Fernández等人的研究(3)，将葡萄糖与NGM混合至2%的浓度。培养板上接种活的大肠杆菌OP50。在不含葡萄糖的NGM培养板上培养的线虫作为对照组（对照饮食）。每组约有1000–1500条线虫，从L1发育阶段持续观察到L4阶段。所有后续实验均以L4阶段的线虫开始。
4.3. 咽部泵送率检测
使用EVOS FL Auto 2成像系统（Thermo Fisher Scientific）（10倍放大倍率）视觉观察咽部的泵送动作。通过观察线虫咽部末端的收缩和放松情况，每分钟计数泵送次数三次，然后将这些值的平均值乘以六来估算每分钟的咽部泵送次数。观察和计数工作由两名评估者完成。每组使用十条L4阶段的线虫，共进行七次独立实验（N = 70）。(54)
4.4. 排便周期检测
排便周期是一种从动物后部开始的蠕动收缩，逐渐向前传播并最终排出粪便。测量两次排便周期之间的平均时间（以秒为单位）。观察和记录排便周期的时间由两名评估者完成。每组分析十条线虫，共进行七次独立实验（N = 70）。(55)
4.5. 体长测量
为了测量线虫的体和宽，先将线虫在培养板上清洗至少三次，然后用levamisole（1 mM）使其麻痹，再使用EVOS FL Auto 2成像系统（Thermo Fisher Scientific）显微镜在10倍放大倍率下进行拍照。每组20条线虫的数据在三次独立实验中进行分析（N = 60）。(54)
4.6. 后代数量检测
每组将三条L4阶段的线虫转移到新的NGM培养板上，并每天接种大肠杆菌OP50，直到它们停止产卵。每天计数后代数量。共进行四次独立实验（N = 12）。(56)
4.7. 多巴胺能神经元损伤分析
使用秀丽隐杆线虫BY200 (Pdat-1::GFP)进行多巴胺能神经元分析。(57) 据Bijwadia等人的方法(58)识别多巴胺能神经元损伤。将线虫用M9缓冲液清洗三次，无论是否含有葡萄糖，然后用levamisole（1 mM）使其麻痹，放置在覆盖有盖玻片的显微镜载玻片上，并用EVOS FL Auto 2成像系统（Thermo Fisher Scientific）进行拍照。在40倍放大倍率下拍摄三十张图片，计算每组中有多巴胺能神经元损伤的线虫所占的比例。共进行三次独立实验（N = 90）。
4.8. 脂质滴定量化
脂质滴的定量采用Stuhr等人(59)描述的Nile Red染色方法。先将线虫在培养板上清洗至少三次以去除大肠杆菌OP50。接着，大约200条线虫被固定在40%的异丙醇中，然后用Nile Red溶液染色，最后在暗处孵育2小时。再用M9缓冲液清洗两次后，将10 μL的染色沉淀物放置到显微镜载玻片上并覆盖盖玻片。使用EVOS FL Auto 2成像系统（Thermo Fisher Scientific）在10×放大倍率下拍摄十张图片，并用ImageJ软件进行处理。每组20条线虫的数据在四次独立实验中分别测量（N = 80）。计算校正后的线虫荧光强度（CTCF）：(worm integrated density) ? (background integrated density) / worm area。(54)
4.9. gst-4荧光表达
使用秀丽隐杆线虫CL2166 (dvIs19 [pAF15]gst-4p:GFP:NLS)品系，通过gst-4的表达来评估氧化应激。线虫的清洗和放置方式与第4.7节相同，然后拍摄二十张图片，放大倍率为10倍。使用ImageJ软件对每组20条线虫的数据进行单独分析（N = 60）。gst-4的荧光强度量化方法与第4.8节相同。(59)
4.10. DAF-16细胞定位
为了分析转录因子DAF-16的细胞定位，使用TJ356 (zIs356 [daf-16p:daf-16a/b:GFP + rol-6(su1006])品系。线虫的放置方式与第4.7节相同，图片拍摄放大倍率为20倍。每组二十张图片在三次独立实验中进行分析（N = 60）。根据Guédon等人的方法(60)将DAF-16定位为细胞质、中间区和核区。(60)
4.11. ROS产生和衰老色素监测
将线虫从培养板上清洗出来，每个孔中加入100条线虫到96孔板的深色侧，以避免荧光读数的干扰。向每个孔中加入活的大肠杆菌OP50。为了检测ROS的产生，加入50 mM的2′,7′-二氯二氢荧光素二乙酸盐（H2DCFDA）。(61) 使用Thermo Scientific Varioskan LUX分光光度计每隔5分钟读取一次数据，共持续48小时，激发/发射波长为490–540 nm。为了检测衰老色素，使用Thermo Scientific Varioskan LUX分光光度计每隔5分钟读取一次数据，激发/发射波长为360/435 nm。(62) 对于这两种分析，我们选择了四个时间点：0小时和6小时（此时线虫仍处于L4阶段，便于与其他在同一发育阶段进行的实验联系），以及24小时和48小时（这两个时间点用于推断持久效应及其与细菌感染实验的关联）。对于这两种分析，每组至少进行了四次技术重复实验（N = ～2800）。
4.12. 细菌感染实验
在液体杀伤存活实验中，铜绿假单胞菌UCBPP-PA14和金黄色葡萄球菌ATCC 25904分别在TSB（大豆蛋白胨琼脂培养基）中培养，OD值分别为0.9–1.0和1.0–1.4，然后在37°C下孵育18–24小时。这些培养条件可以刺激毒力因子的产生。出于同样的目的，铜绿假单胞菌培养物还在25°C下孵育了24小时。(63) 液体存活实验在96孔板中进行。每组（葡萄糖组和对照组）大约加入10–25条L4阶段的线虫（N2或RB1573），培养板中还含有添加了胆固醇（5 mg/mL）的M9缓冲液。向含有线虫的孔中加入1 μL的铜绿假单胞菌或金黄色葡萄球菌培养物。使用5-Fluoro-2′-脱氧尿苷（FUDR；50 μg/mL）来防止动物后代产生。培养板在25°C下孵育，连续9天计数存活的线虫数量。如果线虫完全不动，则认为其死亡。使用活的大肠杆菌OP50作为两组未感染的对照组。GFP标记的大肠杆菌OP50和mCherry标记的铜绿假单胞菌PA14用于液体实验中的线虫成像，以确认细菌的摄入情况。所有组别共进行了四次技术重复实验（N = ～180）。
4.13. 肠道屏障功能检测
根据Madhu等人(64)描述的方案进行肠道屏障功能检测。该方法使用5%（w/v）的erioglaucine二钠盐溶液（蓝色染料），孵育时间为3小时。这种特定浓度增强了显微镜下的可视化效果，而3小时的孵育时间确保染料有足够的时间扩散到整个肠道或在屏障受损时渗入体腔。因此，将N2感染后的线虫（感染后3天）用M9缓冲液清洗至少三次，然后在erioglaucine和大肠杆菌OP50的混合物中孵育3小时。再次用M9缓冲液清洗三次后，用levamisole（1 mM）使其麻痹，放置在带有盖玻片的显微镜载玻片上，并用EVOS FL Auto 2成像系统（Thermo Fisher Scientific）进行拍照。肠道腔外出现蓝色染料表示肠道完整性受损。将具有这种表型的线虫归类为“泄漏”；肠道腔内没有蓝色染料的线虫归类为“非泄漏”。每组拍摄十五条线虫，并计算泄漏百分比。共进行三次独立实验（N = 45）。
4.14. 统计分析
所有统计分析和图表均使用GraphPad Prism 8.0软件完成。各图表的图例中标识了所使用的统计测试。对于所有测试，P值小于0.05的被认为具有统计学意义。