在新的压力因素下，微藻-细菌颗粒污泥的表现：氧化锌纳米颗粒以及由聚乳酸和聚己内酯制成的可降解微塑料的影响

《ACS ES&T Water》：Microalgal-Bacterial Granular Sludge under Emerging Stressors: Effects of Zinc Oxide Nanoparticles and Degradable Microplastics Derived from Polylactic Acid and Polycaprolactone

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新兴污染物（ECs）如氧化锌纳米粒子（ZnO NPs）和可降解微塑料（DMPs）排放量不断增加，给下一代废水处理技术带来了日益严峻的挑战。本研究探讨了ZnO NPs、聚乳酸（PLA）和聚己内酯（PCL）微塑料对微藻-细菌颗粒污泥（MBGS）的单独影响及其联合效应，这是一种具有前景的低能耗生物技术系统。通过使用光测序批次反应器，在多种暴露情景下监测了胞外聚合物物质（EPS）、叶绿素含量和微生物活性的变化。结果显示出显著的浓度依赖性改变。虽然低剂量暴露（5 mg/L）下的单一污染物对氨氧化或藻类生长仅有轻微促进作用，但联合暴露，尤其是ZnO+PCL和ZnO+PLA+PCL的组合，引发了协同抑制效应。在10 mg/L的浓度下，EPS蛋白组分减少了多达82%；叶绿素含量减少了52%，氨和磷的特定吸收率降低了60%以上。主坐标分析（PCoA）证实了在混合污染物压力下的系统级扰动。这些发现凸显了MBGS对共存污染物的生态脆弱性，并强调了在可持续废水技术的设计和运行中需要针对污染物制定特定策略的必要性。

1. 引言
随着城市化、工业化和人口增长的加速，全球废水产生量显著增加，从而加剧了对高效和可持续处理技术的需求：
(1) 市政和工业废水不仅含有高负荷的有机物、氮和磷，还包含越来越复杂的危险性和监管不足的污染物混合物，这可能降低生物处理效率。
(2) 微藻-细菌颗粒污泥（MBGS）作为一种有前景的下一代废水处理技术，它将光合微藻和异养细菌的代谢优势整合在密集的、自我固化的颗粒中。
(3) 在这种共生系统中，微藻通过光合作用产生氧气以支持细菌对有机底物的氧化，而细菌提供二氧化碳和营养物，从而实现高效的营养物去除，同时减少外部曝气的需求。
(4) 与传统活性污泥（AS）甚至好氧颗粒污泥（AGS）相比，MBGS具有多个重要优势，包括更低的能量需求、更好的生物质分离效果、更高的营养物去除潜力，以及将生物质转化为生物燃料、肥料和生物塑料的可能性。
(5) MBGS颗粒通常具有分层结构，其中好氧外层和无氧或厌氧内层支持碳氧化、硝化、反硝化和磷去除同时进行。
(6) 这种结构的稳定性在很大程度上依赖于胞外聚合物物质（EPS），EPS提供结构凝聚力、调节微生物相互作用，并缓冲环境压力。因此，EPS的破坏与颗粒不稳定性和功能退化密切相关。
(7) 随着先进废水生物技术的发展，人们越来越关注新兴污染物（ECs），包括微塑料（MPs）、纳米粒子（NPs）和抗生素，这些物质现在经常在水环境中和废水处理厂（WWTPs）中被检测到。
(8?11) 其中，MPs和工程化的金属基纳米粒子尤其令人担忧，因为它们不断被引入市政废水中，可以被污泥有效截留，因此可能与MBGS等生物聚集体直接相互作用。对于MBGS系统而言，这一问题尤为重要，因为藻类、细菌和富含EPS的基质的紧密空间耦合创造了多个颗粒吸附、捕获、遮蔽和物理化学扰动的界面。微塑料主要来源于较大塑料材料的破碎或磨损，包括包装废物、一次性消费品、合成纺织品和个人护理产品，并通过生活污水、城市径流和工业排放进入WWTPs。
(12) 报告的废水进水中的浓度通常在0.1至5.6 mg/L之间，尽管在处理过程中70–99%的MPs可能被去除，但仍有相当一部分在污泥基质中富集而非被矿化或消除。
(13) 这种积累对颗粒污泥系统至关重要，因为残留的颗粒可能持续存在于生物质表面或EPS网络中，从而延长与微生物群落的接触时间。最近关于藻类-细菌联合体的研究表明，MPs可以与生物质和有机物形成异质聚集体，改变界面相互作用，产生氧化应激，影响污泥分离行为，这些机制也可能适用于MBGS类型的系统。

(14) 在MPs中，可降解微塑料（DMPs）引起了越来越多的关注，因为它们被越来越多地视为比传统持久性塑料更环保的替代品。
(15) 聚乳酸（PLA）和聚己内酯（PCL）是两种代表性的可降解聚合物，其在包装、农业、医学和消费品领域的生产和应用持续扩大。
(16) 然而，将其归类为“可降解”并不一定意味着在废水条件下对环境无害。这些材料可能会经历部分破碎、表面老化和水解转化，产生微米和纳米级的颗粒及降解副产物，仍可与微生物聚集体相互作用。
(16) 最近的研究表明，可降解塑料仍可能对水生和陆地生物产生不良生物效应，
(17?19) 这表明不能预先假设它们的环境兼容性。最新综述还强调，可降解MPs在废水和污泥处理过程中可能会持续存在，在污泥中积累，并表现出特定于聚合物的环境行为，而不仅仅是表现为均匀的良性替代品。
(20) 从废水生物技术的角度来看，这种区别很重要，因为可降解聚合物不仅在持久性方面与传统MPs不同，还在表面极性、水解行为和副产物化学性质方面存在差异，所有这些都可能影响微生物附着、EPS组成和颗粒-生物质相互作用。

最近的研究也开始阐明MPs如何具体影响MBGS。传统的MPs如聚苯乙烯（PS）、聚乙烯（PE）和聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）在废水系统中仍很普遍，且研究比可降解替代品更为广泛。在MBGS中，1–20 mg/L的PS MPs暴露使化学需氧量（COD）去除效率降低了2.6–4.1%，总磷去除效率降低了2.9–5.8%，同时增加了氧化应激并减少了类似蛋白质的EPS组分。在更高浓度下，PS MPs显著抑制了反硝化作用，减少了69–94%，表明氮转化途径受到严重干扰。
(21) 此外，纳米级的PS颗粒（100 nm）减少了MBGS中的微生物群落丰富度和多样性，尽管刺激的EPS分泌似乎提供了部分适应性保护。
(12) Hou等人进一步表明，MBGS可以对PS微塑料压力表现出适应性反应，包括刺激EPS分泌并在群落丰富度或多样性降低的情况下仍保持85%以上的有机物、氨和磷去除率。更近期，Xiao等人报道了MBGS对不同聚合物的不同反应，显示PS MPs略微抑制了COD和氨氮（NH4+-N）的去除，而聚丁酸磺酸酯（PBS）MPs与污泥系统的兼容性较好，引起了不同的微生物群落变化。这些发现表明，MPs在MBGS中的毒性强烈依赖于聚合物类型、颗粒大小和浓度，即使整体处理性能看似相对稳定，也可能已经发生了重要的亚细胞和结构扰动。

纳米粒子是另一类与MBGS相关的ECs。定义为至少有一个维度小于100 nm的颗粒，它们因其独特的物理化学性质而在消费和工业应用中得到广泛应用。其中，氧化锌纳米粒子（ZnO NPs）是生产量最大的金属氧化物纳米材料之一（全球年产量估计为29,000吨），被用于化妆品、防晒霜、涂料、半导体、食品相关产品和生物医学材料中。
(4,23,24) 因此，ZnO NPs不断排放到市政废水中。基于模型的估计表明，进水浓度范围为24–300 μg/L，随着产量的增加，局部或未来的浓度可能更高。
(25) 与MPs类似，ZnO NPs仅部分通过转化被去除；相反，它们可能在污泥中积累，增加微生物聚集体持续暴露的可能性。它们的潜在毒性与多种机制相关，包括颗粒吸附、光遮蔽、膜损伤、氧化应激和部分Zn2+释放。
(26?28) 重要的是，最近的MBGS研究显著提高了我们对ZnO NP在此系统中行为的理解。Xiao等人（25）表明，10 mg/L的ZnO NPs暴露显著降低了MBGS中的NH4+-N和PO43–-P去除效率，并引发了氧化应激，尽管污泥也表现出部分抗氧化反应，包括超氧化物歧化酶活性增加。在后续的机制研究中，Xiao等人（4）证明超过95%的ZnO NPs被MBGS保留，主要是通过吸附到-OH功能基团和蛋白质样EPS组分上，而少量溶解的Zn2+被释放。这种保留与细胞膜损伤、乳酸脱氢酶（LDH）释放、谷胱甘肽合成抑制以及关键代谢基因（如acs和gln A）的抑制有关。他们进一步表明，ZnO NP在MBGS中的压力不仅限于表面吸附和物理化学保留，还重塑了代谢途径和功能基因表达。

尽管有这些最新进展，现有文献仍主要关注MPs或NPs的单独效应，而废水系统通常接收的是复杂的污染物混合物。MPs和NPs可能在WWTPs中同时存在，在污泥中共同被截留，并通过吸附、共定位或共享毒性途径相互作用，从而可能放大微生物压力。
(13,26,29,30) 此外，MPs可能作为其他污染物的载体或浓度热点，而纳米粒子在聚合物表面的附着可能改变运输行为和生物利用度。最近在废水和污泥系统中的研究表明，可降解MPs可能与其他污染物共存，这种共存可能改变处理过程中的运输、保留和生态毒性行为。
(31) 来自混合应力条件下藻类-细菌联合体的相关证据进一步表明，同时暴露于纳米材料和其他新兴污染物会加剧ROS生成、膜损伤、EPS反应和功能扰动。
(32) 然而，尽管MPs和ZnO NPs的环境进入和单独效应越来越受到重视，但综合研究它们对MBGS的同时影响仍然非常有限。

对于可降解MPs而言，这一知识缺口尤为重要。尽管PLA、PCL和PBS等材料通常被认为比传统塑料更环保，但它们在工程生物系统中的行为仍不够清楚。现有研究表明，它们的效应取决于浓度和聚合物类型。例如，50 mg/L的PCL MPs暴露使总氮去除效率降低了2.0–25.7%，减少了反硝化菌的数量，并抑制了好氧颗粒污泥中的硝酸盐还原酶活性。
(16) 相反，低剂量（5 mg/L）的PLA暴露使EPS分泌增加至64.8 mg/g MLVSS，并保持COD去除效率在88%以上，
(13) 这表明有限暴露可能触发保护性适应而非急性抑制。在MBGS中，PBS MPs被报道可以引起颗粒形态和微生物群落结构的明显变化，但不导致整体营养物去除的显著恶化，
(22) 而我们之前的工作表明，低浓度（≤5 mg/L）的PLA MPs没有引起明显的不利影响，但在50 mg/L时会导致污泥特性和营养物去除性能明显恶化。
(33) 最近的综述同样强调，废水处理中的可降解MPs不能被视为统一或本质安全的类别，因为它们的持久性、破碎性和与污泥基质的相互作用随聚合物化学性质和处理条件而显著变化。
(20) 这些观察表明，可降解MPs不能被简单地视为统一或本质安全的类别；相反，它们的生态风险取决于聚合物化学性质、浓度和与微生物基质的相互作用。

因此，尽管ZnO NPs和可降解MPs的单独效应开始显现，但它们对MBGS的联合影响尚未阐明。这是一个主要缺口，因为MBGS的性能取决于光合作用、EPS完整性、颗粒稳定性和营养物转化微生物群体的协调功能，所有这些都可能同时受到共存颗粒污染物的影响。特别是，PLA和PCL可能与传统MPs不同，具有更高的表面极性、不同的水解行为和酸性降解产物的形成潜力，这可能改变它们与ZnO NPs和MBGS基质的相互作用。因此，本研究旨在评估ZnO纳米粒子以及可降解微塑料PLA和PCL对MBGS性能的单独和联合效应。具体而言，我们评估它们对营养物去除、颗粒结构完整性和微生物活性的影响，并测试联合暴露是否比单一污染物暴露具有更强的抑制作用。通过解决这一差距，该研究为共存新兴颗粒污染物在MBGS中的交互毒性提供了新的见解，并支持了开发更具韧性的废水处理策略。2. 材料与方法2.1. MBGS、ZnO纳米颗粒、PLA和PCL DMP的来源MBGS是在三个实验室规模的光序批量反应器（PSBRs）中开发的，这些反应器使用从匈牙利塞格德的一个市政污水处理厂收集的AS作为种子。初始MLSS为3.5克/升，SVI5为215毫升/克。没有引入外部藻类接种物；相反，藻类种群在反应器运行期间自然出现。通过控制生物质洗脱的方法诱导颗粒化，即每5天将沉淀时间从20分钟逐步缩短到5分钟。大约40天的运行后获得了成熟的、结构稳定的颗粒，这通过其紧凑的形态和改善的沉淀特性得到了证明。包括冻干的AGS和MBGS样本的代表照片以及实验反应器的照片在内的更多视觉信息在支持信息中提供（图S1和S2）。实验中使用的PSBRs的操作参数（每个的有效容积为1.4升）以及合成废水的详细组成（含有150毫克/升的铵氮（NH4+-N）、29毫克/升的磷酸盐磷（PO43–-P）和1100毫克/升的COD）也在支持信息中提供（SI）。PCL和PLA DMPs来自瑞典的Perstorp，其化学结构使用Bruker Vertex 70傅里叶变换红外（FT-IR）光谱仪进行了表征（图S3）。使用Zetasizer Nano仪器进行了动态光散射（DLS）分析，以评估PLA和PCL微塑料的平均水动力直径（Z-average）。测量尺寸范围大约为20–100微米，与早期研究中报告的DMPs相似的尺寸一致。(18) ZnO纳米颗粒（尺寸为40–50纳米（图S4）是按照Asamoah等人的方法合成的。(35) 简而言之，将0.2摩尔的醋酸锌溶解在去离子水中，并在75摄氏度下搅拌。随后，在继续搅拌的同时逐滴加入4摩尔的氢氧化钠（NaOH），持续4小时。形成的白色沉淀物通过10,000克/分钟的离心次数洗涤五次。然后将在80摄氏度下干燥24小时，最后在400摄氏度下煅烧4小时。合成的ZnO纳米颗粒的物理化学特性使用Rigaku Miniflex-II X射线衍射仪（XRD）和Technai G2 20x双透射电子显微镜（TEM）进行了分析，结果详细记录在图S4中。2.2. 实验条件为了确保实验处理之间的可比性，所有试验的初始混合液悬浮固体（MLSS）和5分钟污泥体积指数（SVI5）分别设定为4.1克/升和33.4毫升/克。总共进行了15次实验，包括一个对照组（无污染物），以评估ZnO纳米颗粒、PLA和PCL DMPs的单独和组合效应。应用的污染物类型及其浓度在表1中总结，其中Bioreactor 1是对照组（数据未显示）。基于之前的研究选择了两种浓度，5毫克/升和10毫克/升，这些研究涉及颗粒系统。(16,25,36,37) 较低的浓度（5毫克/升）代表环境相关水平，而10毫克/升则反映了高暴露、最坏情况，这是由于这些新兴污染物的全球产量不断增加所致。表1. 在PSBR实验中应用的ZnO纳米颗粒和PLA及PCL可降解微塑料的浓度添加剂浓度（毫克/升）添加剂浓度（毫克/升）生物反应器ZnOPLAPCL生物反应器ZnOPLAPCL25009100030501001004005110010555012101006505131001070551401010855515101010这些浓度是在正常PSBR运行条件下，按照我们之前的PSBR研究使用的暴露策略，用于研究短期急性（冲击负荷）效应。(38) 暴露期持续24小时，相当于连续六个4小时的操作周期。在实验期间，ZnO纳米颗粒和/或PLA和PCL可降解微塑料在每个周期开始时随进水引入，从而导致重复的脉冲暴露而不是单次给药。PSBRs以4小时的周期运行，包括5分钟的进水、225分钟的反应、5分钟的沉淀和5分钟的出水，体积交换比为50%，表面气体速率为1.2厘米/秒。尽管母反应器通常在12小时光照/12小时黑暗的光周期下运行，但用于暴露实验的污泥是从这些反应器中提取的，在暴露实验期间施加以持续照明（24小时光照，140–160微摩尔/平方米·秒），以促进微藻的活动和生长。为了防止沉淀并确保纳米颗粒和微塑料的均匀分布，在整个实验期间不断混合合成废水。2.3. 污泥性质测定每个实验后，根据《水和废水检验标准方法》(39)分析了污泥特性，包括MLSS、混合液挥发性悬浮固体（MLVSS）和SVI5。24小时暴露期后未观察到MLSS或MLVSS的显著变化，相应数据在支持信息中提供（表S1）。使用Zetasizer Nano仪器（Malvern Instruments，英国）测量了新鲜污泥样本的ζ电位。此外，污泥样本用0.1% NaCl溶液洗涤一次，冷冻干燥，并进行表面和结构分析。通过SEM检查MBGS表面的形态变化。通过能量分散X射线光谱（EDS）分析元素组成，使用FT-IR光谱评估官能团的变化。2.4. 微生物活性测量在含有50毫升来自PSBR系统的MBGS和350毫升合成废水的500毫升Erlenmeyer烧杯中评估了特定氨氧化率（SAOR）、亚硝酸盐氧化率（SNOR）和硝酸盐还原率（SNRR）。使用磁力搅拌器连续搅拌这些混合物。氮源分别作为NH4Cl（60毫克/升NH4+-N）、NaNO2（30毫克/升NO2–-N）和NaNO3（90毫克/升NO3–-N）用于SAOR、SNOR和SNRR的测量。SAOR和SNOR采用曝气，而SNRR测量则使用氮气创建厌氧条件。由于测试时间较短，认为所有测量期间的MLSS是恒定的。SAOR、SNOR和SNRR值是基于NH4+-N、NO2–-N和NO3–-N浓度随时间的下降计算的。(40) 特定磷吸收率（SPUR）按照Panswad等人的方案进行评估。(41) 在厌氧阶段结束时收集污泥样本，用Milli-Q水洗涤并在系统温度下在500毫升Erlenmeyer烧杯中持续搅拌。混合液中添加了醋酸钠（约400毫克/升COD）和磷酸盐（K2HPO4 + KH2PO4），以达到初始磷浓度60毫克/升。定期收集样本并分析磷含量，以根据随时间变化的磷减少率确定SPUR。2.5. EPS和叶绿素的提取和定量从MBGS中分离出细胞外聚合物物质，采用Kedves和Kónya改进的温度辅助提取方法。(42) 通过量化其蛋白质（PN）和多糖（PS）含量来表征EPS的化学组成。多糖使用蒽酮-硫酸法测定，而蛋白质浓度使用针对环境样本优化的Lowry方法修改版测定。为了进行结构表征，EPS样本经过冷冻干燥后进行真空干燥。所得干燥材料与溴化钾（KBr）以1:100的质量比混合。这种混合物被压制成适合红外分析的透明颗粒。使用Bruker Vertex 70光谱仪（分辨率：4厘米–1，每个样本16次扫描）在500–4500厘米–1的光谱窗口内获取FT-IR光谱。为了监测颗粒中的藻类生物量，使用总叶绿素含量作为指标。为此，将100毫升MBGS悬浮液在10,000×g下离心20分钟。弃去上清液，并使用乙醇将颗粒复原到原始体积。悬浮液在80摄氏度下连续搅拌一小时以促进色素提取。孵育后进行第二次离心，然后在663和646纳米波长下对上清液进行分光光度分析。(43) 使用支持信息中提供的标准方程从吸光度数据计算叶绿素浓度。2.6. 其他分析方法和统计分析NH4+-N、NO2–-N、NO3–-N和PO43–-P的浓度按照既定协议使用标准分析程序进行量化。(39) 每个样本重复分析三次以确保结果的可靠性和再现性。为了评估处理组之间的统计差异，进行了单因素方差分析（ANOVA）。通过对ANOVA模型得出的残差进行Shapiro–Wilk（p < 0.05）检验，检查每个因变量的正态性假设。(44) 当检测到显著差异（p < 0.05）时，应用Tukey’s HSD事后检验进行成对比较。所有值以平均值±标准差（n = 3）表示，图中用星号标示统计上显著的差异。为了进一步研究环境变量与单个或组合DMPs和NPs存在之间的关系，使用了主成分分析（PCoA）。变量之间的距离使用欧几里得距离确定。多变量分析包括污染物浓度、叶绿素含量、EPS产生量以及实验过程中观察到的微生物活性的变化。3. 结果与讨论3.1. 污泥表面形态图1展示了MBGS颗粒在暴露于不同组合的DMPs和NPs后的表面形态变化。在对照MBGS样本（图1a）中，颗粒表面均匀覆盖了一层致密的EPS基质，其间散布着促进气体和营养物质扩散到更深颗粒层的明显通道，从而维持最佳的营养循环和去除性能。(45)图1图1. 不同添加可降解微塑料和纳米颗粒的MBGS颗粒表面SEM图像：(a) 对照；(b) 5毫克/升ZnO，(c) PLA，(d) PCL，(e) ZnO+PLA，(f) ZnO+PCL，(g) PLA+PCL，(h) ZnO+PLA+PCL；以及(i) 10毫克/升ZnO，(j) PLA，(k) PCL，(l) ZnO+PLA，(m) ZnO+PCL，(n) PLA+PCL，(o) ZnO+PLA+PCL。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片单独使用5毫克/升ZnO纳米颗粒（图1b）或PLA（图1c）并未引起明显的表面形态变化。然而，PCL暴露（图1d）引发了丝状微生物结构的出现，表明与EPS相关的表面变化，可能反映了微生物群落的重组，正如Shi等人在AGS系统中观察到的PCL暴露情况。(16) 值得注意的是，5毫克/升的ZnO纳米颗粒和PLA的组合在聚合物表面基质中产生了可见的裂纹（图1e）。在ZnO+PCL条件下（图1f），丝状生物与未嵌入EPS的明显微生物群落共存，这意味着表面完整性和EPS的抑制减弱，这可能会损害微生物的保护和凝聚力。相比之下，PLA+PCL混合物（5毫克/升，图1g）也导致了丝状过度生长，同时伴随着可见表面通道的显著减少。这种堵塞暗示了DMPs可能附着在颗粒表面，阻碍了底物和氧气的扩散，可能破坏了反硝化所需的局部厌氧微环境。(46) 最显著的是，三组分混合物（ZnO+PLA+PCL，图1h）导致了保护性EPS层的部分降解，使许多微生物细胞完全暴露，这可能使它们更容易受到环境压力源或有毒物质的影响。(47) 在较高浓度（10毫克/升）下，ZnO、PLA和PCL的单独处理（图1i–k）没有显示出比5毫克/升时更大的变化。然而，二元混合物ZnO+PLA（图1l）和ZnO+PCL（图1m）引起了表面聚合物物质的广泛破坏，暴露了大量球形和杆状细菌。这些形态变化表明表面结构和微生物空间组织的显著重构，最有可能与EPS降解和结构凝聚力的丧失有关。(48) 10毫克/升的PLA+PCL混合物（图1n）同样促进了丝状扩展，在某些部位还导致了EPS的减少。在10毫克/升ZnO+PLA+PCL暴露下（图1o）观察到了最严重的形态退化，EPS基质几乎完全消失，无定形的、不规则的微生物组装占据颗粒表面，表明凝聚力的丧失和潜在的功能破坏。这些形态变化反映了纳米颗粒和可降解微塑料共同作用造成的压力。表面结构的降解表明EPS可能受到破坏，微生物凝聚力减弱，这可能会影响颗粒的稳定性。这些观察结果与先前的研究一致，这些研究表明，微塑料暴露，尤其是与其他压力源（如抗生素或纳米颗粒）结合时，会导致明显的表面降解和颗粒分解。Ji等人(49)报告称，暴露于PS MPs和磺胺甲噁唑的AGS表现出表面粗糙化、微观裂纹和细胞活力降低，这一点通过SEM分析得到了证实。这种表面扰动伴随着EPS（微生物胞外多糖）生产的改变，这可能是微生物保护性反应的一部分。此外，Xiao等人（22）的研究表明，PS微塑料颗粒主要附着在MBGS（微藻-细菌-真菌共生系统）的外表面，而PBS微塑料颗粒则更倾向于嵌入到间隙基质中。这种表面亲和性的差异可以解释我们在研究中观察到的不同程度的损伤，PLA和PCL可能更深入地整合并造成更大的结构扰动。总体而言，这些观察结果强调了即使单个微塑料或纳米颗粒在中等剂量下可能只产生有限的结构影响，但它们的共同作用，尤其是在高浓度下，可以显著破坏EPS的完整性，扰乱微生物的空间组织，并损害如营养物扩散通道等关键结构特征。这突显了共存的纳米塑料和可降解聚合物对MBGS系统的协同毒性潜力。这些发现与最近关于EPS在复合污染物压力下对颗粒稳定性和微生物抗性的研究的见解一致（48），强调了进一步研究废水处理中多污染物相互作用的必要性。

3.2 MBGS的沉降性（SVI5）和ζ电位的变化
ζ电位测量是颗粒污泥系统中颗粒表面电荷和静电稳定性的有用指标。向更负值的转变通常表示颗粒间的排斥力减小，可能增强颗粒聚集；而更负的ζ电位则与颗粒结构的不稳定有关，这是由于静电排斥加强所致（50）。对照组的MBGS初始ζ电位为-17.3 mV，与先前文献中类似颗粒系统的数值一致（51,52）。添加ZnO纳米颗粒后，观察到ζ电位随着浓度的增加而降低。具体来说，添加5 mg/L和10 mg/L的ZnO纳米颗粒后，ζ电位分别降至-11.2 mV和-6.3 mV（图2c,d）。这种效应可以归因于ZnO纳米颗粒本身的正电荷（+8.9 mV），它们很可能吸附到了带负电的颗粒表面，从而中和了表面电荷。这一趋势与颗粒表面静电排斥力的减小一致，并表明有改善聚集的潜在趋势。根据Derjaguin–Landau–Verwey–Overbeek（DLVO）理论，这种吸附可能通过压缩双重电层并减少颗粒间的排斥力来增强污泥的沉降性（51）。然而，相应的SVI5降低幅度相对较小，添加5 mg/L和10 mg/L的ZnO纳米颗粒后，SVI5分别降至31.5 mL/g和30.4 mL/g，而对照组为33.4 mL/g（图2a,b）。

相比之下，单独或与ZnO纳米颗粒联合添加PLA和PCL后，ζ电位值显著变得更负。在DMPs中，PCL的影响更为显著，其ζ电位分别降至-30.5 mV和-34.8 mV。这种变化可以归因于PCL本身的高电负性（-37.4 mV），这意味着它对表面不稳定有显著的静电贡献。相应地，添加5 mg/L和10 mg/L的PCL后，SVI5分别增加到37.1 mL/g和40.8 mL/g，尽管这些变化幅度有限。更负的ζ电位意味着颗粒间的静电排斥力更强，可能会影响聚集并损害结构完整性。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，DMP暴露后颗粒形态发生破坏（图1），这与之前关于聚合物诱导污泥絮体不稳定的研究结果一致（50,53）。在10 mg/L PCL处理下观察到的ζ电位变化较大（3.4 mV），这可能是由于表面相互作用的不均匀性而非分析不确定性造成的。先前的研究表明，微塑料与复杂的生物或胶体表面的相互作用是非均匀的，导致局部电荷修饰和空间上不均匀的静电环境（54,55）。在这种情况下，ζ电位反映了动态且不均匀修饰表面的整体响应，局部吸附和部分表面覆盖可能导致重复实验间的变异性增加（56）。有趣的是，当ZnO纳米颗粒与PLA或PCL共同存在时，ζ电位仍然保持高度负值。这表明DMPs可能包围或涂层了ZnO纳米颗粒，从而防止了带正电的纳米颗粒与带负电的颗粒表面之间的完全电荷中和。这些联合处理下的SVI5值仍然较高（例如36.4–36.7 mL/g），进一步支持了DMPs主导静电行为的结论，即使存在ZnO纳米颗粒也是如此。这些相互作用的最终结果似乎由聚合物的主导表面化学性质决定，从而放大了负表面电荷。尽管如此，SVI5的变化相对较小且在统计学上不显著，表明24小时的暴露时间不足以将表面层面的扰动转化为可测量的整体沉降性下降。换句话说，ζ电位对污染物暴露的反应比SVI5更敏感，而SEM分析显示的局部表面重构尚未发展到颗粒级别的显著沉降失败。这一解释也与现有的MBGS文献一致。在暴露于PS微塑料的MBGS中，Hou等人（12）报告称，尽管形态明显改变、EPS刺激和微生物丰富度/多样性减少，污染物去除率仍然基本稳定，表明适应性反应可以缓解短期的功能衰退。同样，Xiao等人（22）也表明，不同的微塑料可以在MBGS中引起不同的结构和群落级响应，即使整体过程指标没有表现出同样明显的改变。这些研究表明，在短期或中度压力下，MBGS可能首先表现出表面形态、EPS组织和微生物结构的变化，然后这些扰动才完全反映在整体沉降性指标（如SVI5）上。此外，SVI5变化的有限性也可能反映了微塑料与MBGS的相互作用方式：微塑料不仅仅是分散生物质，它们还可以融入微藻-细菌基质中，并在颗粒表面促进不均匀的聚集，正如之前在MBGS中的PS微塑料颗粒中观察到的那样。

总体而言，当前结果表明，ζ电位是对污染物诱导的表面不稳定性更敏感的指标。虽然ZnO纳米颗粒倾向于减少表面电荷的负性，而DMPs，特别是PCL，则使颗粒趋向于更负的静电状态，但这些变化在短期暴露期间仅部分反映在沉降性上。因此，结合ζ电位、SVI5和SEM观察结果的解释表明，这是早期物理化学和形态学扰动，而不是整体沉降性能的完全恶化。

3.3 MBGS表面的化学结构变化
利用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）研究了MBGS在不同污染物暴露后的化学结构和表面官能团的变化。FT-IR光谱显示了五个主要吸收峰（图3）。大约在3400 cm–1和1068 cm–1的峰对应于O–H伸缩振动和C–O–C不对称伸缩振动，分别与有机物质中常见的羟基和醚基相关（51,57）。与原始污泥相比，所有处理条件下这些峰的强度都一致下降，表明ZnO纳米颗粒和DMPs显著改变了MBGS的表面有机基质。此外，1654 cm–1、1547 cm–1和1238 cm–1的吸收峰分别对应于酰胺I（C═O伸缩）、酰胺II（N–H弯曲和C–N伸缩）和酰胺III（C–N伸缩和N–H变形）基团，这些是污泥中蛋白质成分的特征（21,57）。这些峰在暴露于5 mg/L和10 mg/L浓度的ZnO纳米颗粒和DMPs后也显示出强度下降，表明了两种潜在现象：（i）EPS层内蛋白质含量的减少；（ii）表面相关微生物群落（尤其是好氧细菌、真菌和光合微藻）蛋白质结构的构象变化（图3）。

这些发现与先前的研究一致，表明环境压力源如盐度或微塑料可以扰动污泥组成，减少富含蛋白质的部分，并损害污泥颗粒表面的结构完整性和微生物相互作用（51,58）。值得注意的是，研究表明，聚苯乙烯微塑料暴露会抑制色氨酸和酪氨酸类蛋白质的荧光信号，并增加活性氧（ROS）的产生，从而损害藻类-细菌的凝聚力和污泥的稳定性（21）。FT-IR吸收峰对应于关键功能团和酰胺区域的减弱提供了强有力的证据，表明ZnO纳米颗粒和DMPs破坏了MBGS表面的生物化学组成。这些变化可能损害EPS介导的微生物附着和生物活性，最终阻碍好氧营养物的去除。

3.4 叶绿素含量的变化
MBGS中的微藻生物量可以通过叶绿素浓度可靠地估算。因此，测量了总叶绿素含量（叶绿素a和b的总和）（图4）。在对照组污泥中，叶绿素a和叶绿素b的含量分别为5.7 mg/g和9.5 mg/g MLVSS。添加5 mg/L的各种污染物后，叶绿素浓度总体上下降，除了PLA微塑料的情况外，其含量略有增加。这种反应可能可以用PLA的相对较高可降解性来解释，PLA在水解过程中可能释放CO2，从而可能通过光合作用刺激微藻生长（59）。ZnO+PLA和ZnO+PCL组合下的叶绿素a和叶绿素b含量最低，分别为3.8 mg/g和3.7 mg/g MLVSS和6.2 mg/g MLVSS（图4a）。

这些抑制效应与ZnO纳米颗粒和DMPs之间的潜在协同毒性一致，尽管其背后的机制仍具有推测性。可能的解释包括：（i）ZnO纳米颗粒由于在微塑料表面吸附而更接近藻类细胞，促进局部相互作用并可能干扰光合作用（25,48）；（ii）DMP降解导致的酸化，在某些微环境条件下可能促进Zn2+从ZnO纳米颗粒中的释放（60,61）；（iii）由于纳米颗粒与藻类膜紧密关联而加剧的氧化应激，导致活性氧（ROS）的产生和随后的光合机制损伤（4,62）。尽管24小时暴露后的整体pH值没有显示出统计学上的显著变化（表S2），但这可能归因于污泥的巨大缓冲能力（63），这可能掩盖了颗粒表面和微环境中的局部pH梯度。重要的是，先前的研究表明，PCL的酶促和非生物降解可以释放酸性单体和寡聚物，导致周围水相的显著酸化。Wei等人（64）报告称，在PCL水解过程中，pH值从7.2降至约4.0，这是由于含有羧酸的降解产物的积累。这种局部酸化对于金属氧化物纳米颗粒尤为重要，因为降低pH值已被证明可以显著增强金属离子的溶解。在CuO纳米颗粒的情况下，pH值从接近中性降至酸性条件后，Cu2+的释放量增加了20–27倍，这是由于质子促进的溶解和络合反应。尽管本研究中没有直接量化Zn2+的释放和ROS的产生，但这些机制表明，即使没有可测量的整体pH变化，DMP降解引起的局部酸化也可能促进Zn2+从ZnO纳米颗粒中释放，并对观察到的协同抑制效应有所贡献。在这样的环境中，ROS（活性氧）的过度产生是由氧化还原循环、金属离子释放和膜扰动引发的，这导致细菌和藻类细胞中的脂质过氧化和蛋白质氧化。(34) 相比之下，在ZnO+PLA和ZnO+PCL处理中记录到了更高的叶绿素含量，这可能是因为可降解聚合物包裹了ZnO纳米粒子，降低了它们的生物利用度和相关毒性。在较高浓度（10 mg/L）下，所有测试的污染物都显著降低了总叶绿素水平（图4b）。单独使用ZnO纳米粒子导致的下降最为显著，Chl-a和Chl-b分别降至3.6 mg/g MLVSS和5.9 mg/g MLVSS。这可能与纳米粒子在藻类表面的聚集有关，这种聚集可能会产生遮荫效应，从而减少光照的可用性，正如先前的研究所记录的那样。(25,34) 在ZnO+PLA、ZnO+PCL和ZnO+PLA+PCL组合中，叶绿素的减少最为明显，总叶绿素含量分别从15.2 mg/g MLVSS降至8.7 mg/g MLVSS、9.2 mg/g MLVSS和7.3 mg/g MLVSS。除了遮荫效应外，另一种可能的抑制机制是干扰光合作用过程中的质子转移。虽然本研究中没有直接测量，但考虑到两亲性DMP片段可以整合到藻类膜中，扰乱跨膜电位和ATP合酶活性，这种机制是合理的。DMP可能破坏类囊体膜上的电化学梯度，从而抑制微藻中的ATP合成。(22) MBGS系统中的叶绿素含量受添加的微量污染物的类型和浓度的影响显著。虽然低剂量的PLA DMP可能由于释放CO2而刺激藻类生长，但与ZnO纳米粒子的组合常常导致协同毒性，加剧了叶绿素含量的下降。在文献中，这些效应与离子释放、表面吸附相互作用以及光合作用干扰机制有关，包括质子转移的抑制，这些都被认为是观察到的反应的合理原因。这些发现突显了新兴污染物与颗粒污泥系统中微生物光合作用活动之间的复杂相互作用，强调了在废水生物技术中进行综合污染物影响评估的必要性。

3.5. 纳米颗粒（NPs）和DMPs对MBG中氮和磷去除率的影响
为了捕捉MBG对短期暴露的早期功能反应，应用了特定的微生物活性测定作为敏感指标。在这个框架内，通过特定的氮和磷去除率（即SAOR、SNOR、SNRR和SPUR）来评估各种污染物对MBG中微生物活动的影响（图5）。在对照污泥中，SAOR为25.3 mg NH4+-N/(g MLVSS•h)。当暴露于5 mg/L的ZnO、PLA、PCL及其混合物（PLA + PCL）时，SAOR分别增加至28.2、31.0、30.6和31.1 mg NH4+-N/(g MLVSS•h)，表明在低浓度下对氨氧化微生物（AOMs）有促进作用。然而，当ZnO纳米粒子与5 mg/L的DMPs结合时，SAOR显著下降，ZnO+PLA、ZnO+PCL和ZnO+DMPs混合物分别导致减少22.9%、41.2%和29.8%，显示出协同毒性效应。在10 mg/L时，所有组合（包括单独的化合物及其混合物）都表现出明显的抑制作用。ZnO+PLA、ZnO+PCL和ZnO+DMPs分别使SAOR降低了50.7%、67.6%和63.1%，突显了这种抑制作用的浓度依赖性。这些发现与之前报道的PES MPs和TiO2 NPs对AGS的抑制效应一致。(38,66) 此外，叶绿素含量的类似减少（图4）表明AOMs和光合微藻同时受到抑制。尽管这种抑制的机制尚不清楚，但它可能涉及ROS产生的增加或Zn2+在藻类-细菌界面附近的毒性作用。

图5
图5. ZnO纳米颗粒、PLA DMPs和PCL DMPs对MBG代谢活动的影响：(a) SAOR，(b) SNOR，(c) SNRR，(d) SPUR。星号表示统计显著差异（*p < 0.05；双向ANOVA）。
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特定的亚硝酸盐氧化率对污染物的敏感度低于SAOR（图5b）。在5 mg/L的ZnO条件下，没有观察到显著变化（对照组为22.3 mg NO2–-N/(g MLVSS•h），而PLA+PCL和ZnO+PLA+PCL分别将SNOR降低至20.6和20.1 mg NO2–-N/(g MLVSS•h)。在10 mg/L时，观察到更显著的下降（分别为16.7和17.3 mg NO2–-N/(g MLVSS•h），表明亚硝酸盐氧化细菌（NOBs）受到抑制。比较SNOR和SAOR可以看出，NOBs对NPs和DMPs具有更大的抵抗力，这可能是由于它们位于较深的颗粒层中，限制了NPs/DMPs的渗透。(67)
SNRR也对ZnO纳米颗粒表现出较强的抵抗力（图5c）。对照组的值在5 mg/L ZnO时为48.7 mg NO3–-N/(g MLVSS•h)，而在10 mg/L ZnO时仅略有下降（46.9）。这可以归因于NPs渗透到厌氧核心区域的有限性，那里有反硝化菌。相比之下，PLA和PCL显著影响了SNRR。在5 mg/L时，PLA+PCL和ZnO+PLA+PCL分别将SNRR降低至42.3和41.9 mg NO3–-N/(g MLVSS•h)；在10 mg/L时，进一步降至32.6和30.2 mg NO3–-N/(g MLVSS•h)。这可能是由于DMP在颗粒表面积累，阻碍了厌氧反硝化所需的内部分质传递路径，类似于之前观察到的PS MPs的机制。(53)
与氮物种不同，SPUR受到ZnO纳米颗粒及其与DMPs混合物的影响最为严重（图5d）。在5 mg/L和10 mg/L时，PLA、PCL及其混合物没有显著改变SPUR。然而，在5 mg/L和10 mg/L时，ZnO分别将SPUR降低至14.9至12.8 mg PO43–-P/(g MLVSS•h和10.1 mg PO43–-P/(g MLVSS•h)，反映了14.1%和32.2%的下降。ZnO+PLA和ZnO+PCL的降低幅度更大，分别为16.8–37.6%，其中ZnO+DMPs混合物的抑制作用最为显著：在5 mg/L时SPUR下降了21.4%（降至11.7 mg/g），在10 mg/L时下降了44%（降至8.3 mg/g）。这表明磷酸盐积累生物（PAOs）对ZnO纳米颗粒的敏感性远高于DMPs，这与之前关于金属纳米颗粒对PAOs毒性的研究结果一致。(68,69) 值得注意的是，虽然特定微生物活性测定中观察到的显著抑制作用并未体现在24小时运行后出水水质参数的相应大幅下降中（表S2），总体上没有检测到营养物去除效率的显著降低。这种差异可以归因于两种实验方法之间的根本差异。例如，在5 mg/L ZnO + PLA + PCL处理下，SAUR下降了29.8%，而氨去除效率仅略微下降，从99.53%降至99.4%。同样，尽管SPUR下降了21.4%，但磷酸盐去除效率从96.89%降至90%。虽然PSBRs含有大量能够在短期压力条件下维持有效营养物去除的活性生物量，但微生物活性测试是在400 mL总体积中稀释了50 mL的混合液进行的，导致有效生物量浓度显著降低。因此，活性测定对短期功能抑制更为敏感。在这方面，特定的微生物活性测量提供了有关污泥瞬时生理状态的宝贵信息，这些活动的下降表明存在抑制作用，这些抑制作用可能最终导致出水质量在长期暴露下恶化。

低浓度（5 mg/L）的PLA、PCL和ZnO单独使用时似乎会刺激氨氧化活性，但与DMPs结合或在较高浓度（10 mg/L）下使用时，它们的抑制作用占主导地位，尤其是在氨和磷转化路径中。亚硝酸盐和硝酸盐的去除过程相对更为稳健，这归因于深层颗粒层的空间屏蔽作用，那里居住着相关的功能微生物。磷的吸收显示出最高的脆弱性，尤其是在ZnO纳米颗粒的影响下，进一步证实了表面相关的PAOs对重金属基纳米材料的急性敏感性。

3.6. 细胞外聚合物物质的定量和结构变化
细胞外聚合物物质，特别是PN和PS，是微生物产生的重要成分，增强了它们对环境压力的抵抗力。PN/PS比率通常用作颗粒污泥结构稳定性的指标，较高的比率通常表示更为坚固和紧密的颗粒结构。(48) 在对照MBGS中，PS和PN的含量分别为70.4 mg/g MLVSS和113.1 mg/g MLVSS，从而导致PN/PS比率为1.6（图6）。暴露于5 mg/L的ZnO纳米颗粒后，总EPS产量增加，主要是由于PN含量上升到141.9 mg/g MLVSS。因此，PN/PS比率增加到1.9（图6a）。这种反应可能与ZnO纳米颗粒引起的细胞压力有关，它促进了应激相关蛋白质的表达，如热休克蛋白和抗氧化酶（如超氧化物歧化酶SOD），作为对抗Zn2+释放产生的活性氧（ROS）的防御机制。(25)
图6
图6. 暴露于ZnO纳米颗粒以及基于PLA和PCL的DMPs后，MBG中总EPS含量的变化，浓度分别为（a）5 mg/L和（b）10 mg/L。星号表示统计显著差异（*p < 0.05；双向ANOVA）。
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相比之下，相同浓度的PLA仅轻微诱导了PN的产生，使PN/PS比率降至1.2。同时，PCL暴露显著降低了PN含量至37.1 mg/g MLVSS，同时PS含量增加到136.3 mg/g MLVSS，使PN/PS比率降至0.3。PCL暴露下PN含量的显著下降可能不仅与其可降解性有关，还与其表面粘附特性以及在部分降解过程中释放的有毒纳米片段有关。这些因素可能通过干扰膜相关的合成途径或在细胞表面物理阻碍分泌来干扰微生物EPS蛋白质的分泌。(16,70)
联合暴露（ZnO+PLA和ZnO+PCL）对EPS组成也有类似负面影响。虽然PS水平与对照组相当，但PN含量分别降至66.8 mg/g MLVSS和57.2 mg/g MLVSS。在PLA+PCL混合物中，PN含量进一步降至43.0 mg/g，而PS含量显著增加到111.6 mg/g MLVSS。这些发现表明，单独的纳米颗粒-塑料暴露主要减少了蛋白质含量，而PLA+PCL联合处理不仅抑制了PN的产生，还促进了PS的富集。这种转变可能是由表面层面的压力反应和两种聚合物的物理粘附驱动的，这刺激了基于多糖的生物膜形成，以维持颗粒稳定性。(71) 有趣的是，尽管在ZnO+DMPs处理中观察到总体EPS含量最低，但PN/PS比率仍保持在1.6，表明两种成分都按比例减少。

在较高浓度（10 mg/L）下，所有测试的压力源都导致EPS水平显著下降（图6b）。单独使用ZnO纳米颗粒导致PN含量显著下降至60.2 mg/g MLVSS。在联合暴露下，PN含量下降最为明显：ZnO+PLA时降至42.5 mg/g，ZnO+PCL时降至16.7 mg/g，ZnO+DMPs时降至10.2 mg/g。鉴于EPS在保持MBGS结构完整性中的关键作用，观察到的总EPS下降可能损害了颗粒稳定性，这也得到了SEM观察的证实（图1）。
与从颗粒表面获得的FT-IR光谱不同，添加污染物后峰值强度并不普遍下降；在某些情况下，它们甚至增加（图7）。在几乎所有情况下，除了两种处理外，5 mg/L的污染物暴露导致峰值强度显著下降，表明 characteristic chemical functional groups（特征化学基团）发生了降解或掩盖（图7a）。这种下降可以归因于氢键网络的中断和EPS基质中有序蛋白质构象的丧失，尤其是在酰胺I区域（1600–1700 cm–1），该区域对蛋白质二级结构（如α-螺旋和β-折叠）敏感。(51) 在1650 cm–1和1540 cm–1（酰胺I和II带）附近的峰值减弱支持了蛋白质变性或转变为结构较不稳定的形式的假设。

图7
图7. 暴露于ZnO纳米颗粒和DMPs（PLA和PCL）后提取的EPS的FT-IR光谱：(a) 5 mg/L暴露浓度下的光谱变化；(b) 10 mg/L暴露浓度下的光谱变化。
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有趣的是，PCL单独使用或与PLA（PLA+PCL）结合使用时，显著增强了对应于PS的羟基和醚基团的峰值强度，以及与PN成分相关的酰胺I–III带。这一观察表明添加的聚合物与EPS基质之间发生了相互作用，可能通过稳定或诱导特定的二级结构来实现。这种增强效应可能是由于PCL片段与EPS分子之间的物理相互作用引起的，这种相互作用可以诱导蛋白质的构象重排，有利于形成β-转角和随机卷曲结构，从而在1640–1670 cm–1范围内增加傅里叶变换红外光谱（FT-IR）的吸收强度。(58) 此外，可降解聚合物的两亲性使其能够与富含羟基的PS结构域形成氢键，可能稳定它们在约1080 cm–1处的醚键和C–O–C伸缩振动。(21) 在比较两种浓度时，10 mg/L处理下ZnO纳米颗粒（ZnO NPs）、PLA DMPs以及ZnO+PLA组合在光谱强度上的抑制作用明显大于5 mg/L处理组（图7b）。然而，在10 mg/L浓度下，ZnO+PCL和ZnO+PLA+PCL处理组的峰值强度反而有所增加，这表明某些EPS成分的增强效应具有浓度依赖性，可能是由于PCL的含量增加所致。这些发现表明，这种毒性具有强烈的协同效应，主要干扰了与蛋白质相关的代谢途径。不同处理条件下EPS的数量和组成的变化凸显了微生物对新兴污染物的动态响应。亚致死剂量的ZnO纳米颗粒会促进防御性蛋白质的合成，而像PCL这样的可降解塑料则会破坏这一过程，使微生物群落倾向于形成以多糖为主的EPS基质。最严重的影响来自联合暴露，它们共同损害了蛋白质的分泌并威胁到颗粒的完整性。傅里叶变换红外光谱分析证实了这些趋势，显示出蛋白质通过酰胺键的减弱而发生结构降解，并且在某些聚合物作用下选择性地影响了PS相关的光谱峰。这些光谱变化表明，虽然ZnO和DMPs会导致EPS成分的损失，但PCL相关的处理可以引发构象重排和多糖及次级蛋白质结构的选择性变化。值得注意的是，据报道PLA和PCL的水解降解会释放乳酸和己酸衍生物，这可能导致颗粒表面微环境的pH值下降。根据先前的研究，这种局部酸化可能有助于促进ZnO纳米颗粒中Zn2+离子的释放，从而可能增强其细胞毒性。这种机制在像PS或PE这样的传统微塑料中不太可能发生，因为它们在废水处理条件下是化学惰性的且不可降解的。这种差异强调了在评估颗粒污泥系统中的微生物应激反应时，不仅需要考虑聚合物的类型，还需要考虑其降解动力学和副产物化学性质。

3.7. 通过PCoA探索复合污染物的影响
PCoA显示了生物反应器样本之间的不同聚类模式，反映了EPS、叶绿素、SAOR、SNOR、SNRR和SPUR水平的变化（图8）。在两种暴露浓度下，污染物的存在都使样本与对照组明显分离，表明它们对MBGS（微生物生物气悬浮系统）的性能有显著影响。在5 mg/L浓度下（图8a），ZnO纳米颗粒与对照组的聚类较接近，表明在这一浓度下仅有轻微的干扰。PLA和PCL以及它们与ZnO的二元组合（ZnO+PLA和ZnO+PCL）也引发了类似的改变。同时暴露于这三种污染物的反应器显示出最大的分离度，表明即使在低浓度下，ZnO、PLA和PCL的联合暴露也产生了最显著的影响。对于ZnO纳米颗粒而言，MBGS中观察到的不利效应主要是由ZnO的颗粒形式引起的，而不是离子溶解，因为在典型的废水条件下ZnO纳米颗粒的Zn2+浸出量相对较低。(72) 相反，PLA和PCL微塑料的部分可降解性可能改变了表面性质或渗滤液组成，尽管这些降解动态在本研究中没有直接测量。未来的工作将包括分子量分析和表面表征，以更好地评估操作条件下的DMP转化。

图8. PCoA展示了不同污染物在(a) 5 mg/L和(b) 10 mg/L浓度下对MBGS性能的影响。
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在更高的浓度（10 mg/L，图8b）下，沿着主轴观察到了更大的变异性和更明显的分离现象。ZnO+PLA+PCL组合与对照组偏离最为显著，这与早期研究结果一致，即这种处理方式导致了最大的抑制作用。然而，ZnO+PLA和ZnO+PCL也引发了类似的改变，表明在高剂量下，附加的负效应可能会达到平台期，并且进一步的协同效应可能受到限制。固定变量（污染物类型和浓度）导致了明确的分组模式，支持了新兴污染物可以对MBGS系统功能产生协同效应的假设。这些PCoA结果不仅证实了之前的形态学和生化观察结果，还提供了对多重压力源影响的系统级视角。

尽管本研究表明ZnO纳米颗粒和可降解微塑料在MBGS系统中的协同毒性，但仍有一些关键机制尚未得到验证。具体来说，Zn2+离子的释放、活性氧（ROS）的产生以及质子梯度的扰动没有直接量化，限制了机制解释的深度。未来的工作应集中在目标检测方法上，例如使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）检测Zn2+，DCFH-DA荧光定量ROS，以及使用膜电位敏感染料（如JC-1）评估类囊体质子梯度。此外，时间分辨傅里叶变换红外光谱或二维相关光谱可以揭示EPS成分的动态构象变化，从而支持对污染物相互作用的分子级理解。

3.8. 环境影响
ZnO纳米颗粒以及基于PLA和PCL的DMPs对PSBR（微生物生物气悬浮系统）中的MBGS性能产生了显著影响。虽然单独在低浓度下使用这些物质可以部分刺激氨氧化或藻类生长（主要是PLA的情况），但联合暴露，尤其是ZnO+PCL和ZnO+PLA+PCL，引发了协同毒性效应。这些组合减少了EPS中的蛋白质比例，损害了颗粒的沉降性，并显著抑制了与微藻相关的光合活性。观察到的叶绿素含量、EPS数量和硝化速率的下降表明，自养和异养微生物群落对这些新兴污染物都非常敏感。这些发现具有重要的环境和工业意义。随着ZnO纳米颗粒和DMPs在废水中的日益增多，它们可能会负面影响基于MBGS系统的运行效率，尤其是在营养物质去除和污泥稳定性方面。研究表明，需要在不同浓度、污染物比例和环境条件下进行进一步研究，并对微生物响应进行详细的分子水平分析。从技术角度来看，应用能够保持颗粒结构完整性的稳定剂至关重要。为了确保MBGS系统在复杂环境压力下的适应性，对其管理至关重要。未来的研究应进一步明确可降解微塑料在MBGS系统中的转化行为。特别是，需要研究PLA和PCL在MBGS系统中的降解方式，形成的中间产物有哪些，以及这些化合物如何影响营养物质去除效率和微生物代谢。此外，还需要深入研究ZnO纳米颗粒毒性的机制，包括ZnO是通过完整的纳米颗粒发挥其效应，还是通过Zn2+离子的释放来实现的。还需要探索微塑料与ZnO纳米颗粒之间的潜在相互作用，包括是否可能加速或改变Zn2+离子的释放过程。此外，详细的微生物群落分析对于更好地理解污染物驱动的MBGS联盟内的成分变化至关重要。

4. 结论
本研究首次全面评估了ZnO纳米颗粒和可降解微塑料（PLA和PCL）对MBGS系统的综合影响。暴露于10 mg/L的ZnO+PLA+PCL下，EPS中的蛋白质含量减少了91%，总叶绿素减少了52%，氨和磷的吸收率分别减少了63%和44%。这些指标证实了协同毒性模式，即共存污染物共同损害了颗粒的结构和代谢完整性，超过了单一污染物的影响。观察到的效应与EPS减少、光合途径的破坏以及静电不稳定有关，表明自养和异养微生物群体对复杂的有机污染物混合物非常敏感。这些发现的实际意义在于识别了MBGS系统在真实污染情景下的关键脆弱点。随着ZnO纳米颗粒和DMPs在市政和工业废水中的日益增多，它们可能会对基于MBGS系统的运行效率产生负面影响，特别是在营养物质去除和污泥稳定性方面。我们的结果强调了将污染物抗性整合到MBGS处理技术设计和监测中的紧迫性。未来的研究应探索长期暴露、真实废水基质以及保护策略（如EPS增强添加剂或选择性预过滤）以保护MBGS在富含有机污染物的环境中的性能。