巴西市场上销售的绿茶样品中儿茶素的分析鉴定与定量测定（用于质量控制）

《ACS Food Science & Technology》：Analytical Identification and Quantification of Catechin for Quality Control of Green Tea Samples Marketed in Brazil

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为了支持绿茶的化学质量控制，本研究旨在开发并验证一种综合分析工作流程，用于提取、鉴定和定量儿茶素，以适用于常规的工业分析。袋装和散装绿茶样品使用水进行提取，并用乙酸乙酯进行分离。通过质谱（MS）和核磁共振（NMR）对乙酸乙酯馏分的酚类和黄酮类化合物进行表征，确认了儿茶素的存在并支持了样品的真实性。抗氧化活性通过2,2-二苯基-1-picrylhydrazyl（DPPH）和2,2′-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid）（ABTS）测定法进行评估，而细胞毒性则通过3T3成纤维细胞的3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）方法进行评估。采用经过验证的高性能液相色谱（HPLC）方法对（+）-儿茶素进行定量，显示出强线性（R = 0.995），相对标准偏差（RSD）分别为2.60%（重复性）和2.45%（中间精度），以及高灵敏度，检测限和定量限分别为0.0637 mg L–1和0.2123 mg L–1。在优化条件下，（+）-儿茶素的保留时间为5.98分钟，总运行时间为15分钟。对于浓度为2 mg mL–1的提取物，乙酸乙酯馏分中含有0.420 mg mL–1的儿茶素，约占总提取物的21%。袋装茶提取物显示出比散装茶更高的黄酮类化合物含量和更强的抗氧化活性，证明了该方法能够根据化学质量区分产品。与大多数基于水或水-alcohol提取物的方法不同，本研究表明乙酸乙酯分离显著增强了儿茶素的富集，使用传统的HPLC-UV/DAD仪器可以加快分析速度并提高灵敏度。与更复杂的分析技术相比，所提出的方法为常规质量控制提供了一种快速、经济且可靠的选择，尽管它仅限于目标儿茶素的定量。这种分析策略为绿茶的鉴定、批次标准化以及食品工业产品中抗氧化声明的验证提供了强有力的工具。

**引言**
绿茶来自山茶属植物（Camellia sinensis (L.) Kuntze）（山茶科），是全球消费最广泛的饮料之一，并以多种形式销售，包括散叶茶、茶包、速溶粉以及胶囊和片剂等固体口服制剂。(1?3) 对绿茶产品的兴趣日益增加，主要与其报道的健康益处有关，特别是其抗氧化、抗炎和化学保护特性，这些特性主要归因于其中高含量的酚类化合物。(4?6) 根据茶叶的发酵程度，山茶属茶叶传统上被分为绿茶（未发酵）、乌龙茶（部分发酵）和红茶（完全发酵）。(7) 在这些茶中，绿茶因其富含儿茶素而脱颖而出，儿茶素是一类黄烷-3-醇，包括儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表儿茶素没食子酸酯（EGC）和主要成分表儿茶素没食子酸酯（EGCG）（图1），这些成分可能占总多酚含量的50-60%。(8) 这些化合物被认为是有效的活性氧清除剂，并且在多项体外和体内研究中证实了其与绿茶抗氧化能力的关联。(4,9)

**图1. 儿茶素的衍生物。**(a) C; (b) EC; (c) EGC; (d) ECG; (e) EGCG)

绿茶的化学组成和儿茶素谱受多种因素影响，包括品种、地理来源、采收季节、加工工艺和储存条件。(5,10) 此外，市场上销售的绿茶产品在生物活性化合物的浓度上往往存在显著差异，特别是当考虑不同的商业化和加工形式时。(1,3) 这种变异性突显了可靠分析方法的重要性，以确保产品的真实性、批次标准化以及符合质量和安全要求。

**近年来，在自然基质（如绿茶和葡萄酒）中儿茶素的分析表征方面取得了实质性进展。** 高性能液相色谱（HPLC）和超高效液相色谱（UHPLC）已被广泛用于高效分离、鉴定和定量单个儿茶素。(2,6,11) 将色谱技术与质谱（HPLC–MS）结合使用显著提高了灵敏度，并能够在痕量水平上进行结构确认，而核磁共振（NMR）光谱提供了补充的结构信息。其他技术，包括毛细管电泳和傅里叶变换红外光谱，也贡献了定性和定量分析。尽管有MS和NMR等高灵敏度技术的可用性，但由于其稳健性、成本效益和成熟的方法论，HPLC与紫外或二极管阵列检测器（HPLC-UV/DAD）结合仍然是常规儿茶素分析的实用且广泛采用的方法。考虑到绿茶天然高的儿茶素含量，最近的研究越来越多地关注提高分析选择性和灵敏度，特别是通过分离策略在色谱分析前富集酚类化合物。(1,2,10,11)

**提取程序在准确测定儿茶素方面起着关键作用，因为溶剂极性、样品制备步骤和分离策略直接影响提取效率、回收率和分析选择性。(2,5) 水提取和水-alcohol提取是最常用的方法之一；然而，这些方法可能导致干扰化合物的共提取并降低选择性。(5,6) 在此背景下，有机溶剂分离已被报道为富集酚类组分和改善分析性能的有效策略，特别是在与HPLC等色谱技术结合使用时。(2,10) 然而，不同研究中的提取协议、色谱条件和方法验证参数的变化可能会限制数据可比性，并阻碍分析标准化，从而加强了对稳健和经过验证的分析方法的需求。(1,10) 因此，开发高效的定量方法对于确保产品的真实性、监控工业加工过程以及保留绿茶的健康益处至关重要。** 在此背景下，本研究探讨了实用的、时间优化的儿茶素定量策略，重点关注分析精度和适用于常规质量控制的可行性。此外，还纳入了抗氧化活性测定和细胞活力评估作为补充的质量指标，以关联化学组成、功能性抗氧化性能和生物安全性，这对于绿茶产品的质量分级和验证尤其相关。

**结果与讨论**
**绿茶提取物的酚类谱、总酚含量和总黄酮含量**
通过Folin–Ciocalteu方法测定的总酚含量为：袋装提取物499.6 ± 4.58 mg g–1（干重），散装提取物499.3 ± 2.24 mg g–1（干重）。统计分析显示两种商业形式之间没有显著差异（Student’s t 检验；p = 0.99），表明酚类水平相当。
这些值高于使用水或水-alcohol溶剂获得的绿茶提取物的报道值。Beyazbulut等人报告使用水、80%乙醇和80%甲醇制备的绿茶提取物的总酚含量范围为84.82 ± 0.90至195.86 ± 8.76 mg GAE g–1。同样，使用水提取评估不同茶品种的研究显示绿茶的绝对酚含量较低，但相对于红茶品种始终较高。这种差异可以归因于乙酸乙酯对酚类化合物（尤其是儿茶素）的高选择性，相比于更极性的提取系统。(12)
通过氯化铝比色法测定的总黄酮含量在袋装提取物中显著更高（588.03 ± 2.45 mg g–1；干重的2.32%），而散装提取物为[391.13 ± 3.88 mg g–1；1.56%](p < 0.001)，样本之间存在显著差异（Student’s t 检验）。总体而言，多项研究表明绿茶提取物中的黄酮含量高于总酚含量，反映了黄烷-3-醇（尤其是儿茶素）在其生物活性成分中的主导地位。(12,13) 对市售茶叶产品的系统调查也观察到C. sinensis茶叶中酚类含量的广泛差异，并且酚类浓度与抗氧化活性之间存在显著相关性。(14) 此外，提取效率和溶剂极性显著影响酚类物质的产量，进一步支持了方法论差异对定量结果的影响。比较绿茶与其他茶类（如白茶）的研究也记录了绿茶通常具有更高的总酚和黄酮含量，这与当前的研究结果一致。(15,16)

**质谱实验**
为了定性确定提取物中的化合物，进行了质谱实验（总离子扫描和MS/MS），如表1所示。
**表1. 通过直接浸渍袋装提取物样品在负极性下进行质谱分析时发现的前体离子和碎片**
| 化合物 | 离子 (m/z) | 片段离子 (m/z) |
|-------|---------|-----------|
| EGCG | 457.2 | 331.25/305.26/169.2 |
| ECG | 441.2 | 169.17/289.22/271.1 |
| EGC | 305.2 | 179.30/219.27/125.23 |
| EC/C | 289.3 | 271.43/245.21 |
| 没食子酸 | 169.2 | 125.32 |
| 咖啡酸 | 353.2 | 191.32/179.34 |

对于袋装提取物样品的电喷雾电离串联质谱（ESI-MS/MS），鉴定出的主要化合物是儿茶素（图1）。其他代谢物以较低的强度被检测到，详见表1（图S1–S7）。
**获得的精确质量值和MS/MS碎片模式与黄烷-3-醇和酚酸的典型解离行为一致，支持在袋装提取物中鉴定儿茶素及相关化合物。** 对于EGCG（m/z 457.21），m/z 331.25和305.26的片段分别对应于没食子酸基团和羟基的失去，而m/z 169.2的片段对应于没食子酸，这是没食子酸酯儿茶素的已知诊断离子。同样，ECG（m/z 441.22）的碎片产生m/z 169、289和271的离子，反映了酯键的断裂和黄酮骨架的逆Diels–Alder反应，与文献报道一致。EC/C（m/z 289.32）观测到的离子，特别是m/z 271和245的离子，是非没食子酸儿茶素的特征，进一步证实了它们的存在。总体而言，观测到的碎片路径为儿茶素衍生物提供了强有力的结构证据，并支持将其用作绿茶鉴定的化学标记。(7,17)
对于散装样品的MS/MS谱，主要鉴定的化合物是quinic酸和咖啡酸，其离子分别为m/z 191.35和179.34（图S8）。还观察到其他不同m/z值的离子，如咖啡酸（m/z 353）、没食子酸（m/z 169）、咖啡因（m/z 195）和儿茶素C和EC（m/z 289），它们也存在于袋装茶提取物中。(17) 散装样品中quinic酸和咖啡酸的占比以及儿茶素相关离子的较低相对强度表明，袋装茶和散装茶之间的差异主要是定量上的，与加工条件有关，而不是由于不同的酚类结构。

**核磁共振（NMR）分析**
**袋装绿茶提取物的水提取物的质子核磁共振（1H NMR）谱（图2）**显示了7.00 ppm区域的信号，这是芳香环中氢原子的特征。3.00至5.00 ppm区域观察到的信号表明存在糖类，而3.00 ppm以下区域观察到烷基氢的信号。
**图2. 在298 K下，D2O中记录的400 MHz下的绿茶袋装提取物1H NMR谱。**
1H NMR和HSQC分析为袋装提取物中儿茶素提供了互补且一致的结构确认。5.85至5.94 ppm区域观察到的信号对应于A环的芳香质子，而4.70 ppm处的双峰（H-2）和3.99 ppm处的多重峰（H-3）与杂环C环的质子相关，这是黄烷-3-醇骨架的特征。H-2的双峰与H-3的邻位耦合以及儿茶素的反式构型一致。HSQC谱（图3）显示了两个对映异构H-4质子（H-4a和H-4b）与同一C-4碳信号的相关性，证实了C环的CH2性质。观察到的化学位移模式和连接性与文献中的儿茶素数据一致。表2总结了儿茶素、没食子酸和咖啡因的主要1H和HSQC相关性。袋装和散装样品观察到相似的化学位移模式，表明儿茶素的结构完整性得到了保留，并表明样品之间的差异主要源于化合物丰度的变化而非结构修饰。(18)
**图3. 在298 K下，D2O中记录的400 MHz下的绿茶袋装提取物HSQC谱（δH 2.0–3.0 ppm区域）。**非对映异构的H-4质子（H-4a和H-4b）与C-4碳信号的相关性证实了儿茶素C环中的CH2基团。质子-碳连接性与黄烷-3-醇骨架一致。

为了分离和量化儿茶素，采用了一种HPLC-DAD分离技术。

通过比较本研究所提出的HPLC方法与最近关于不同国家绿茶的研究结果（表3），可以看出该方法具有更低的检出限（LOD）和定量限（LOQ），同时保持较短的保留时间。

最近基于HPLC的绿茶研究，例如Jakabová（2024）和Custodio-Mendoza（2024）的研究报告了更高的检出限和定量限，以及更长的分析时间。相比之下，本研究开发的HPLC-UV/DAD方法在灵敏度和分析时间上具有优势。

该方法通过使用乙酸乙酯分数来减少基质干扰并提高分析物的富集度，从而提高了对儿茶素的检测灵敏度。所获得的较低检出限和定量限主要归因于这一选择。

通过线性回归分析验证了方法的线性，并确认了回归的统计显著性。在优化的色谱条件下，儿茶素的保留时间为5.98分钟。

重复性和中间精度的相对标准偏差（RSD）值分别为2.60%和2.45%，均在可接受范围内。

通过回收试验评估了方法的准确性，结果显示测量浓度与标称浓度之间有良好的一致性。

使用经过验证的校准曲线确定了乙酸乙酯分数中的儿茶素含量。对于2 mg/mL的提取物浓度，儿茶素含量为0.420 mg/mL，约占提取物的21%。

通过2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）和2,2'-偶氮双（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）（ABTS）自由基清除试验评估了提取物的抗氧化活性。茶包提取物的IC50值为1.039 mg/mL，而散叶提取物的IC50值较高，为2.713 mg/mL。此外，作为参考抗氧化剂的抗坏血酸在ABTS试验中的IC50值为5.881 mg/mL。

尽管所有方法都基于自由基清除，但它们涉及不同的自由基、反应动力学、溶剂系统以及对特定抗氧化类别的敏感性。DPPH主要与亲脂性抗氧化剂反应，通常具有较慢的动力学，而ABTS适用于亲水性和亲脂性系统，并显示更快的反应速率。因此，与抗坏血酸的比较应视为定性的参考，而不是抗氧化强度的直接等同。

本研究提出的HPLC-UV/DAD方法在绿茶中儿茶素测定方面提供了改进的灵敏度和更短的分析时间。

总的来说，所开发的方法与最近报道的方法相比具有竞争力，在某些情况下甚至更优，这支持了其适用于绿茶产品中(+)-儿茶素常规分析的适用性。高效液相色谱-紫外/二极管阵列检测（HPLC-UV/DAD）方法表现出高灵敏度、精确度和准确性，并且分析时间较短。与近期报道的来自不同国家的绿茶分析方法相比，该方法的性能具有竞争力（见表3）。此处采用的分析方法能够可靠地评估绿茶的成分组成，特别突出了商业样品之间的差异，尤其是在酚类物质含量、黄酮类化合物水平以及抗氧化活性方面。这些发现进一步证实了(+)-儿茶素作为质量评估化学标志物的相关性，并支持该方法在常规分析中的适用性。

**材料与方法**

**样品**
绿茶样品来源于Camellia sinensis的叶片，以袋装和散装两种形式购买自巴西巴拉那州Ponta Grossa的本地零售市场。袋装和散装样品均来自不同的商业批次。购买后，所有样品均保存在其原始包装中，避光、避热和防潮，并在购买后2周内进行分析。

**提取**
在提取前，使用搅拌机将样品研磨成均匀的状态。采用蒸馏水以1:100（w/v）的固液比进行浸提。提取过程在80°C下利用Kondortech超声波浴（型号CD-4820，序列号LUS20050736）进行20分钟超声辅助提取，操作参数为150/170 W和50/60 Hz。提取完成后，样品过滤并冷却至室温。

**黄酮类化合物的分离与纯化**
根据Das等人（2020年）的方法，将过滤后的样品酸化至pH 2（使用6 mol L–1 HCl）。随后进行五次乙酸乙酯（1:1 v/v）液-液萃取。有机相用无水硫酸钠干燥后过滤，最后通过减压蒸馏进行浓缩。

**成分分析**

**酚类化合物**
总酚类化合物的测定采用改良的Folin–Ciocalteu方法（28）。将浓度为0.1 mg mL–1的样品加入96孔板中，加入100 μL 10% Folin–Ciocalteu试剂。5分钟后，向每个孔中加入100 μL 7%碳酸钠溶液，反应持续30分钟。反应结束后，使用Biotek微孔板光谱仪（型号Epoch）在765 nm处测量吸光度。结果以每克样品中的没食子酸当量毫克数表示。

**黄酮类化合物含量**
黄酮类化合物含量的测定采用了Camargo等人（2016年）（28）提出的比色法。取浓度为0.1 mg mL–1的样品100 μL于乙醇溶液中，加入50 μL 5% (w/v) NaNO2，静置6分钟后，加入75 μL 2% (w/v) AlCl3·6H2O溶液，再加入75 μL 1 mol L–1 NaOH，静置10分钟后，使用ELISA光谱仪在510 nm处测量吸光度。结果以每克样品中的儿茶素毫克数表示。

**质谱分析（ESI-MS/MS）**
定性分析采用Acquity Xevo TQD质谱仪（Waters），配备电喷雾离子化（ESI）和三重四极杆质量分析器，操作模式为ESI(?)-MS/MS。毛细管电压设为4000 V，锥形电压设为45 V，脱溶剂温度设为600°C，脱溶剂气体流量设为650 L h–1，碰撞能量设为15 V。通过负离子模式下m/z 100–1500范围内的扫描来鉴定样品中的主要化合物。对选定的离子进行MS/MS分析以确定其碎片化模式并确定其身份。

**色谱条件**
色谱分离使用Shimadzu HPLC系统，配备LC20AT溶剂泵单元、SIL-20A自动进样器、CTO-20A柱 oven、SPD-M20A光电二极管阵列检测器和CBM-20A系统控制器，以及LCsolution软件。所用柱子为Shim-pack VP-ODS C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）。柱温设为40°C，进样体积为10 μL，流速为1.0 mL min–1。流动相由0.1% (v/v) 磷酸酸化的水和乙腈（A）组成。分析程序基于渐变梯度设计，流动相B的比例在30分钟内从5%升至100%，其他参数（流速、温度和进样体积）保持不变。检测波长根据DAD获得的UV光谱图确定为205 nm（对应于分析物的最大吸收波长）。在实际样品中识别和分析物时，综合考虑了峰面积、保留时间和UV光谱图与分析标准品的对比。最终优化的梯度洗脱条件为15–85%，时间范围为0–14分钟。

**方法验证**
根据ANVISA发布的RDC 166（2017年）标准，验证参数包括选择性、线性、精确度、准确度、检出限（LOD）和定量限（LOQ）。

**选择性**
通过分别注入乙酸乙酯提取物样品中的绿茶提取物和儿茶素标准品来评估方法的选择性，观察到信号和保留时间的一致性。结果表明，在所测试的方法中，提取物中的儿茶素信号未受到其他化合物的干扰。

**线性**
配制五种不同浓度（0.32、0.36、0.40、0.44和0.48 mg mL–1）的儿茶素标准品溶液（均来自1.0 mg mL–1的储备溶液）。选择这一浓度范围是为了覆盖样品中儿茶素的实际工作浓度，大约相当于标称分析浓度的80–120%。通过绘制色谱峰面积与儿茶素浓度的关系曲线建立线性校准曲线，并通过线性回归分析进行评估。该方法在此范围内显示出优异的线性（R2 = 0.995），方差分析（ANOVA）确认了回归的统计显著性（p < 0.001），残差呈随机分布，表明线性模型适用（见图S9和表S1）。

**精确度**
方法的精确度通过重复性（日内精确度）和中间精确度（日间精确度）来评估，分别以% CV表示。重复性是在同一天的相同分析条件下对儿茶素标准品溶液进行六次连续进样（浓度为0.40 mg mL–1）来评估的。中间精确度则是在3天间隔后重复相同条件下的分析得到的。根据现行验证指南，精确度的接受标准为% CV不超过5%。

**准确度**
准确度的评估通过在不同浓度（低浓度：0.36 mg mL–1、中等浓度：0.40 mg mL–1、高浓度：0.48 mg mL–1）下多次进样儿茶素来确定。准确度表示为实验测定平均值与理论浓度之间的百分比比值。

**检出限（LOD）和定量限（LOQ）**
检出限（LOD）和定量限（LOQ）根据线性校准曲线使用以下公式计算：
$$
LOD = 3.3\sigma_I, \quad LOQ = 10\sigma_I
$$
其中IC表示校准曲线的斜率，σ表示截距与Y轴的标准偏差（基于三条校准曲线计算）。这种方法能够独立于选定的校准范围估计方法的内禀灵敏度。

**核磁共振（NMR）分析**
NMR分析中，将20 mg的水提取物（袋装样品）溶解在含有TMSP-d4（内标，δ 0.00 ppm）的600 μL D2O中。在Bruker AVANCE III 400 MHz光谱仪（9.4 T）上以298 K温度下采集光谱，1H信号位于400.13 MHz，13C信号位于100.13 MHz。采用Bruker标准脉冲序列进行1H、13C和HSQC实验。1H NMR光谱使用单次90°脉冲获取，谱宽为20 ppm，松弛延迟为1.0 s，共128次扫描；13C NMR光谱使用zgpg30序列，松弛延迟为2.0 s，共2000次扫描。HSQC实验使用标准Bruker脉冲序列，F2方向有2048个数据点，F1方向间隔512个点，以确保质子-碳相关性的充分解析。

**抗氧化活性**
**DPPH和ABTS测定**
制备了25 ppm浓度的DPPH乙醇溶液以及0.1 mg mL–1浓度的散装和袋装绿茶样品。将这些溶液置于96孔板中，并稀释至12.5、6.25、3.12、1.56、0.78、0.39和0.09 mg L–1。样品在避光条件下静置30分钟后，使用ELISA光谱仪在517 nm处测量吸光度。标准品为不同浓度的抗坏血酸（1000、500、250、125、62.50、31.25、7.81 mg L–1）。该方法改编自Yen和Chen（1995年）的研究（29）。

**ABTS法测定抗氧化活性**
ABTS法用于评估抗氧化化合物清除ABTS+阳离子的能力。首先制备含有过硫酸钾的ABTS溶液并避光孵育48小时，生成自由基ABTS•+。然后将该溶液稀释至在735 nm处吸光度为0.70。绿茶样品制备成乙醇溶液，浓度分别为100、50、25、12.5、6.25和3.125 mg L–1。向96孔板的每个孔中加入100 μL样品溶液和100 μL自由基溶液，30分钟后在734 nm处测量吸光度。抗坏血酸作为标准品。结果以IC50表示（30）。

**MTT测定**
将3T3系小鼠成纤维细胞培养在添加了10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Earth培养基（DMEM）中，温度为37°C，3% CO2条件下培养。细胞以每孔2 × 10^5个细胞的密度接种在96孔板中，培养24小时。随后去除培养基，加入不同浓度（5、1、0.5、0.25、0.125、0.075、0.050 mg mL–1）的绿茶提取物（袋装形式）。培养基中含有10% FBS的DMEM。根据先前使用富含酚类的天然提取物对3T3成纤维细胞进行的细胞毒性研究选择该浓度范围。细胞在37°C和5% CO2条件下与提取物共培养24和48小时，之后去除上清液，向每个孔中加入100 μL MTT溶液（0.5 mg mL–1），再孵育1小时（避光）。最后使用二甲基亚砜（DMSO）溶解甲酚蓝晶体，使用微孔板读取器在570 nm处测量吸光度。以不含提取物的培养基作为阴性对照，细胞活力以相对于对照细胞的百分比表示（100%视为存活）（31）。

**统计分析**
所有实验至少重复五次，结果以平均值±标准差表示。使用Microsoft Excel进行统计分析。袋装和散装样品之间的差异采用Student’s t检验进行评估；MTT测定中的多重比较采用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）后进行Tukey事后检验。线性回归和ANOVA用于评估校准曲线的线性。差异在p < 0.05时视为统计学显著。