多酚对乳蛋白技术功能特性的影响及其在低脂奶油系统中的应用

《ACS Food Science & Technology》：Effects of Polyphenols on Dairy Protein Techno-Functional Properties and Application in Reduced-Fat Cream Systems

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生产低脂奶油在技术上具有挑战性，因为脂质对于维持泡沫结构至关重要。多酚通过与蛋白质和脂质的相互作用，可能提供所需的这种支持。乳清、酪蛋白和乳蛋白分离物分别用绿茶提取物（GTE）和葡萄籽提取物（GSE）处理，然后测试其发泡、乳化和凝胶化特性。随后，通过用脱脂牛奶替代0-30%的奶油混合物，并用GTE或GSE处理后，分析其发泡特性。GTE和GSE分别使酪蛋白的发泡能力提高了2.3倍和2.0倍，而乳清蛋白的泡沫稳定性在GTE处理后几乎翻倍。同样，GTE和GSE使乳蛋白分离物的乳化稳定性提高了1.7-2.4倍。当使用5% w/w的GTE和GSE时，含20% w/w脱脂牛奶的奶油的泡沫体积分别增加了1.7倍和1.4倍。多酚可以改善奶油的发泡性能，从而可能生产出适合标注要求的低脂乳制品。

1. 引言
预计全球乳奶油市场在2024年至2029年间将以每年3.6%的速度增长，主要得益于低脂奶油的销量增长。(1) 奶油的法定定义因国家而异。在美国，轻质奶油含有30-36%的乳脂，而重质奶油含有36%以上的乳脂（21 CFR 131.150）。这种奶油在充气时会形成泡沫。当气体引入液体并被通常由蛋白质组成的薄膜在空气-水界面捕获时，就会形成泡沫。泡沫的生成及其稳定性取决于这些空气-水界面、液体的粘度以及初始气泡的大小。(2,3) 当奶油被发泡时，脂肪滴会聚集起来，形成一个粘弹性基质来支撑泡沫结构。(4) 乳脂含量低于30%的奶油通常发泡性能较差，因为缺乏脂质提供的结构支持；因此，它们主要用于咖啡奶油等用途。因此，为了满足消费者对低脂产品日益增长的需求，并支持减少饱和脂肪的饮食目标（这与心血管疾病的风险降低有关)，(5) 需要一种新的基质支持来降低脂肪含量同时保持奶油的发泡功能。此外，那些能够复制乳脂功能和感官特性的添加剂也可能有助于稳定奶油并开启新的应用。

目前市场上还没有低脂液态奶油的选择，而低脂或无脂奶油的顶部配料则含有各种水胶体。水胶体用于在没有乳脂的情况下产生必要的粘度来支撑泡沫，但由于消费者对其不熟悉以及认为这些成分不自然而不太受欢迎。(6) 此外，水胶体还用于在储存过程中稳定液态奶油，许多商店货架上的奶油都含有水胶体。潜在地，乳蛋白可以用来稳定和增强低脂奶油的发泡性能，并且还能增加奶油的蛋白质含量。例如，经过热处理和酸处理的乳清蛋白浓缩物已被证明可以改善低脂奶油的稳定性。(7) 然而，这一技术尚未被商业化应用，可能是因为添加的蛋白质并未显著提升泡沫性能。

在这里，我们提出了一种改进低脂奶油功能的新方法。我们假设由于多酚可以与蛋白质相互作用并增强其成膜性能(8?10)，以及与脂质相互作用并聚合其结构(11?13)，因此多酚可以提高低脂奶油的发泡性能。多酚是一类多样的植物次生代谢物，具有多种潜在的健康益处，如抗炎特性；因此，消费者可能会将其视为天然且有益的成分。特别是原花青素，可以改善蛋白质的发泡性和稳定性。例如，用乳清蛋白分离物和富含原花青素的蓝莓汁制成的泡沫溶液（10% w/w蛋白质）的发泡体积是对照组的1.6倍。(10) 含有果汁的乳清泡沫的稳定性也提高了2.1倍，(10) 这可能是因为蛋白质-多酚相互作用加强了泡沫中的空气-水界面。最近的研究表明，对蛋白质-原花青素复合物进行轻微热处理可以增加体系的粘度(14)，从而减缓泡沫的流失。将这一原理应用于高脂体系中，向奶油中添加高浓度（1.5–3.0% w/w）的单宁酸可以通过蛋白质-多酚和脂质-多酚相互作用产生凝胶结构，导致脂质聚集。(12) 同样，绿茶儿茶素，尤其是表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG），也被证明可以与乳脂颗粒结合并产生聚集效应。(13) 虽然已有大量研究表明多酚与乳蛋白的相互作用及其对功能特性的影响(15,16)，但我们的目标是评估影响多酚修改乳蛋白功能和奶油发泡性能的商业可行性的几个因素。主要地，我们想评估富含多酚的植物提取物对乳蛋白和奶油特性的影响，因为它们比昂贵的纯多酚更具经济可行性。由于已知多酚容易与蛋白质结合，我们评估了多酚与酪蛋白、乳清和乳蛋白分离物的相互作用，以比较这些蛋白质与特定富含多酚的植物提取物的相互作用。为了阐明多酚如何影响低脂奶油的性能，我们将相同的提取物添加到奶油和脱脂牛奶的混合物中，并评估多酚对不同脂肪含量奶油发泡性能的影响。

2. 材料与方法
2.1 材料
从Agropur（加拿大Longueuil的Saint-Hubert）购买了乳清蛋白分离粉（ISO Chill 9000，每份含90%蛋白质）。从Idaho Milk Products（美国Idaho的Jerome）购买了胶束酪蛋白（IdaPro Micellar Casein，每份含88%蛋白质）和乳蛋白分离物（IdaPro MPI-90，每份含90%蛋白质）粉末。从Sassy Cow Creamery（美国Wisconsin的Columbus）购买了均质化、巴氏消毒的脱脂牛奶（含0.1%脂肪，3.4%蛋白质）和未添加水胶体的重质奶油（含36.1%脂肪，2.8%蛋白质）。
从Bulk Supplements（美国Nevada的Henderson）购买了绿茶提取物（GTE，标示EGCG含量为50%）。从Herb Store USA（美国California的Walnut）购买了葡萄籽提取物（GSE，标示原花青素含量为98%）粉末。GTE和GSE都是市场上可购买到的富含多酚的提取物，食品加工商可以很容易地采用。此外，这些提取物具有不同的多酚组成，便于比较组成对乳蛋白功能的影响。我们承认使用富含多酚的提取物而非纯多酚会复杂性数据分析，但我们认为了解这些商业化成分如何与乳蛋白和奶油相互作用的好处超过了这种复杂性。其他所有化学品均从Fisher Scientific（美国Pennsylvania的Pittsburgh）、Beantown Chemical（美国New Hampshire的Hudson）和Sigma-Aldrich Corp.（美国Missouri的St. Louis）采购。

2.2 多酚表征
使用Singleton、Orthofer和Lamuela-Raventós改进的Folin–Ciocalteu方法测定了GTE和GSE的总可溶性酚类含量。(17) 将提取物溶解在去离子水中后，样品在12,000g下离心10分钟。取上清液的一部分用蒸馏水稀释至总体积1.1 mL，然后在室温下与Folin–Ciocalteu试剂（0.4 mL）和乙醇胺（0.9 mL）反应20分钟。在UV–vis光谱仪（Thermo Scientific GENESYS 10S，美国Wisconsin的Madison）上于600 nm处测量溶液的吸光度。总可溶性酚类含量通过 gallic acid 标准曲线计算，并以每克干提取物中的 Gallic Acid Equivalents (GAE) 的形式报告。
采用亲水相互作用液相色谱（HILIC）来表征和量化提取物中的黄酮类化合物组成，特别是原花青素（PACs），方法参照Soendjaja和Girard的描述。(18) 简而言之，将20 μL的提取物溶液（溶于甲醇中，浓度为1 mg/mL）通过Lichrosorb DIOL-5柱（5 μm，25 cm × 4.0 mm，Supelco Analytical，美国Pennsylvania的Bellefonte）以1 mL/min的流速运行。采用A溶剂（98:2，v/v 丙酮腈:醋酸）和B溶剂（95:3:2，v/v/v 甲醇:水:醋酸）的二元溶剂梯度：0–3分钟，7% B；3–60分钟，7–37.6% B；60–63分钟，37.6–100% B；63–70分钟，100% B；70–76分钟，100–7% B；76–86分钟，然后再次平衡至7% B。在230 nm处激发后，于321 nm处读取荧光发射光谱。

2.3 处理过多酚的蛋白质分离物的制备与分析
为了评估多酚与乳蛋白成分的相互作用，分别制备了每种蛋白质分离物和多酚的储备溶液，然后组合在一起测试其乳化、发泡和凝胶化特性。通过向去离子水中添加10% (w/w)的胶束酪蛋白、乳清蛋白分离物或乳蛋白分离物来制备蛋白质分离物的储备溶液。根据制造商说明，所有蛋白质的纯度都在88%到90%之间，因此储备溶液中的蛋白质含量差异较小。所有后续计算均假设储备溶液的蛋白质含量为9%。样品在500 rpm下磁力搅拌2小时，直到蛋白质分离物粉末完全溶解在水中。溶液储存于-20 °C备用。
通过向去离子水中添加GTE或GSE粉末，在500 rpm下磁力搅拌2小时，然后离心（5000g，5分钟）以去除未悬浮的颗粒来制备多酚储备溶液。GTE的添加量为15% (w/w)；GSE的添加量为10% (w/w)。这些是提取物可溶解的最高浓度。在这种浓度下，GTE的总可溶性酚类含量为0.129 g GAE/mL（而GSE为0.067 g/mL），GSE的原花青素含量为0.024 g PAC/mL（而GTE为0.017 g/mL，见表1）。溶液储存于-20 °C备用。用于功能测试的最终使用浓度分别为1.0% (w/w) GSE和1.5% (w/w) GTE。我们的目的不是直接比较提取物，而是基于总酚类含量与PAC的比例差异（GTE为7.59，GSE为2.79）来探讨每种提取物的作用机制。

表1. 绿茶和葡萄籽提取物中的多酚特性
| 总自由酚类 (g GAE/g固体) | 原花青素 (g PAC/g固体) |
| ------------------ | -------------- |
| 绿茶提取物 | 0.86 ± 0.00 | 0.116 ± 0.0043 | 主要为单体 |
| 葡萄籽提取物 | 0.67 ± 0.01 | 0.239 ± 0.0003 | 包括聚合物（DP > 10） |

a 总自由酚类通过Folin–Ciocalteu方法测定。GAE = gallic acid equivalent。
b 原花青素（PACs）通过HILIC测定。色谱图见支持信息（图S2）。

2.3.1 蛋白质分离物的发泡性和泡沫稳定性
向50 mL离心管中加入13.5 mL的蛋白质储备溶液和1.5 mL的多酚溶液。对于对照样品，用1.5 mL的水代替多酚溶液。因此，溶液的蛋白质浓度为8.1% (w/w)。按照之前的方法测量泡沫和泡沫稳定性。(9) 混合后，样品在5000 rpm下均质化15秒。立即将泡沫倒入50 mL量筒中以减少泡沫的萎陷。在2、5、10、20和60分钟时测量泡沫体积。发泡性和泡沫稳定性的计算公式如下：
- 百分比发泡性 = (泡沫体积 / 原始溶液体积) × 100%
- 百分比泡沫稳定性 = (泡沫体积 / 原始溶液体积) × 100%
- 百分比泡沫稳定性（蛋白质）= (泡沫体积在时间 t 时的值 / 原始溶液体积在时间 t 时的值) × 100%

2.3.2 蛋白质分离物的乳化性能
根据对先前方法的轻微修改来制备和测量乳液。(19) 为了制备乳液，在50 mL离心管中向5 mL玉米油中加入0.5 mL的多酚储备溶液，然后加入4.5 mL的蛋白质储备溶液。不含蛋白质分离物的去离子水作为对照。因此，混合物的蛋白质浓度为4.1% (w/w)，而对照组没有蛋白质。混合物在4000 rpm下均质化2分钟（Omni Macro Homogenizer，Omni International，美国Georgia的Kennesaw）。将乳液倒入10 mL量筒，并用保鲜膜密封顶部。24小时后，测量分离相（水相）的体积。乳液稳定性的计算公式如下：
- 百分比乳液稳定性 = (原始水相体积 - 测量得到的水相体积) / 原始水相体积 × 100%

2.3.3 蛋白质分离物的凝胶化性能
根据先前的方法制备凝胶并分析其质地。(20) 在30 mL烧杯中，向13.5 mL的蛋白质储备溶液中加入1.5 mL的多酚储备溶液，该溶液使用了pH 5的柠檬酸缓冲液（0.1 M柠檬酸，0.2 M Na2HPO4，和0.05% sodium azide），并用磁力棒以400 rpm连续搅拌。因此，凝胶的蛋白质浓度为8.1% (w/w)。在溶液充分混合后（搅拌约1分钟），烧杯被双层铝箔覆盖，并置于90°C的水浴中加热75分钟。随后将烧杯在冰浴中冷却30分钟。冷却后，移除铝箔并改用聚膜封闭。凝胶在4°C下冷藏18-22小时。使用TA.XT Texture Analyzer（Stable Micro Systems，Godalming，英国）进行凝胶强度测量，测量时使用的探头为0.5英寸球形。分析设置包括预测试速度2毫米/秒、测试速度1毫米/秒、后测试速度2毫米/秒以及自动触发力5克。凝胶被压缩4毫米，记录下最大压力。

2.4 添加了多酚的脱脂奶油混合物的样品制备与分析
为了制备低脂奶油混合物，将奶油与脱脂乳按0%、10%、20%和30%（体积比）的比例混合，并在50°C下加热15分钟，分别得到脂质含量为36%、33%、29%和25%的溶液（见表S1）。然后将这些脱脂/奶油混合物在4000转/分钟的速度下均质化1分钟（Omni Macro Homogenizer，Omni International，Kennesaw，Georgia），然后在1°C下冷却至少2天，并在测试前再次进行短暂均质化。
为了评估多酚对低脂奶油功能性质的影响，按照Folin测定法（第2.2节）确定的5-20%（重量比）的多酚/蛋白质浓度将GTE或GSE加入到脱脂/奶油混合物中。提取物在加热奶油和脱脂乳混合物后但在均质化步骤之前加入。为了进一步确定有效的多酚添加方法，测试了两种方法：固态添加法，即直接将粉末状提取物加入混合物中；液态添加法，即在加入前先将粉末状提取物用水溶解。采用液态添加法时，脱脂乳的体积减少了相应的液态多酚体积。这样做可以确保固态和液态添加方法下的脂肪组成一致，并避免稀释造成的差异。由于100%奶油样品中不可避免地会发生稀释，因此进行了额外的对照分析，结果发现与未稀释的对照样品没有统计学差异。虽然两种方法都在5%重量比水平下进行了测试，但也对更高的添加比例进行了测试。GSE的添加比例为10%（重量比），而GTE的添加比例为20%（重量比），因为初步测试表明GTE在较低添加比例下效果不佳。

2.4.1 奶油-脱脂乳混合物的起泡性能
每个奶油样品取50毫升，在配备了一个搅拌器的Sunbeam 6速手动搅拌机上以6速进行搅打。由于脱脂乳与奶油的比例以及多酚添加量的不同，样品被搅打到形成均匀的质地（即出现硬质峰）。形成硬质峰的平均时间根据处理方式的不同而从32秒到232秒不等（见图S1）。

2.4.2 起泡过度
通过测量起泡奶油的泡沫体积与液体体积的比值来评估其起泡过度程度。记录等体积样品的液体质量和泡沫质量（使用1盎司/29.6毫升的舒芙蕾杯）。起泡过度百分比的计算公式如下：
%overrun = (liquid(g) ? foam(g)) / liquid(g) × 100%

2.4.3 排水性能
使用含有3个直径4.76毫米孔的16盎司/473毫升塑料杯制备起泡奶油样品。在搅打过程中用透明胶带覆盖孔洞。当形成硬质峰后，移除胶带，让泡沫样品静置2小时，然后测量排出的液体体积。泡沫稳定性计算的公式为：
%foam stability = (Vliquid before foaming ? Vliquid drained) / Vliquid before foaming × 100%

2.4.4 奶油-脱脂乳混合物的光学显微镜观察
采用Chang和Hartel描述的方法变体获取起泡奶油样品的空气细胞图像。（21）将少量（0.2-0.5毫升）起泡奶油样品放置在预装有约170微米凹陷的显微镜载玻片上。通过在载玻片两侧粘贴盖玻片形成凹陷，然后在其中放置样品。加入一滴分散液（50%戊醇：50%煤油，体积比）以获得更好的成像效果，随后小心地放置盖玻片。样品应在起泡后10分钟内进行成像。

2.4.5 奶油-脱脂乳混合物的流变学性质
为了研究多酚对低脂奶油流变学性质的影响，在流变仪（HR-2 Discovery Hybrid Rheometer，TA Instruments，New Castle，Delaware）上测试了80%奶油/20%脱脂乳的混合物（对照组和添加了5%多酚的处理组）。同时 also 测试了100%奶油样品作为黄金标准。向流变仪中加入23毫升样品，在35°C下从100秒^-1到10秒^-1的范围内分析动态粘度，测量时间在达到平衡后的5分钟。高温可以防止测量过程中奶油产生脂肪结晶。

2.5 统计分析
除非另有说明，所有处理和测试均重复三次。使用JMP Pro 15（SAS Institute，Cary，NC）进行统计分析。ANOVA用于检测处理效应。Dunnett检验用于在5%的显著性水平下比较各处理组与对照组之间的差异。

3. 结果与讨论
3.1 多酚的特性
通过Folin–Ciocalteu测定法，我们发现绿茶提取物（GTE）的总可溶性多酚含量为0.86克没食子酸当量（GAE）/克固体，而葡萄籽提取物（GSE）的含量为0.67克GAE/克固体（见表1）。同样，衍生的GTE和GSE的GAE含量分别为0.87克和0.59克/克固体。（22）由于大多数多酚提取物具有高度異質性，（23）比较不同来源的多酚也可能表明提取物中的特定多酚导致了独特的功能特性。花青素（PACs）因其对蛋白质和脂质功能的影响而成为主要研究的对象。（8,9,11,24）因此，使用HILIC方法比较了这两种提取物中的PAC组成。GSE中的PAC含量（0.24克/克固体）高于GTE（0.12克/克固体，见表1）。此外，GSE中的PAC主要是分子量（MW）大于10的聚合物，而GTE主要为单体（见表1；图S2），这一点之前已有报道。（8,22）基于先前的研究结果，（8,9）这表明GSE中的多酚更有可能通过非共价相互作用交联乳蛋白，而GTE中的多酚则更可能作为抗氧化剂通过氧化还原反应断裂S-S键，而不形成类似的交联。此外，MW较高的GSE更有可能改变奶油中的脂质性质。（11）

3.2 多酚对乳蛋白分离物功能的影响
我们研究了多酚对几种乳蛋白分离物（酪蛋白、乳清蛋白和牛奶蛋白分离物）的影响。不同多酚提取物的效果和程度存在差异（见图1），表明多酚的结构对其最终功能具有影响。以下小节探讨了多酚如何影响蛋白质的起泡、乳化及凝胶化性质。蛋白质的起泡性质与其搅打性能直接相关。（2）多酚对乳蛋白乳化性质的影响可以反映其对起泡奶油性质的影响，因为本研究中奶油的脂质含量较高（表S1中的25-36%）。虽然凝胶化性质不会直接影响搅打性能，但我们研究这一点是为了进一步了解多酚对蛋白质行为的影响，并可能指示起泡奶油的稳定性。

图1
图1. 不添加多酚（对照组）、1.0%葡萄籽提取物（GSE）或1.5%绿茶提取物（GTE）对酪蛋白、乳清蛋白和牛奶蛋白分离物溶液的功能性影响：（A）起泡性；（B）泡沫稳定性；（C）乳液稳定性；（D）凝胶强度。蛋白质浓度为泡沫和凝胶8.1%（重量比），乳液为4.1%（重量比）。泡沫稳定性在形成泡沫后60分钟测量。乳液稳定性在室温下静置24小时后测量。条形图上方的字母表示组间存在显著差异（p < 0.05）。误差条表示一个标准差。

如第2.3节所述，本研究中最终使用的多酚添加比例为1.0%（重量比）GSE和1.5%（重量比）GTE。因此，GTE处理的总可溶性酚类含量较高（0.129克GAE/毫升对比GSE的0.067克/毫升），而GSE的PAC比例也较高（36%对比GTE的13%，见表1）。虽然这限制了在相同添加比例下比较多酚的可能性，但使我们能够识别总多酚含量和PAC含量之间的差异。

3.2.1 多酚对起泡性能的影响
GTE和GSE对蛋白质的起泡性和泡沫稳定性有混合效应（见图1A,1B）。用GTE和GSE处理的酪蛋白溶液的起泡性分别比对照组高2.3倍和2.0倍（见图1A）。这可能是由于多酚能够交联酪蛋白胶束，从而形成界面层。已知多酚可以通过疏水相互作用与酪蛋白胶束相互作用，尽管氢键和静电相互作用也是可能的。（16）由于κ-酪蛋白部分通过空间位阻和静电排斥作用保持胶束分离，多酚可能与κ-酪蛋白相互作用，使其交联。最近的研究表明，咖啡中的PACs能抑制κ-酪蛋白的荧光，表明存在蛋白质-多酚相互作用，且这种抑制作用对κ-酪蛋白的抑制效果比其他乳蛋白成分更显著。（25）然而，多酚的添加降低了酪蛋白溶液的稳定性（见图1B）。这表明酪蛋白-多酚界面不够稳定；可能是蛋白质界面比粘弹性界面更脆弱。这一结果与最近的研究不同，那些研究表明GTE和GSE并未显著改变5%酪蛋白钠溶液的起泡性，尽管GSE能提高酪蛋白钠泡沫的稳定性。（26）这些研究结果之间的差异可能是由于酪蛋白类型（胶体酪蛋白 vs 酪蛋白钠）和蛋白质浓度（8.1% vs 5%）的不同所致。尽管我们使用的胶体酪蛋白中含有少量乳清（大约92%酪蛋白：8%乳清），（27）多酚对酪蛋白的影响与对乳清的影响明显不同（见图1A,1B），说明功能结果是由酪蛋白-多酚相互作用引起的。
虽然乳清蛋白溶液的起泡性未受多酚添加的影响（见图1A），但GTE处理后泡沫稳定性几乎翻倍（见图1B）。乳清本身具有较高的起泡性（对照组为126%），因此即使蛋白质发生交联，多酚也不太可能显著提高其起泡性。然而，GTE似乎增强了泡沫网络，而GSE则没有这种效果。此外，最近的研究发现GTE能提高乳清蛋白泡沫的稳定性而不改变起泡过度程度。（28）GTE主要是单体多酚，而GSE含有较高比例的聚合物（见表1）。由于单体多酚具有很强的抗氧化能力，GTE可能通过减少乳清蛋白中的S-S键来降低其活性（如EGCG添加后游离-SH含量的增加所示，（29）并提高了蛋白质在空气-水界面的灵活性，从而减缓了气泡的破裂。先前研究也表明，低MW的多酚可作为抗氧化剂通过还原S-S键来改善蛋白质的流动性。（14）

由于牛奶的蛋白质组成中酪蛋白占80%，乳清占20%，我们预期多酚会对乳蛋白分离物产生类似的影响。然而，结果发现多酚处理对乳蛋白分离物的起泡性没有显著影响（见图1A,1B）。可能有几个原因：首先，多酚的结合位点（例如酪蛋白上的κ-酪蛋白或疏水区域）可能不可用；其次，多酚优先与较大的蛋白质成分相互作用。（15）如果所有可用的多酚都与最大的蛋白质成分（BSA）结合，那么它们可能不会像预期的那样改变酪蛋白胶束。最后，多酚对酪蛋白和乳清蛋白的不同影响可能在乳蛋白分离物中相互抵消。

3.2.2多酚对乳化性质的影响
稳定高脂水包油乳液（如奶油）对于减少脂肪聚集和提高非打发形式的食用品质非常重要。多酚通常能够提高乳蛋白分离物的乳液稳定性，或者至少不会显著降低其稳定性（图1C）。添加GTE后，乳蛋白分离物的乳液稳定性显著提高了1.7倍；而添加GSE后，稳定性提高了2.4倍。无论是酪蛋白还是乳清蛋白，在GSE处理下其乳液稳定性都提升了一倍以上，但GTE并未显著提高稳定性（图1C）。蛋白质可以通过在油水界面吸附、降低界面压力以及形成稳定的粘弹性膜来稳定乳液。（30）先前的研究已经表明，蛋白质与多酚之间的交联可以增强蛋白质膜的结构。（14）有趣的是，研究发现GTE会降低β-乳球蛋白在界面处的吸附能力，因为蛋白质与多酚之间的交联使分子结构变得更为僵硬。（31）然而，在含有3% β-乳球蛋白的水包油乳液中，添加GTE可使乳液稳定性提高0.5%（按重量计）；但在多酚浓度更高（1%）时，乳液稳定性与未添加GTE的情况相当。（31）同样，GTE和乳清蛋白在低浓度（0.1%）下可以增强乳液稳定性，但在较高浓度（0.4%）下则会降低稳定性，这可能是由于多酚导致蛋白质氧化并破坏了乳液膜的结构。（32）因此，多酚的效果存在剂量依赖性，尤其是在多酚与乳清蛋白相互作用时。实验中使用的1.0%（按重量计）GSE有效，而1.5%的GTE却无效（图1C）。

我们的结果表明，GSE中较高分子量的多酚比GTE中的多酚更有利于促进乳蛋白稳定乳液的能力（图1C），这可能是由于它们与蛋白质之间的相互作用更强。（8,11）然而，用GTE和GSE（0–1000微克/毫升）处理钠酪蛋白溶液（0.5%）并未显著影响乳液的 whipped 指数（即乳液的稳定性指标）。（26）因此，多酚对蛋白质乳液稳定性的影响可能取决于蛋白质的种类（例如酪蛋白微粒或钠酪蛋白）以及多酚的剂量。尽管本研究未探讨这一点，但在乳液中使用的蛋白质-多酚复合物也可能改善酪蛋白和乳清的抗氧化性能。（33,32）未来的研究还应探索多酚与脂质之间的相互作用对乳液的影响。

3.2.3 多酚对凝胶性质的影响
多酚提高了某些乳蛋白的凝胶强度。但值得注意的是，所有乳蛋白分离物形成的凝胶强度都很低（压缩4毫米所需的力小于0.14牛顿，图1D），这可能是由于乳蛋白分离物的生产方法所致。（34）所有凝胶均是在酸性pH值（5.0）下并在90°C下加热75分钟形成的。乳蛋白分离物中的酪蛋白可能形成了酸性凝胶。当乳清蛋白在加热下变性后，它们可能与酪蛋白结合，从而增加体系的粘度和凝胶硬度。（35）即使初始凝胶强度较低，多酚处理也似乎没有显著改变这些乳蛋白分离物形成的凝胶（图1D）。同样，低浓度（0.1% 按重量计）的多酚添加到脱脂牛奶中并使用葡萄糖-δ-内酯（GDL）酸化后形成的凝胶，在28天储存期内，其凝胶强度或析水情况与对照组没有显著差异。（36）相反，在酸化且加热的脱脂牛奶凝胶中，可可多酚主要与乳清蛋白相互作用，从而破坏了乳清蛋白与酪蛋白之间的结合，削弱了凝胶结构。（37）这些结果与我们自己的研究结果存在差异，可能是因为处理顺序的不同。Vega和Grover（37）将脱脂奶粉加入可可多酚悬浮液中，然后加热（90°C 15分钟），再加入GDL进行酸化；而在我们的研究中，我们将多酚溶液加入pH 5的缓冲液中，然后加热（90°C 75分钟）。先前已有研究指出，多酚的添加方式可能会影响其效果。（38）此外，乳蛋白分离物的生产工艺可能导致蛋白质显著聚集，（34）这可能会阻碍蛋白质与多酚之间的相互作用。

在酪蛋白凝胶中，GTE和GSE处理均显著提高了凝胶强度（p < 0.05）（图1D）。GTE使酪蛋白凝胶的压缩强度提高了7倍，而GSE使凝胶强度提高了5倍，尽管这两种处理之间的差异并不显著。先前研究表明，GTE和GSE中的黄酮类化合物可以改变酪蛋白凝胶的性质。使用凝乳酶使脱脂牛奶凝固时，GTE中的主要多酚成分EGCG延长了凝胶形成时间，并降低了凝胶的弹性模量，部分原因是EGCG与酪蛋白结合并减少了κ-酪蛋白的酶解。（39）这些结果与我们的发现一致：多酚和酪蛋白可以强烈相互作用并改变凝胶性质。

在乳清蛋白分离物中，GSE使凝胶强度提高了2.2倍，而GTE则没有显著改变凝胶强度（图1D）。这表明GSE中的聚合物多酚能够与乳清蛋白交联并强化凝胶，而GTE中的主要单体多酚则没有这种效果，这与小麦蛋白基质中不同多酚大小的影响相似。（8）不过，这可能是由于使用的多酚浓度不同（即GSE在这种使用浓度下比GTE更有效）。其他研究还表明，GTE可以在pH 4.5和6.0下降低β-乳球蛋白的凝胶化温度。（40）此外，GTE还提高了β-乳球蛋白凝胶的弹性模量。（40）

3.3 多酚对低脂奶油起泡性质的影响
为了进一步研究多酚在乳制品系统中的影响，我们将GTE和GSE添加到奶油中，并将奶油（70–90% 按重量计）与脱脂牛奶（10–30% 按重量计）混合，以模拟低脂奶油（见表S1中的蛋白质和脂肪组成）。我们重点关注流变学和起泡效果，因为早期研究发现多酚对起泡性质有显著影响（第3.2.1节，图1）。正如预期的那样，增加对照组混合物中的脱脂牛奶含量会导致发泡性和泡沫稳定性下降（图2）。奶油形成泡沫需要更多的能量输入，但由于其高脂质含量，奶油泡沫更加稳定。（41）蛋白质容易形成气泡并捕获空气，而脂质则部分聚集以稳定结构。通过添加脱脂牛奶并降低脂质含量，低脂奶油的稳定性较差。多酚处理对打发样品的发泡性产生了混合效应（图2A），但GTE和GSE在几乎所有配方中都减缓了泡沫的流失（图2B）。据经验观察，过度打发未处理样品会导致奶油分层（即固相与液相分离），而经过GTE和GSE处理的样品在过度打发时没有出现这种情况。

图2
图2. 多酚（液体形式：总可溶性多酚/蛋白质为5%；固体形式：GSE为5%，GTE为10%）对低脂奶油（A）发泡性和（B）泡沫稳定性的影响。泡沫稳定性在形成后2小时测量。GTE = 绿茶提取物；GSE = 葡萄籽提取物。条形图上方的字母表示在脱脂牛奶与奶油比例范围内存在显著差异（p < 0.05）。误差条表示一个标准差。

为了确定多酚添加方式的影响，我们比较了相同浓度（5%）的固体和液体多酚提取物对发泡性的影响（图2）。唯一显著的差异（p < 0.05）出现在100%奶油样品中，液体GSE使发泡性降低了22%，而固体GSE仅降低了13%。可能是液体GSE在溶液中的流动性更强，能够更快地与奶油中的蛋白质和脂质发生反应。然而，我们没有进一步探究这一点。如第3.2.3节所述，多酚的添加顺序确实会影响其效果。（38）尽管多酚在加工过程中的添加顺序很重要，但我们的结果表明，多酚的添加形式（固体或液体）对最终结果的影响不大。因此，我们继续测试了不同浓度的固体提取物，因为这种形式更便于操作。同样，食品制造商也可能更倾向于以干形式添加多酚。

不同浓度的固体GTE和GSE（0–20%）添加改变了发泡性和泡沫稳定性（图2）。只有5% GSE处理显著降低了100%奶油样品的发泡性（p < 0.05），而其他处理与对照组无显著差异。在90%奶油样品中，10%脱脂牛奶处理与对照组相似，但20% GTE处理使发泡性提高了28%（图2A）。值得注意的是，在80%奶油和20%脱脂牛奶混合物中，5% GTE和20% GTE分别使泡沫过度膨胀增加了1.7倍和2.4倍，而5% GSE和10% GSE分别使泡沫过度膨胀增加了1.4倍和2.0倍。

总体而言，多酚添加提高了泡沫稳定性（图2B），但从未显著降低它。高浓度GTE处理（20%）在0–20%脱脂牛奶样品中120分钟内未观察到泡沫流失，这比相应比例的对照组有所改善。当脱脂牛奶比例增加到30%时，同一处理使泡沫稳定性提高了77%，但仍低于对照组（80%）。同样，高浓度GSE处理（10%）在30%脱脂牛奶中增强了泡沫稳定性，但在30%脱脂牛奶时泡沫稳定性又回到了对照组水平。这与我们的凝胶强度数据一致，表明GTE和GSE通常能提高乳蛋白凝胶的稳定性，但从未显著降低其强度（图1D）。

因此，我们的数据表明，富含多酚的植物提取物（GTE和GSE）通过增加泡沫过度膨胀和减少泡沫流失来改善低脂奶油的功能性（图2），这可能是通过多酚与乳蛋白和脂质的相互作用实现的。这可能是一个复杂的多因素体系，而不仅仅是单一机制。我们发现GTE和GSE提高了酪蛋白的发泡性（图1A），但多酚对酪蛋白泡沫稳定性的影响不一（图1B）。这表明奶油中的脂肪对低脂奶油的稳定性有重要影响。最近的研究表明，GSE和单宁酸可以与奶油中的蛋白质和脂质相互作用，导致奶油变稠和凝胶化。（11,12）具体来说，随着GSE分子量的增加，GSE与奶油之间的相互作用更强。（11）此外，GTE及其所含的多酚成分（包括 catechin和EGCG）与乳脂球相互作用，增加了乳脂球的体积和ζ-电位。（13）虽然这些研究没有研究起泡效果，但它们表明多酚可以改变奶油结构，包括通过诱导脂肪球聚集体。同样，我们发现GSE显著提高了酪蛋白、乳清蛋白和乳蛋白分离物的乳液稳定性，而GTE提高了乳蛋白分离物的稳定性（图1C）。尽管如此，仍需进一步研究多酚与奶油成分的相互作用，特别是多酚与脂质和多酚与蛋白质-脂质的相互作用。

为了观察泡沫结构，我们在显微镜下观察了部分样品。仅比较了添加了5%（按重量计）葡萄籽和绿茶提取物的0%、20%和30%脱脂牛奶混合物的泡沫性质。由于10%脱脂牛奶混合物的发泡性质与0%混合物相似，因此没有对其进行观察。所有100%奶油样品（对照组、GTE和GSE，图3）显示出相似的结构，视野中几乎充满了许多小气泡（<50微米）以及少量中等大小的气泡（50–100微米）。同样，在研究打发时间对气泡结构的影响时，打发9分钟的奶油显示大多数气泡直径小于50微米（平均直径=12微米，最大直径=136微米）。（4）对照组和GTE样品的发泡性相似，而GSE样品的发泡性略有降低（图2A）。每种样品的泡沫稳定性也相似，其中对照组的最低，而经过GTE处理的样品具有最高的稳定性（图2B）。因此，在100%奶油样品中，泡沫性和泡沫稳定性的差异并不足以在显微镜下直接观察到，除非进行进一步分析。然而，80%奶油和20%脱脂混合物的泡沫结构确实显示出处理后的变化（图3）。对照组的低脂泡沫主要由中等大小的泡沫组成，还有一些小气泡；而经过GTE和GSE处理的样品则主要由小气泡组成，其中含有少量中等到大的气泡。这表明经过处理的低脂样品能够形成更独立的气泡，这与我们的发现一致，即多酚处理的样品具有更高的泡沫性和泡沫稳定性（图2）。然而，多酚仍然需要大量的脂质来显著稳定泡沫结构。70%奶油和30%脱脂牛奶样品的稳定性太差，无法提供一致的图像（数据未显示），这与它们比高比例奶油混合物更低的泡沫性和稳定性相符（图2）。这支持了我们的假设，即多酚能够在空气-水界面支撑蛋白质以及脂质簇，从而减小气泡的大小和/或减少气泡的聚结。未来的工作应使用软件来分析图像，以便更准确地评估泡沫结构。

图3. 固态形式添加的多酚（总可溶性多酚/蛋白质0%或5% w/w）对全脂和低脂奶油微观结构的影响，使用光学显微镜观察。黑色条 = 250 μm。GTE = 绿茶提取物。GSE = 葡萄籽提取物。
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3.4. 多酚对低脂奶油流变学的影响
为了了解剪切作用如何影响样品的粘度，分析了不含多酚（对照组）或含有5% GTE或GSE的80%奶油和20%脱脂牛奶混合物在剪切过程中相对于100%奶油样品（黄金标准）的动态粘度。选择这些样品是为了补充显微镜分析，因为80%奶油和20%脱脂牛奶混合物与100%奶油相比在发泡性能上有显著差异，同时保持了足够的稳定性。80%奶油和20%脱脂牛奶对照组以及100%奶油样品表现出牛顿流变行为（图4）。这些样品在35°C下进行分析，该温度高于大多数乳脂的熔点，因此乳脂处于液态，无法形成乳脂层。（42）在这种情况下（相对较高的温度和脂质含量<40%），乳制品通常表现出牛顿流变行为。（43）然而，GTE和GSE处理后的样品表现出剪切稀释行为，其中GTE的稀释效果比GSE更明显（图4）。这支持了我们的发现，即多酚处理通过增加粘度来提高泡沫稳定性（图2B）。剪切稀释是奶油在较低剪切速率和温度下的典型行为，此时脂肪颗粒会聚集在一起，（43）表明多酚复制了乳脂的一些流变特性。由于我们的未搅拌样品是稀液体，并且仅通过机械充气形成了半固态泡沫结构，因此我们研究了动态粘度。不过，最近有其他研究指出纯多酚可以显著增稠或凝胶化奶油，因此他们研究了复合粘度（粘性液体对流动的阻力）。（11,12）例如，单宁酸被证明可以增加重奶的复合粘度，并且这种效应与剂量有关；即，从0.75%到3.0%的单宁酸会导致更高的粘度。（12）

图4. 固态形式添加的多酚（0%或5% w/w）对35°C下测量的20%脱脂牛奶/80%奶油混合物动态粘度的影响，以抑制相变（即 butter 形成）。对照组 = 未处理。GTE = 绿茶提取物。GSE = 葡萄籽提取物。100%奶油 = 用于比较。误差条表示一个标准差（由于变异性低，某些误差条可能不可见）。
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我们进一步发现，在所有剪切速率下，GTE的粘度都高于其他处理组：例如，在50 s-1时，GTE = 14.8 ± 1.12 cP，而GSE = 4.9 ± 0.32 cP，对照组 = 4.0 ± 0.10 cP，100%奶油 = 6.6 ± 0.10 cP（图4）。这表明多酚的组成改变了奶油的粘度。GTE和GSE均以5%（w/w）的多酚/蛋白质比例添加。然而，GTE中低分子量多酚的比例高于GSE（表1）。在一项关于GSE对奶油影响的研究中，只有DP > 5的多酚（即大PACs）增加了奶油的复合粘度。（11）但是，添加未经修饰或纯化的GSE并未影响复合粘度。（11）虽然先前的结果表明大PACs可以产生增稠效应，我们也发现GTE可以使溶液增稠。因此，多酚组成对粘度的影响是复杂的，需要进一步研究。

本研究的局限性及未来工作的建议包括：（1）深入表征多酚组成并在等摩尔条件下进行比较，可以增强对机制的理解。（2）多酚可以与蛋白质和脂质相互作用，但这些相互作用与三级相互作用（多酚-蛋白质-脂质）之间的相互作用尚不完全清楚。需要更多的工作来理解和调节多酚与奶油成分之间的复杂动态关系，以适应所需的应用。（3）需要评估多酚添加到奶油中的长期稳定性。（4）需要进行经济分析，以确定市场能承受的多酚富集提取物的纯化和添加水平。（5）在工业应用之前，需要进行感官分析：根据使用水平的不同，多酚可能会影响口味，特别是收敛性和苦味以及颜色。