朝着非酶促糖异生方向的发展：一锅反应与模型系统

《JACS Au》：Progress toward a Nonenzymatic Gluconeogenesis: One-Pot Reactions and Model Systems

　　高分辨率图片
下载MS PowerPoint幻灯片

通过系统发育学可以重建的最早细胞是利用糖异生作用将酮酸转化为糖的。关于生命起源的代谢理论认为，包括糖异生在内的代谢途径是非酶促过程遗留下来的结果。然而，究竟哪些条件可能允许非酶促糖异生发生至今仍不清楚。在这里，我们探讨了金属和pH值对糖异生反应非酶促版本的影响。我们开发了将磷酸烯醇式丙酮酸转化为3-磷酸甘油酸以及将果糖-1,6-二磷酸转化为葡萄糖-6-磷酸的一锅法条件。我们还利用模型化合物验证了将酰基磷酸酯转化为硫酯并进一步还原为醛的反应序列，这一序列同样出现在1,3-二磷酸甘油酸转化为甘油醛-3-磷酸的过程中。我们的发现表明，能够启动非酶促糖异生的环境需要同时具备酸性和碱性催化作用，这意味着问题超出了单纯溶液化学的范畴。

糖异生是生命构建糖类的代谢途径。它在所有现存生命的最后共同祖先（LUCA）中就已经存在（1,2），因此已经存在了大约40亿年（3）——这几乎是从基因记录中可以追溯到的最古老的时间。其中，Embden–Meyerhof–Parnas途径（即糖异生/糖酵解途径）尤为重要，因为它在生命的三个域中都得到了保留和演化（4）。该途径将CO2固定循环中的简单C3和C4酮酸（如丙酮酸或草酰乙酸）转化为C6糖磷酸盐（己糖）。糖异生的最终产物葡萄糖-6-磷酸（G6P）通过戊糖磷酸途径进一步转化为其他戊糖磷酸盐。己糖和戊糖既是结构成分，也是能量来源和构建模块。戊糖磷酸盐构成了核苷酸的骨架，而核苷酸是遗传物质的基本构成单位（5），从而将代谢和遗传联系在一起（图1）。尽管在早期地球上也可能存在其他非酶促反应产生糖类（最著名的是福尔莫斯反应（6?8）），但这些反应并不遵循糖异生途径，因此无法提供有关其起源的进化线索。关于生命起源的代谢理论认为，一个自组织的化学反应网络是由一系列受地球化学过程和催化作用驱动的特定机制演变而来的（1,5,9?18）。

图1展示了从磷酸烯醇式丙酮酸到葡萄糖-6-磷酸的糖异生关键中间体，随后通过戊糖磷酸途径生成核糖-5-磷酸。

这个自组织的反应网络被认为预先形成了包括糖异生在内的核心生物途径。为了评估和完善这一假设，人们使用无机物质作为催化剂或促进剂，在非酶促条件下研究了核心代谢途径中的许多反应（19?36）。然而，尚不清楚哪些类型的条件或环境能够实现非酶促糖异生。糖异生的某些步骤已经被非酶促方式再现（18,20,21,37?40），但尚未报道过一锅法条件，而且有些步骤在非酶促背景下完全未被探索。例如，将3-磷酸甘油酸中的羧基团转化为甘油醛-3-磷酸中的醛基团的反应序列，在糖异生中尚未解决，在前生物化学中也是一个未解决的问题（图2）。这一反应序列不仅发生在糖异生过程中，也可能与LUCA的代谢有关，但目前没有前生物学上的对应过程（41,42）。

我们认为，这种自组织的反应网络为包括糖异生在内的核心生物途径奠定了基础。为了寻找水环境中复杂反应网络运行的条件（44），我们发现了可以在单一反应容器中连续进行反应的“一锅法”条件。利用模型化合物，我们还发现了将酰基磷酸酯转化为硫酯，最终转化为醛的反应的水相条件（这些反应序列同样存在于糖异生过程中）。

图2展示了目前已知的非酶促糖异生成葡萄糖-6-磷酸的方法，其中非酶促变体用绿色和橙色点标示，而3-磷酸甘油酸的前生物化学还原为甘油醛-3-磷酸的过程尚不清楚（用红色点标示）。

**磷酸烯醇式丙酮酸到3-磷酸甘油酸的一锅法非酶促转化**
丙酮酸通过三步转化为3-磷酸甘油酸（3PGA）。首先，丙酮酸被转化为磷酸烯醇式丙酮酸（PEP），其水合产生2-磷酸甘油酸（2PGA）；2PGA的异构化随后生成3PGA。我们最近的一项机制研究表明，丙酮酸可以通过羧基磷酸化 followed by 分子内磷酸转移转化为PEP（18）。然而，这种转化在水中对水条件非常敏感，必须在固态下进行，这限制了其在前生物化学中的相关性。相比之下，PEP可以在温和条件下（pH 8, 25–75 °C）使用简单试剂（铁、NaHCO3、焦磷酸和氧气）转化为2PGA（37）。虽然早在20世纪50年代就有人在pH < 1、温度 ≥ 75 °C的条件下报道了2PGA的异构化生成3PGA（38），但由于当时的技术限制，该反应仅通过偏振法进行了表征而未进行定量分析。因此，关于这种转化的边界及其与前生物化学糖异生的兼容性仍不明确。

我们首先通过测试2PGA在水中的pH值转化成3PGA所需的条件开始了研究（图3）。结果显示，在pH < 2时，经过16小时反应后仅生成少量3PGA（产率为4%）。在25 °C且pH < 2的条件下，48小时后仅检测到微量3PGA。最佳结果是在70 °C下经过120小时后获得的，2PGA转化率为88%，3PGA产率为53%（详见表S2）。主要副产物是甘油酸（GA），它来源于2-或3-PGA的脱磷酸化。有趣的是，某些激酶能够将甘油酸重新转化为2-或3-PGA，因此一些生物可以利用甘油酸作为糖异生的底物（45,46）。此外，我们还评估了金属对反应的影响，因为金属常作为前生物化学反应的催化剂（20,23,24,26,30,31,35,47?49）。在60 °C的低温且无酸化条件下，没有任何金属能够催化3PGA的形成（表S1），排除了这些金属作为催化剂的可能性。我们还观察到了3PGA的各种副反应，特别是在Cu(I或II)、Zn(II)和Fe(III)的存在下发生了脱磷酸化，而Mg(II)、Al(III)和Ca(II)则较为兼容，仅出现少量沉淀。

接下来，我们研究了从PEP到3PGA的一锅法反应序列的可能性。由于同时需要碱性和酸性条件，这一步骤似乎具有挑战性。因此，我们尝试从PEP开始开发两步法序列（图3）。在我们的水合条件下（48 mM PEP、2 equiv Na4O7P2、5 equiv NaHCO3、2 equiv Fe(0)），2PGA在70 °C下反应16小时后生成（图4），然后手动将反应混合物调节至pH 1并保持在这一温度下48小时，结果检测到3PGA的产率为7%，同时生成了2PGA和GA，产率分别为11%和3%。PEP水合的副产物（甘油酸和乙酸）也存在于反应混合物中（图4，详见表S3）。因此，在大量水中实现PEP到3PGA的无干预非酶促转化似乎不太可能，应寻找能够产生自然pH梯度的环境，例如热液喷口（50）。

**非酶促羧基还原**
与3-磷酸甘油酸的形成不同，水中的甘油醛-3-磷酸（G3P）的形成尚未被详细描述。该过程首先使用ATP对3-磷酸甘油酸的羧基进行磷酸化（步骤4，图2），生成1,3-二磷酸甘油酸（1,3BPG）（51）。接下来，在半胱氨酸存在下，1,3BPG的酰基部分发生硫酯化，形成相应的硫酯中间体（步骤5，图2）（52）。最后，甘油醛-3-磷酸脱氢酶利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸+氢（NADH）作为氢供体催化硫酯中间体还原为G3P（步骤6，图2）（43）。这三个酶促步骤在前生物化学背景下均无先例，即使是在糖异生之外也是如此：酰基磷酸的硫酯化（步骤5）和选择性硫酯还原为醛（步骤6）。然而，已知酰基磷酸可以在前生物化学条件下形成（53?55），并且我们最近还报道了乙酸的磷酸化（56）。因此，我们专注于步骤5和6。酰基磷酸的硫酯化和硫酯还原在代谢中是常见的反应机制（60），所以它们的前生物化学可行性具有重要意义（60）。步骤5和6的具体反应序列在脂肪醛生物合成中也有体现（61），系统发育学研究表明，硫酯还原（磷脂膜合成中的关键步骤HMG-CoA还原酶）很可能存在于LUCA的代谢中（61,62）。虽然1,3BPG在商业上不可获得，且纯1,3BPGA的制备方法未知，但我们使用了丙酰 phosphate（AcP）作为酰基供体。我们首先寻找允许HSCy与AcP发生硫酯化的条件。在水溶液中，除了琥珀酰 phosphate的一个特例涉及锚定辅助外，酰基磷酸酯如AcP通常被认为对硫醇不反应（63）。因此，目前对于羰基磷酸酯的硫酯化，研究的是AcP(O)O2R–类化合物，而不是其更简单的类似物（64）。使用AcP作为反应物，我们发现在pH约7的碱性或酸性条件下，HSCy（25 mM）与AcP（2 equiv）在咪唑（Im, 2 equiv）存在下可以反应生成S-乙酰-N-乙酰半胱氨酸（AcSCy）（产率为17–30%，通过1H NMR光谱验证，详见表S4）。咪唑基团以组氨酸的形式存在于酶的活性位点，在硫酯化过程中可能起到碱、试剂或催化剂的作用。为了进一步验证这些可能性，我们在磷酸缓冲液中研究了该反应。在pH 6（100 mM KPi）条件下，HSCy（25 mM）与AcP（2 equiv）在Im（1 equiv）存在下反应24小时后，AcSC的产率为16%（方案1a）。延长反应时间至72小时后，AcP的最大转化率为26%（方案1a，条目2）；即使将Im的用量减少至亚化学计量量（0.25 equiv），在25 °C下仍有9%的转化率（方案1a，条目6）。

标准反应条件：50 mM 锂钾乙酰磷酸盐、25 mM N-乙酰半胱氨酸、咪唑（1 equiv），在0.1 M 磷酸缓冲液中，pH 6，25 °C，24小时（在氮气环境下）。产率通过定量1H NMR光谱测定，以邻苯二甲酸钾作为内部标准，并代表至少两次实验的平均值。虽然Im可能是催化剂，但由于AcP的分解超过了副产物的生成，未能观察到明显的转化。初步的时间进程实验表明Im可能是一种更高阶的催化剂（方案1，详见图S11）。这一结果在葡萄糖异生作用之外也同样重要，因为通过羰基磷酸酯对羧酸酯进行硫酯化是生成硫酯的主要代谢反应之一（酸-硫醇连接酶，EC 6.2.1），并且参与了多个核心代谢途径，包括（r）TCA循环、脂质代谢、氨基酸代谢以及丙酮酸和甲烷代谢。（57,59）受到这些结果的鼓舞，我们接下来寻找了可以将简单硫酯（例如S-乙基硫乙酸酯，AcT和CH3(O)SCH2CH3）还原为相应醛的条件。尽管在原生物化学背景下这是前所未有的，但这种转化在有机化学中已经得到广泛研究，其中使用了温和的硅烷基氢化物供体与过渡金属结合（Fukuyama还原）。因此，我们着手将这一反应适应到更具有原生物学相关性的条件下，这面临两个主要挑战。首先，使用H2代替硅烷作为还原剂，因为在Fukuyama反应中H2通常会导致硫酯过度还原为醇。其次，是在水溶液中进行反应。有趣的是，我们最近发现多种Ni盐可以在水中使用H2进行代谢还原（27），并且Fukuyama反应最近也被改进为在水胶束条件下的Ni催化剂使用（65）。因此，我们筛选了一系列金属，在5巴H2的压力下，在碱性条件下还原AcT（25 mM）。令人满意的是，室温和48小时后，在1当量的Ni/SiO2–Al2O3存在下观察到了15%的乙醛（Acd及其水合形式Acd·H2O）的生成，而没有过度还原为醇（见示意图2，详细信息见表S8）。减少Ni/SiO2–Al2O3的用量对还原产物的生成几乎没有影响（见表S8，条目5-7）。在Ni/C存在下也获得了类似的结果（见表S8，条目4）。其他测试的金属，如Fe或Co，则无效（见表S8）。此外，这些条件也不适用于将AcP还原为Acd（见示意图2，条目7），尽管AcT和AcP都被认为是高能化合物。虽然负载型的镍催化剂提供了更高的产率，但使用镍(0)时观察到的微量产物也很有趣，因为镍被认为在Wood–Ljungdahl途径中促进了非酶促的CO2同化（26），并且是LUCA代谢中的必需金属（1），并且在[NiFe]氢化酶中仍然存在（66）。在空气条件下，其他还原剂如NaBH3CN（用于在非酶促水条件下将羰基还原为羟基）（30）也不能有效还原硫酯或酰基磷酸酯（见示意图2，条目6）。未负载的金属镍也能产生预期的产物，尽管产量很少（见示意图2，条目5）。

这种结果在葡萄糖异生作用之外也很重要，因为通过羰基磷酸酯对羧酸酯进行硫酯化是生成硫酯的主要代谢反应之一（酸-硫醇连接酶，EC 6.2.1），并且参与了多个核心代谢途径，包括（r）TCA循环、脂质代谢、氨基酸代谢以及丙酮酸和甲烷代谢。（57,59）受这些结果的鼓舞，我们接下来寻找了可以将简单硫酯（即S-乙基硫乙酸酯，AcT和CH3(O)SCH2CH3）还原为相应醛的条件。尽管在原生物化学背景下这是前所未有的，但这种转化在有机化学中已经得到广泛研究，其中使用了温和的硅烷基氢化物供体与过渡金属结合（Fukuyama还原）。因此，我们试图将这一反应适应到更具有原生物学相关性的条件下，这面临两个主要挑战。首先，使用H2而不是硅烷作为还原剂，因为在Fukuyama反应中H2通常会导致硫酯过度还原为醇。其次，在水溶液中进行反应。有趣的是，我们最近发现多种Ni盐可以在水中使用H2进行代谢还原（27），并且Fukuyama反应最近也被改进为在水胶束条件下的Ni催化剂使用（65）。因此，我们筛选了一系列金属，在5巴H2的压力下，在碱性条件下还原AcT（25 mM）。令人满意的是，在室温下经过48小时后，观察到15%的乙醛（Acd及其水合形式Acd·H2O）的生成，同时没有过度还原为醇（见示意图2，详细信息见表S8）。减少Ni/SiO2–Al2O3的用量对还原产物的生成几乎没有影响（见表S8，条目5-7）。在Ni/C存在下也获得了类似的结果（见表S8，条目4）。其他测试的金属，如Fe或Co，则无效（见表S8）。此外，这些条件也不适用于将AcP还原为Acd（见示意图2，条目7），尽管AcT和AcP都被认为是高能化合物。虽然负载型的镍催化剂提供了更高的产率，但使用镍(0)时观察到的微量产物也很有趣，因为镍被认为在Wood–Ljungdahl途径中促进了非酶促的CO2同化（26），并且在LUCA的代谢中是必需的金属（1），并且仍然存在于[NiFe]氢化酶中（66）。在空气条件下，其他还原剂如NaBH3CN（用于在非酶促水条件下将羰基还原为羟基）（30）也不能有效还原硫酯或酰基磷酸酯（见示意图2，条目6）。未负载的金属镍也能够产生预期的产物，尽管产量很少（见示意图2，条目5）。

这个结果在葡萄糖异生作用之外也很重要，因为通过羰基磷酸酯对羧酸酯进行硫酯化是生成硫酯的主要代谢反应之一（酸-硫醇连接酶，EC 6.2.1），并且参与了多个核心代谢途径，包括（r）TCA循环、脂质代谢、氨基酸代谢以及丙酮酸和甲烷代谢。（57,59）受到这些结果的鼓舞，我们接下来寻找了可以将简单硫酯（例如S-乙基硫乙酸酯，AcT和CH3(O)SCH2CH3）还原为相应醛的条件。尽管在原生物化学背景下这是前所未有的，但这种转化在有机化学中已经得到广泛研究，其中使用了温和的硅烷基氢化物供体与过渡金属结合（Fukuyama还原）。因此，我们着手将这一反应适应到更具有原生物学相关性的条件下，这面临两个主要挑战。首先，使用H2代替硅烷作为还原剂，因为在Fukuyama反应中H2通常会导致硫酯过度还原为醇。其次，在水溶液中进行反应。有趣的是，我们最近发现多种Ni盐可以在水中使用H2进行代谢还原（27），并且Fukuyama反应最近也被改进为在水胶束条件下的Ni催化剂使用（65）。因此，我们筛选了一系列金属，在5巴H2的压力下，在碱性条件下还原AcT（25 mM）。令人满意的是，在室温下经过48小时后，观察到15%的乙醛（Acd及其水合形式Acd·H2O）的生成，同时没有过度还原为醇（见示意图2，详细信息见表S8）。减少Ni/SiO2–Al2O3的用量对还原产物的生成几乎没有影响（见表S8，条目5-7）。在Ni/C存在下也获得了类似的结果（见表S8，条目4）。其他测试的金属，如Fe或Co，则无效（见表S8）。此外，这些条件也不适用于将AcP还原为Acd（见示意图2，条目7），尽管AcT和AcP都被认为是高能化合物。虽然负载型的镍催化剂提供了更高的产率，但使用镍(0)时观察到的微量产物也很有趣，因为镍被认为在Wood–Ljungdahl途径中促进了非酶促的CO2同化（26），并且在LUCA的代谢中是必需的金属（1），并且在[NiFe]氢化酶中仍然存在（66）。在空气条件下，其他还原剂如NaBH3CN（用于在非酶促水条件下将羰基还原为羟基）（30）也不能有效还原硫酯或酰基磷酸酯（见示意图2，条目6）。未负载的金属镍也能够产生预期的产物，尽管产量很少（见示意图2，条目5）。

这个结果在葡萄糖异生作用之外也很重要，因为通过羰基磷酸酯对羧酸酯进行硫酯化是生成硫酯的主要代谢反应之一（酸-硫醇连接酶，EC 6.2.1），并且参与了多个核心代谢途径，包括（r）TCA循环、脂质代谢、氨基酸代谢以及丙酮酸和甲烷代谢。（57,59）受到这些结果的鼓舞，我们接下来寻找了可以将简单硫酯（例如S-乙基硫乙酸酯，AcT和CH3(O)SCH2CH3）还原为相应醛的条件。尽管在原生物化学背景下这是前所未有的，但这种转化在有机化学中已经得到广泛研究，其中使用了温和的硅烷基氢化物供体与过渡金属结合（Fukuyama还原）。因此，我们着手将这一反应适应到更具有原生物学相关性的条件下，这面临两个主要挑战。首先，使用H2代替硅烷作为还原剂，因为在Fukuyama反应中H2通常会导致硫酯过度还原为醇。其次，在水溶液中进行反应。有趣的是，我们最近发现多种Ni盐可以在水中使用H2进行代谢还原（27），并且Fukuyama反应最近也被改进为在水胶束条件下的Ni催化剂使用（65）。因此，我们筛选了一系列金属，在5巴H2的压力下，在碱性条件下还原AcT（25 mM）。令人满意的是，在室温下经过48小时后，观察到15%的乙醛（Acd及其水合形式Acd·H2O）的生成，同时没有过度还原为醇（见示意图2，详细信息见表S8）。减少Ni/SiO2–Al2O3的用量对还原产物的生成几乎没有影响（见表S8，条目5-7）。在Ni/C存在下也获得了类似的结果（见表S8，条目4）。其他测试的金属，如Fe或Co，则无效（见表S8）。此外，这些条件也不适用于将AcP还原为Acd（见示意图2，条目7），尽管AcT和AcP都被认为是高能化合物。虽然负载型的镍催化剂提供了更高的产率，但使用镍(0)时观察到的微量产物也很有趣，因为镍被认为在Wood–Ljungdahl途径中促进了非酶促的CO2同化（26），并且在LUCA的代谢中是必需的金属（1），并且在[NiFe]氢化酶中仍然存在（66）。在空气条件下，其他还原剂如NaBH3CN（用于在非酶促水条件下将羰基还原为羟基）（30）也不能有效还原硫酯或酰基磷酸酯（见示意图2，条目6）。未负载的金属镍也能够产生预期的产物，尽管产量很少（见示意图2，条目5）。

这个结果在葡萄糖异生作用之外也很重要，因为通过羰基磷酸酯对羧酸酯进行硫酯化是生成硫酯的主要代谢反应之一（酸-硫醇连接酶，EC 6.2.1），并且参与了多个核心代谢途径，包括（r）TCA循环、脂质代谢、氨基酸代谢以及丙酮酸和甲烷代谢。（57,59）受到这些结果的鼓舞，我们接下来寻找了可以将简单硫酯（例如S-乙基硫乙酸酯，AcT和CH3(O)SCH2CH3）还原为相应醛的条件。尽管在原生物化学背景下这是前所未有的，但这种转化在有机化学中已经得到广泛研究，其中使用了温和的硅烷基氢化物供体与过渡金属结合（Fukuyama还原）。因此，我们着手将这一反应适应到更具有原生物学相关性的条件下，这面临两个主要挑战。首先，使用H2代替硅烷作为还原剂，因为在Fukuyama反应中H2通常会导致硫酯过度还原为醇。其次，在水溶液中进行反应。有趣的是，我们最近发现多种Ni盐可以在水中使用H2进行代谢还原（27），并且Fukuyama反应最近也被改进为在水胶束条件下的Ni催化剂使用（65）。因此，我们筛选了一系列金属，在5巴H2的压力下，在碱性条件下还原AcT（25 mM）。令人满意的是，在室温下经过48小时后，观察到15%的乙醛（Acd及其水合形式Acd·H2O）的生成，同时没有过度还原为醇（见示意图2，详细信息见表S8）。减少Ni/SiO2–Al2O3的用量对还原产物的生成几乎没有影响（见表S8，条目5-7）。在Ni/C存在下也获得了类似的结果（见表S8，条目4）。其他测试的金属，如Fe或Co，则无效（见表S8）。此外，这些条件也不适用于将AcP还原为Acd（见示意图2，条目7），尽管AcT和AcP都被认为是高能化合物。虽然负载型的镍催化剂提供了更高的产率，但使用镍(0)时观察到的微量产物也很有趣，因为镍被认为在Wood–Ljungdahl途径中促进了非酶促的CO2同化（26），并且在LUCA的代谢中是必需的金属（1），并且在[NiFe]氢化酶中仍然存在（66）。在空气条件下，其他还原剂如NaBH3CN（用于在非酶促水条件下将羰基还原为羟基）（30）也不能有效还原硫酯或酰基磷酸酯（见示意图2，条目6）。未负载的金属镍也能够产生预期的产物，尽管产量很少（见示意图2，条目5）。

在生物化学中，3PGA还原为G3P后，G3P会异构化为DHAP（ΔG0 = ?7.1 kJ·mol–1）（69）。接下来，G3P和DHAP之间的缩醛反应生成所需的果糖-1,6-二磷酸（FBP，ΔG0 = ?23.8 kJ·mol–1）（70）。这两个反应都是有利的，但主要障碍在于底物的不稳定性。已经证明，G3P向DHAP的酶促和非酶促异构化遵循相同的基本步骤，生成一个共同的烯二醇中间体（图5）（71）。除了异构化之外，这个烯二醇中间体还会发生不可逆的β-消除反应，生成甲基乙二醛（图5）（39,72）。这些过程（通过烯二醇和消除）是由碱催化的，速率常数分析显示，在pH 6到9的范围内消除反应优先进行（39）。因此，我们首先在pH < 5的条件下评估了异构化反应，但没有检测到产物。相反，只观察到了分解产物甲基乙二醛，后者进一步转化为乳酸（表S10和图S15）。开发一种有效的非酶促异构化方法将非常有用，因为接下来的G3P和DHAP之间的缩醛反应需要在碱性条件下进行，以抵消底物的分解（21）。在这里，我们发现更广泛的条件可能适合这一反应，因为在pH 5的条件下，通过HRMS检测到G3P和DHAP之间缩醛偶联的特征质量峰值（图5，详细信息见表S11和图S16）。当然，在这些微量水平下，无法确定产物的确切身份，尤其是它们的区域和立体化学结构。未来，找到增强三糖磷酸酯异构化的条件将是关键，最近的研究表明非大量水溶液条件可以促进相关生物糖类的交叉缩醛和异构化（73）。有趣的是，酶通过一个结构复杂的活性位点促进这种异构化，使Glu和His残基参与酸-碱催化机制，而不是仅由碱催化的非酶促机制。这突显了局部pH梯度对这类反应的重要性。

在生物学中，3PGA还原为G3P后，G3P会异构化为DHAP（ΔG0 = ?7.1 kJ·mol–1）（69）。接下来，G3P和DHAP之间的缩醛反应生成所需的果糖-1,6-二磷酸（FBP，ΔG0 = ?23.8 kJ·mol–1）（70）。这两个反应都是有利的，但主要障碍在于底物的不稳定性。已经证明，G3P向DHAP的酶促和非酶促异构化遵循相同的基本步骤，生成一个共同的烯二醇中间体（图5）（71）。除了异构化外，这个烯二醇中间体还会发生不可逆的β-消除反应，生成甲基乙二醛（图5）（39,72）。这些过程（通过烯二醇和消除）是由碱催化的，速率常数分析显示，在pH 6到9的范围内消除反应更为有利（39）。因此，我们首先在pH < 5的条件下评估了异构化反应，但没有检测到产物。相反，只观察到了分解产物甲基乙二醛，后者进一步转化为乳酸（表S10和图S15）。开发一种有效的非酶促异构化方法将非常重要，因为接下来的G3P和DHAP之间的缩醛反应需要在碱性条件下进行，以抵消底物的分解（21）。然而，在这些微量水平下，无法确定产物的确切身份，尤其是它们的区域和立体化学结构。未来，找到增强三糖磷酸酯异构化的条件将是关键，最近的研究表明非大量水溶液条件可以促进相关生物糖类的交叉缩醛和异构化（73）。有趣的是，酶通过一个结构复杂的活性位点促进这种异构化，使Glu和His残基参与酸-碱催化机制，而不是仅由碱催化的非酶促机制。这突显了局部pH梯度对这类反应的重要性。

为了进一步了解还原反应的范围及其潜在机制，我们进行了额外的实验。首先，我们观察到在温和酸性条件下（pH 5，缺乏NaHCO3）不会发生异构化反应。其次，我们对其他一系列硫酯进行了还原反应。尽管长链脂肪族硫酯（如n-丙基和n-丁基硫乙酸酯）或更复杂的生物硫酯没有生成预期的产物（表S9，条目1-6和7-15），但短链脂肪族硫乙酸酯（AcSMe）获得了类似的结果（见示意图2，条目7，以及表S8，条目15-17）。此外，通过从系统中去除Ni/SiO2–Al2O3或H2进行的S-乙基硫乙酸酯的对照这项工作强调了前生物糖异生过程中固有的挑战，并提出了一个疑问：为什么自然界会选择在整个反应序列中加入磷酸化中间体，尤其是在那些可以产生非磷酸化C-5碳水化合物的、更为直接的、与前生物过程相关的途径中。此外，这些一锅法反应所需的相对苛刻的pH值和温度条件限制了产物的产量，因此需要寻求替代方法。尽管如此，该研究揭示了与前生物化学相关的新转化过程，并有助于探索非酶促糖异生所需的反应条件。大部分反应步骤在普通的条件下就能进行，但不同反应之间的pH值和温度变化表明，为了使这一系列反应在没有人为干预的情况下发生，最终需要一种与普通水环境截然不同的特定环境。特别是涉及高能磷酸化中间体的步骤，在普通水中实现起来具有挑战性。像热液喷口这样的前生物环境特别值得关注，因为它们具有能够调节反应活性的各种地球化学梯度，例如pH梯度、电场以及宽范围的温度条件（10,13）。这些特殊且富含能量的环境可能有助于突破这两个依赖ATP的步骤（即PEP和1,3BGA的形成），而这些步骤正是这条途径的瓶颈所在；更广泛地说，这些环境也有助于发现复杂的原代谢反应网络。

图表
参考文献
支持信息