配体结合的黄素蛋白胺氧化酶的超快光化学：构象学见解及其光催化意义

《JACS Au》：Ultrafast Photochemistry of Ligand-Bound Flavoprotein Amine Oxidases: Conformational Insights and Photocatalytic Implications

　　高分辨率图像下载 MS PowerPoint 幻灯片

黄酶主要通过非光依赖的方式发挥作用，但它们内在的光物理性质为非天然光催化应用提供了潜力。在这里，我们重点研究三种生理上“光不活跃”的黄素蛋白胺氧化酶，即单体肌球蛋白氧化酶（MSOX）、N-甲基色氨酸氧化酶（MTOX）和甘氨酸氧化酶（GOX），这些酶可以在活性位点结合各种羧酸盐配体，其方式类似于天然黄素依赖性光酶——脂肪酸光脱羧酶（FAP）在基态下结合脂肪酸底物的方式。通过使用超快光谱、含有天然和非典型氨基酸的蛋白质突变、X射线晶体学以及经典和量子化学计算，我们系统地表征了这些胺氧化酶在无配体和有配体状态下的光化学性质。我们发现，羧酸盐配体的结合并不会导致光脱羧等光化学反应；相反，这些配体要么改变了黄素与附近芳香残基之间的光诱导电子转移（ET）的动力学过程，要么参与可逆的光开关反应。这使我们能够利用超快光化学过程的动力学作为探针，并利用配体作为底物的替代物，来表征蛋白质的活性位点构象特性和结构-功能关系。此外，通过比较GOX的活性位点特征和激发态性质与FAP的性质，我们探讨了为什么羧酸盐配体不会发生光脱羧。结果表明，内在的猝灭剂、配体的不当定位以及配体向黄素转移的高能障碍阻止了类似FAP的反应。我们的发现为黄素蛋白胺氧化酶的活性位点构象提供了重要的见解，并为设计新的基于黄素的光生物催化剂提供了设计原则。

**引言**
黄蛋白是自然界中化学性质最多样化的蛋白质家族之一，在各种生物过程中起着关键作用。(1?3) 黄蛋白的化学反应性源于其黄素辅因子，黄素辅因子具有独特的电子结构，能够介导单电子和双电子氧化还原反应以及伴随的质子转移反应。虽然绝大多数黄酶仅通过热驱动机制发挥作用，不需要吸收光子，但黄素（异咯嗪）环内在的光物理性质使某些黄酶能够利用光能进行催化。(4) 这些包括能够以光依赖方式修复紫外线损伤DNA的DNA光裂解酶(5,6)，以及最近发现的能够在蓝光激发下将脂肪酸(FA)转化为碳氢化合物的脂肪酸光脱羧酶(FAP)(7,8)。另一方面，在不执行光依赖性生理功能的黄蛋白中，光激发通常会导致氧化黄素辅因子与附近芳香残基之间的超快、可逆的电子转移(ET)，(4,9?21)，这可能起到天然的光保护自猝灭作用，以耗散光子能量。(4,22) 这些非功能性光化学过程也可以用来探究黄酶的活性位点构象和静电性质(9,17,21,23,24)，并用于表征短寿命的生物自由基(12,15)。

黄素辅因子的光化学反应性在光生物催化领域引起了极大的兴趣。尽管依赖黄素的光酶在自然界中很少见(25)，但人们逐渐意识到，通常在生理条件下“光不活跃”的标准热黄酶具有被开发成新型光催化工具的潜力。(26?30) 然而，要有效地重新利用这些酶，需要深入理解自然界如何促进光酶中的有效光化学反应路径，同时避免或抑制热酶中的这些反应。具体来说，在依赖黄素的光酶中，当底物在蛋白质活性位点的黄素附近结合时，它不会在电子基态（即暗态）下与黄素自发反应；为了发生反应，底物-黄素复合物需要通过光子输入被激发到电子激发态，从而克服能量障碍并启动黄素与底物之间的电子转移。(5?8,25,26) 相比之下，在热黄酶中，底物在生理条件下结合时通常会与黄素辅因子自发反应，仅通过热激活克服能量障碍。(1) 然而，除了天然底物外，大多数热黄酶还能在活性位点结合各种配体。这些配体通常是底物的类似物或酶的产物，它们缺乏底物的反应性基团，因此不会在基态下与黄素反应，基本上起到抑制剂的作用。(33?37) 然而，它们是否能够在电子激发态下与黄素反应尚待进一步研究。

在这项工作中，我们重点研究了三种生理上“光不活跃”的黄素依赖性胺氧化酶，即来自芽孢杆菌的单体肌球蛋白氧化酶(MSOX)(34,38)、来自大肠杆菌的N-甲基色氨酸氧化酶(MTOX)(39)和来自枯草芽孢杆菌的甘氨酸氧化酶(GOX)(33,35,40,41)。值得注意的是，这里我们使用“GOX”来指代甘氨酸氧化酶，以保持与MSOX和MTOX的一致性；在文献中，甘氨酸氧化酶也被称为GO或Thio（取自编码该蛋白质的基因名称），而缩写“GOX”也被广泛用于指另一种黄酶——葡萄糖氧化酶(11,24)。MSOX、MTOX和GOX都含有黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)辅因子，并催化(N-甲基)氨基酸氧化反应。这些蛋白质的一个共同特点是它们能够在蛋白质活性位点紧密结合多种底物类似物配体(图1A)。(33?35) 有趣的是，所有这些配体都是羧酸盐（即它们具有离子化的羧基），这与FAP的FA底物相似。先前的研究表明，在MSOX和MTOX中，MSA:FAD或MSeA:FAD复合物可以进行特殊的光开关反应，其中光激发会诱导配体在蛋白质活性位点的可逆构象变化。(37,42,43) 这表明黄素-配体相互作用可以导致不寻常的光化学过程，但目前尚不清楚为什么在MSOX和MTOX中MSA/MSeA配体不会发生类似FAP的光脱羧反应，以及这些胺氧化酶是否能够与其他羧酸盐配体发生光脱羧反应。在这里，我们结合了飞秒瞬态吸收(TA)光谱、含有天然和非典型氨基酸的蛋白质突变、X射线晶体学、分子动力学(MD)模拟以及混合量子力学/分子力学(QM/MM)计算，系统地研究了MSOX、MTOX和GOX与各种配体复合物中的光诱导过程(图1A)。通过将光诱导的电子转移和光开关动力学与蛋白质活性位点的构象特性定性关联，我们的结果为这些黄素依赖性胺氧化酶的结构-功能关系提供了有益的见解。此外，通过比较GOX的活性位点特征和激发态性质与FAP的性质，我们确定了可能促进黄酶中类似FAP的光脱羧的构象和能量因素，从而为开发新的基于黄素的光生物催化剂提供了设计原则。

**图1**
图1. (A) MSOX、MTOX和GOX的黄素（异咯嗪）环及不同底物和配体的化学结构。(B) 来自芽孢杆菌(Bacillus sp.)的MSOX（菌株B-0618；PDB条目：2GB0）、(31) 大肠杆菌(Escherichia coli)的MTOX（PDB条目：2UZZ）(32) 和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的GOX（PDB条目：1NG4）的活性位点结构，如图所示。

**结果与讨论**
**无配体蛋白中的超快黄素光还原**
首先，我们对野生型(WT) MSOX、MTOX和GOX进行了TA测量。与其他没有光依赖性生理功能的黄蛋白类似，这些蛋白中黄素辅因子的光激发会导致超快的、可逆的黄素光还原(4,10?15,19)，这可能是由于活性位点附近酪氨酸残基的电子转移所致(图1B)。如图2A、D和G所示，这三种蛋白的TA光谱特征相似，包括约480纳米处的负基态漂白(GSB)信号、约550纳米处的负激发发射(SE)信号（来自FAD*的激发单态）以及约640–900纳米处的宽正激发态吸收(ESA)信号。(12) 然而，这些信号的衰减动力学和演变取决于蛋白质的种类(图2B、E和H)。对TA数据的全局分析（表S1和图S1a、b）表明，在MSOX中，光诱导的电子转移反应主要在大约0.2皮秒内发生(图2B)，导致FAD*的消失和形成主要在约515纳米处吸收的光产物(图2A)。前几皮秒内TA光谱的总体特征与其他黄蛋白系统中的酪氨酸-黄素自由基对(Y•+/FAD•–)的特征非常吻合(12,15,16)，其中FAD*的贡献较小。因此，我们将这个中间态归因于由附近酪氨酸(Y317和Y254；图1B)的超快电子转移形成的Y•+/FAD•–对，该对在大约2皮秒内通过电荷重组衰减。在MTOX中，FAD*的衰减动力学相对较慢，时间常数分别为约0.3皮秒(49%)和约0.7皮秒(51%)，这可以从约840纳米处的TA动力学推断出来(图2E、图S1c、d和表S1)。因此，在0.4皮秒时记录的MTOX的TA光谱在约550纳米处显示出比MSOX相同时间延迟下的TA光谱更明显的SE特征(图2A)。由于短程光诱导的电子转移事件比局部环境的松弛更快，实验中的电子转移动力学衰减成分可以投影到涉及的供体-受体对的基态距离分布上。(9,17,21,44) 因此，这种双相激发态衰减很可能是由于围绕黄素辅因子的蛋白质活性位点的构象灵活性造成的，产生了两种主要的电子供体-受体构型。在MTOX的晶体结构中(图1B)，最近的电子供体Y310和Y249位于FAD的范德华接触范围内，位置与MSOX中的Y317和Y254相对应。TA结果表明，尽管这些酪氨酸残基在MSOX和MTOX中是保守的，但它们在两种蛋白中可能占据不同的构象分布，这需要通过MD模拟进一步验证(见下文)。此外，在MTOX中，前向电子转移在几皮秒内并未明显积累Y•+/FAD•–光产物，表明电荷重组速率与前向电子转移速率相似或更快。另一方面，GOX的FAD*衰减动力学明显较慢，呈双指数衰减，时间常数分别为约5皮秒(42%)和约28皮秒(58%)，这是从约840纳米处的TA动力学推断出来的(图2H、图S1e、f和表S1)。这一发现与以下事实一致：在MSOX和MTOX中，最近的电子供体残基（MSOX中的Y254和Y317，MTOX中的Y249和Y310）位于黄素环的范德华接触范围内，而在GOX中，最近的电子供体残基Y246距离黄素环约5.0 ?(图1B)。此外，两种FAD*衰减时间常数（5皮秒和28皮秒）之间的巨大差异表明，活性位点中至少存在两种不同的电子供体-受体构型。最后，在GOX的TA光谱中，一个小的信号在纳秒时间尺度上持续存在，表现为扩展到近红外光谱范围的宽吸收带，这可以归属于FAD的三重态激发态(45,46)。这种长寿命特征在MSOX和MTOX的TA光谱中不存在(图2A、D)，表明GOX中FAD*的猝灭效率较低，允许系统间交叉发生，从而导致少量长寿命的三重态FAD的积累。

**图2**
图2. WT MSOX（A、B和C）、MTOX（D、E和F）和GOX（G、H和I）的TA测量结果（450纳米激发）和MD模拟结果。(A、D和G) 在选定的时间延迟下的TA光谱。(B、E和H) 在选定波长下的TA动力学轨迹，其中平滑线条表示基于全局分析的最佳拟合。(C、F和I) 从两次独立的500纳秒MD模拟中采样的FAD与附近酪氨酸和色氨酸残基之间的边到边距离分布。

**为了比较与激发态电子转移动力学相关的基态活性位点异质性，我们对MSOX、MTOX和GOX进行了全原子MD模拟（图S2和S3）。**需要注意的是，这种计算方法旨在提供一个定性的结构框架，以合理解释实验观测结果，而不是提供定量的速率计算或完全机械性的非绝热建模来描述激发态电子转移（ET）动力学。分子动力学（MD）模拟中FAD与附近酪氨酸/色氨酸残基之间的边对边距离分布揭示了这些蛋白质的关键结构差异（图2C、F、I以及图S4、S5）。MSOX中的FAD与Y317以及MTOX中的FAD与Y310之间的紧密接触在MD模拟中得到了很好的保留，平均分离距离约为3.6 ?（图2C和F）。虽然MSOX中的Y254和MTOX中的Y249也靠近黄素，但它们显示出更广泛的距离分布，平均距离分别为4.2 ?和4.6 ?，这可以解释为什么MTOX中FAD*的衰减动力学比MSOX中的略慢（图2B、E）。与MSOX和MTOX相比，GOX的活性位点表现出更明显的构象异质性，其中供电子的Y241、Y246和W298的侧链主要相对于FAD辅因子处于两个不同的位置（图2I），并且具有相关的构象动力学（图S4c和S5c）。例如，在一种构象中，Y246与黄素环的平均距离约为4.7 ?，这与晶体结构中的观察结果相似；而在另一种更常见的构象中，Y246与FAD的距离约为6.9 ?。因此，这些计算结果为GOX中FAD*的ET动力学不仅相对较慢，而且包含两个组分提供了分子层面的解释（图2H和表S1）。在MSOX、MTOX和GOX中，FAD附近存在供电子残基是“光不活化”黄素酶的典型特征。（4,9?21）这与FAP形成鲜明对比，在FAP中，最接近的潜在内在电子供体位于距离黄素环更远的位置（>约7 ?；图S6和S7）。因此，在没有FA底物的情况下，FAP中的FAD*可以持续存在几纳秒。（7,8）配体结合会加速GOX中FAD*的衰减。各种底物类似物（图1A）可以结合到MSOX、MTOX和GOX的活性位点。这种结合通常会干扰黄素的光谱和光物理性质（图S8）。（34,39,40）先前有报道指出，二甲基甘氨酸（DMG）和3-吲哚丙酸（IPA）可以与MSOX和MTOX结合，解离常数分别为17.4 mM和0.79 mM。（34,39）时间分辨荧光（TA）测量显示，DMG与MSOX或IPA与MTOX的结合不会显著影响这些蛋白质中黄素的光诱导动力学（图S9a、b和表S1）。这表明DMG和IPA分别与MSOX和MTOX中的FAD*不发生反应，且配体结合不会改变黄素与邻近的供电子酪氨酸残基（即MSOX中的Y317和MTOX中的Y310）之间的距离（图2C、F）。相比之下，在GOX中，活性位点表现出更明显的构象异质性，供电子的Y241、Y246和W298的侧链主要位于相对于FAD辅因子的两个离散位置（图2I），并且具有相关的构象动力学（图S4c和S5c）。例如，在一种构象中，Y246与黄素环的平均距离约为4.7 ?，与晶体结构中的观察结果相似；而在另一种更常见的构象中，Y246与FAD的距离约为6.9 ?。因此，这些计算结果为GOX中FAD*的ET动力学不仅相对较慢，而且包含两个组分提供了分子层面的解释（图2H和表S1）。在MSOX、MTOX和GOX中，FAD附近存在供电子残基是“光不活化”黄素酶的典型特征。（4,9?21）这与FAP形成鲜明对比，在FAP中，最接近的潜在内在电子供体位于距离黄素环更远的位置（>约7 ?；图S6和S7）。因此，在没有FA底物的情况下，FAP中的FAD*可以持续存在几纳秒。（7,8）配体结合会加速GOX中FAD*的衰减。各种底物类似物（图1A）可以结合到MSOX、MTOX和GOX的活性位点。这种结合通常会干扰黄素的光谱和光物理性质（图S8）。（34,39,40）先前有报道指出，二甲基甘氨酸（DMG）和3-吲哚丙酸（IPA）可以与MSOX和MTOX结合，解离常数分别为17.4 mM和0.79 mM。（34,39）时间分辨荧光（TA）测量显示，DMG与MSOX或IPA与MTOX的结合不会显著影响这些蛋白质中黄素的光诱导动力学（图S9a、b和表S1）。这表明DMG和IPA分别与MSOX和MTOX中的FAD*不发生反应，且配体结合不会改变黄素与邻近的供电子酪氨酸残基（即MSOX中的Y317和MTOX中的Y310）之间的距离（图2C、F）。相比之下，在GOX中，当结合了甘油酸（GCA）、巴豆酸（CTA）或丙烯酸（PEA）（图1A和图S8）后，尽管整体的TA光谱特征基本保持不变（图3A），但FAD*的衰减动力学总体上比无配体的蛋白质更快。这一点从800 nm以上波长的ESA信号的衰减动力学中可以明显看出（图3B、图S9c和表S1），该衰减动力学主要由一个5 ps的组分主导。图3。（A）在选定的时间延迟下，WT GOX与GCA复合物的TA光谱，激发波长为450 nm。（B）在830 nm处，无配体和结合GCA的WT GOX之间的TA动力学比较。（C）无配体和存在100 mM GCA时，Y246pCNF GOX的稳态吸收光谱。插图显示了395 nm处的吸光度变化与GCA浓度的关系，其中实线是通过拟合理论结合曲线（方程S1）得到的。（D）在830 nm处，无配体和结合GCA的Y246pCNF GOX之间的TA动力学比较。高分辨率图像。这种加速的激发态衰减过程可能源于（1）从配体到黄素的新且更快的光诱导电子转移途径的参与，和/或（2）配体诱导的构象变化，缩短了现有氨基酸供电子体与黄素之间的距离。为了验证这些可能性，一种通用策略是通过定点突变将供电子残基（即酪氨酸或色氨酸）替换为氧化还原不活跃的残基（例如苯丙氨酸），然后重新研究配体结合蛋白质中黄素的光诱导电子转移动力学。（12?14）在当前研究中，我们制备了Y246F变体的GOX并研究了其光物理性质。我们的结果显示，在这种情况下，FAD*的寿命约为36 ps（图S10和表S1），证实Y246是FAD*的主要供电子体。有趣的是，这种GOX突变体缺乏有效结合GCA的能力，因为大量过量（约200 mM）的GCA的存在并未显著改变Y246F GOX的吸收光谱（图S11）。这表明Y246的羟基与配体的羧基之间的相互作用在稳定结合的配体方面起着关键作用，可能是通过空间位阻效应实现的。接下来，我们通过基因编码扩展方法将Y246残基替换为非典型的氨基酸p-氰基苯丙氨酸（pCNF）（47,48）。（49）选择pCNF的原因有以下几点：（1）由于pCNF在结构上与酪氨酸相似，我们预计相应的GOX突变体仍然可以结合GCA；（2）根据量子力学（QM）计算（表S2），pCNF很可能像苯丙氨酸一样“氧化还原不活跃”，其最高占据分子轨道的能量水平甚至更低（分别为-8.62 eV和-8.06 eV）。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR；图S12）确认了pCNF成功整合到GOX中，其中pCNF246在大约2229 cm–1处显示出一个吸收峰，相对于水溶液中的自由pCNF，该峰向红移了约8.1 cm–1并且变宽了约1.7 cm–1。这表明在GOX中pCNF246处于一个整体疏水和异质的环境中。如图3C所示，这种GOX变体确实保留了结合GCA的能力，结合常数为8.9 ± 1.0 mM，这是通过监测GCA结合时395 nm处的光谱变化来确定的（图3C，插图）。进一步的TA测量显示，在无配体和结合GCA的Y246pCNF GOX中，FAD*的衰减动力学相似，时间常数约为30 ps，没有任何更快的组分（图3D、图S13和表S1），表明GCA并不直接参与FAD*的淬灭，而是影响GOX的活性位点构象。这一评估得到了MD模拟结果的支持（图S14和S15），这些结果表明GCA结合使蛋白质活性位点固化，减少了FAD周围大多数残基的构象灵活性（图4A、图S16a和S17a），包括供电子残基Y246和W298。特别是，它有效地消除了主要供电子体Y246的远端构象（图4B、C），从而消除了WT GOX中缓慢的FAD*衰减组分。另一方面，对于Y246pCNF GOX，MD模拟显示GCA结合也类似地影响了pCNF246的构象分布（图4D、图S16b、c和S17b、c）。然而，由于pCNF不参与光诱导的电子转移反应，这种对pCNF246构象的影响并未反映在激发态动力学中。在GOX中，没有Y246时，W298是最接近FAD的供电子残基，距离约为6.5 ?（图4C、D）。因此，尽管我们没有观察到直接的光谱证据，例如在Y246pCNF GOX中以约575 nm为中心的酪氨酸自由基阳离子（W•+）的明显吸收峰，（12,50），但由于其邻近性，主要的供电子体很可能是W298。TA光谱中缺乏W•+/FAD•–吸收峰可以归因于相对较低的前向和后向电子转移率，这基本上阻止了光产物的积累。由于W298与黄素环之间的距离不受GCA结合的影响（图4C、D），因此复合物形成后电子转移动力学基本保持不变（图3D）。图4。（A）包含GCA的WT GOX在MD模拟中，活性位点残基（距黄素环约8 ?范围内）的侧链RMSF与无配体模拟的差异。（B）MSOX中结合GCA的WT GOX的代表性快照（蛋白质碳原子用青色标出）。还展示了来自无配体WT GOX MD模拟的Y241、Y246和W298的构象（蛋白质碳原子用品红色标出）以供比较，其中结构相对于黄素进行了对齐。（C）在WT GOX的MD模拟中，包含GCA ligand与否时，FAD与附近酪氨酸和色氨酸残基之间的边对边距离分布（也见图2I）。（D）在Y246pCNF GOX的MD模拟中，包含GCA ligand与否时，FAD与附近酪氨酸和色氨酸残基之间的边对边距离分布（也见图2I）。高分辨率图像。下载MS PowerPoint幻灯片。与上述其他配体不同，MSA和MSeA（图1A）与MSOX、MTOX和GOX的结合会在黄素的光谱红侧引入一个新的吸收峰（图S18），这是由于黄素与这些配体之间的强CT相互作用。（34,39,40,42,43）先前已有研究表明，MSOX中的MSA:FAD CT复合物和MTOX及GOX中的MSeA:FAD CT复合物在光激发CT吸收峰时可以发生光切换反应，其中配体经历可逆的构象变化，涉及配体的硫（S）或硒（Se）原子的移动，并占据不同的构象状态（37,42），相应的光循环动力学由配体和活性位点环境决定。（43）在这里，我们进一步研究了GOX中MSeA:FAD和MSA:FAD CT复合物的光诱导过程。如图5A所示，通过光激发GOX中的MSeA:FAD复合物获得的TA光谱特征为两个ESA峰，分别位于约400 nm和660 nm处，以及一个GSB峰位于约570 nm处，还有一个负SE峰位于约850 nm处。这些信号呈现单指数衰减（图5B和表S1），时间常数约为1.3 ps，表明与MSOX和MTOX中的情况不同，GOX中MSeA:FAD复合物的光激发不会导致配体构象的变化，而只是导致复合体内电子密度的重新分布。对于MSA:FAD复合物也获得了类似的TA结果（图S19和表S1）。SE峰的存在表明这种CT激发态本质上是发光的，因此可以将其归类为激子或激子复合物态。（51,52）这与在无配体蛋白质中FAD与附近残基之间的光诱导电子转移过程中观察到的完全电荷分离（自由基对形成）不同。图5。（A）在选定的时间延迟下，WT GOX与MSeA复合物的TA光谱，激发波长为530 nm。（B）在选定的波长下，WT MSOX、MTOX（43）和结合MSeA的GOX之间的TA动力学比较。MSOX和MTOX复合物的动力学特性是根据参考文献43中的报道复现的。(C) WT GOX与MSA复合物中活性位点的结构通过X射线晶体学确定（PDB条目：9WOZ）。(D) MSAX、MTOX和GOX活性位点中MSA的占据图（彩色网格；等值线：0.28），这些数据是从分子动力学（MD）模拟中提取的，并根据三种蛋白质中的黄素环进行了对齐。(E和F) MSA的S原子与黄素环之间的距离（dS–FAD，E），以及MSA的Cα原子与黄素环之间的距离（dC–FAD，F）的分布，也是从MD模拟中获得的。

为了研究MSA在GOX中的结合模式，我们确定了MSA与GOX复合物的晶体结构，其分辨率为2.5 ?（PDB条目：9WOZ；表S3）。如图5C所示，MSA在GOX中的构型与在MSOX中的不同。与MSOX中MSA的S原子距离黄素环约3.3 ?（图S20）不同，在GOX中MSA的S原子距离黄素环更远（约5.4 ?），其甲基朝向M49，而Cα原子靠近黄素环（约3.6 ?）。与其他羧酸配体类似，MSA的羧基保持与Y246、R302和R329的相互作用，并且靠近黄素。（33,35）我们进一步对MSOX、MTOX和GOX与MSA复合物进行了MD模拟（图S21和S22）。如图5D所示，模拟得出的MSA占据图清楚地显示了这三种蛋白质中配体结合模式的差异，配体在黄素环上的位置不同。（43）在MSOX中，MSA主要占据一种构象，其中S原子与FAD的平均距离dS–FAD约为3.6 ?，以及一种较少出现的构象，其中dS–FAD约为5.0 ?（图5E，图S23a和S24a）。在MTOX中，配体也呈现出两种更广泛的构象分布（dS–FAD分别约为3.6 ?和4.9 ?），且这两种构象的出现频率相当（图5E）。相比之下，在GOX中，配体仅存在一种构象，其中MSA的S原子与FAD之间的距离较大（dS–FAD约为4.9 ?），而配体的α碳（Cα）则靠近FAD（dC–FAD约为3.5 ?，图5F，图S23b和S24b）。

总体而言，CT复合物的光诱导动力学使我们能够通过光谱学方法评估蛋白质活性位点的构象特性。具体来说，结果表明MSOX的活性位点能够在两种不同的构象中稳定肌氨酸底物，因此在光激发下能够稳定MSA或MSeA的构象转变状态。（42,43）另一方面，底物或配体与GOX的结合会导致活性位点变得更加刚性，使得配体的S或Se原子位置相对较远。在GOX中的MSA(MSeA)中，基态下的S(Se)–黄素距离已经与MSOX中的MSA(MSeA)的光照转变构象下的距离相似（图5A，B）；（42,43）因此，对于GOX中的MSA(MSeA)来说，似乎没有结构上的空间让配体的S或Se原子在光激发时发生移动，从而有效地阻止了任何构象转变。MSA(MSeA)结合后活性位点的刚性变化也与FAD在GOX中的光诱导电子转移（ET）动力学结果一致（图3）。MSA的Cα原子与黄素环之间的紧密接近也表明，GOX催化的脱氨基反应可能通过底物的Cα原子向黄素环的氢转移来进行。（33,35,40,41）相比之下，MSOX和MTOX催化的脱甲基反应可能需要底物的氨基基团（对应于配体的?SCH3或?SeCH3部分）与FAD辅因子的相互作用。（34,38,39）此外，GOX中更为紧凑的活性位点也有助于较小底物甘氨酸的紧密结合。最后，MTOX的活性位点最大，配体可以采样更多的构象，因此MSeA在MTOX中的光转变过程表现出多相且更快的光循环（图5B）。（43）这也与MTOX能够容纳体积较大的N-甲基色氨酸底物这一事实一致，而MSOX和GOX则不能。（39）

如上所述，未经CT相互作用的羧酸配体在MSOX、MTOX和GOX中光激发FAD辅因子时并不直接参与电子转移（ET）反应。尽管光激发可以促进MSA(MSeA):FAD复合物进入CT激发态，但光循环不会产生任何光产物。考虑到这些配体（图1A）与FAP的FA底物（图S6）的结构相似性，以及配体羧基与黄素环的紧密位置（图5C和图S20），这一点非常有趣。为了理解这些观察结果的原因，我们采用量子力学/分子力学（QM/MM）方法研究了GOX活性位点中GCA:FAD和MSA:FAD复合物的激发态特性，并将其与FAP中的FA:FAD复合物进行了比较。在GOX中，QM区域包括FAD的黄素环、MSA或GCA配体以及最近的电子供体Y246的侧链；而在FAP中，QM区域包括黄素环、FA的羧基和三个相邻的亚甲基，以及附近的精氨酸残基R451的侧链。这些在密度泛函理论（DFT）水平上进行了描述，而剩余的蛋白质残基和水分子则用经典力场描述。我们基于MD模拟的几何结构进行了DFT几何优化和时依赖性（TDDFT）计算。由于短程光诱导的ET发生在比局部结构松弛快得多的时间尺度上，因此在ET事件期间蛋白质矩阵基本上是“冻结”的。（12,13,19,54）因此，我们估算了Franck–Condon区域内的垂直激发能量，并使用空穴-电子分析来描述电子跃迁后电子密度的变化，从而理解激发态的潜在特性。（13,55,56）这些可以合理评估初始ET步骤的热力学可行性和反应位点。

如图6所示，可以清楚地识别出FAD的局部激发态（对应于S0 → S1跃迁；以下简称LEFAD）以及GOX中涉及FAD和GCA（CTGCA）或MSA（CTMSA）的最低能CT态，FAP中涉及FAD和Y246（CTY246）的CT态，以及FAP中涉及FAD和FA（CTFA）的CT态。值得注意的是，CTY246在能量上低于LEFAD，而CTGCA的能级则显著更高（图6A；分别为3.01、3.43和4.58 eV）。这种排序表明，在GOX中，FAD和GCA之间的ET在能量上是不利的，不太可能比FAD和Y246之间的ET更易发生。另一方面，CTMSA的能级低于LEFAD和CTY246（图6B；分别为2.99、3.34和3.47 eV），并且具有中等振荡强度0.08（表S4），表明这种状态可以直接通过光激发或通过LEFAD状态的衰减来达到。然而，如图6B所示，转移的电子主要是由S原子提供的，而不是MSA的羧基提供的，因此不太可能引发连续的脱羧反应。另一方面，FAP表现出几个有利于光脱羧的特征（图6C）。首先，如上所述（图S6和S7），在FAP中没有电子供体残基（如酪氨酸或色氨酸）位于黄素环7 ?范围内；因此，没有内在的光诱导ET与FA到FAD的ET过程竞争。（4,8）其次，在我们的计算中，FAP的Franck–Condon区域内LEFAD和CTFA态之间的能量差约为0.3 eV，而在GOX中LEFAD–CTGCA的能量差约为1.2 eV。LE和CT态之间的相对较小的能量差允许FAP中的FAD*和FA之间以中等速率（约300 ps）发生正向ET。（8）这得益于酶活性位点内的蛋白质驱动的结构变化，进一步稳定了自由基产物状态，正如Londi等人在计算工作中详细展示的。（57）第三，空穴-电子分布（图6C）也表明，这里的光诱导ET确实涉及FA的羧基作为电子供体，该过程可以在几十皮秒内计算出不可逆的脱羧反应。（57,58）与GOX中的MSA:FAD复合物相比，这表明羧基的相对位置可能在确定反应位点中起关键作用。

我们结合了超快光谱技术和计算技术，对三种功能不同但结构相似的黄素蛋白氨氧化酶MSOX、MTOX和GOX中的配体-黄素复合物的超快光化学性质进行了研究。我们发现，羧酸配体不会导致具有生产性的光化学转化，如光脱羧。相反，它们要么通过使蛋白质活性位点刚性化来影响黄素和附近芳香残基之间的光诱导ET反应的动力学，要么通过CT激发态参与可逆的光开关反应。然而，这使我们能够利用超快光化学过程的动力学作为敏感的探针，并使用底物类似物配体作为底物的替代物来表征这些蛋白质的活性位点构象特性，从而提供了对其不同底物特异性和催化机制的微观理解。具体来说，我们的研究发现MSOX具有相对刚性的活性位点，有利于从紧密排列的酪氨酸残基到黄素的超快光诱导ET，其ET动力学基本上是单相的。虽然MSOX的活性位点环境是刚性的，但其配体/底物可能会表现出一定程度的构象灵活性，并且可以在两种不同的构象中稳定。这一特征也使得像MSA和MSeA这样的底物类似物在与黄素形成CT复合物时能够进行光开关。相比之下，MTOX的活性位点更大、更灵活。因此，尽管其活性位点的组成与MSOX非常相似，但在MTOX中，附近的酪氨酸残基和蛋白质结合的小分子配体（如MSeA）表现出更多样的分布。这解释了MTOX中更复杂的光诱导动力学，并与其能够容纳体积较大的N-甲基色氨酸底物相一致。对于GOX，其活性位点在无配体状态下表现出显著的构象异质性，主要的电子供体酪氨酸残基可以位于黄素的近端和远端位置，分离距离分别约为4.7 ?和6.9 ?。这种采样导致了双相的ET动力学，具有两个不同的时间常数（分别约为5 ps和28 ps），总体上不如其他两种蛋白质有效。更重要的是，底物类似物的结合会导致活性位点显著刚性化，有效地消除了电子供体酪氨酸的远端构象，从而消除了缓慢的ET过程。在GOX中，相同的配体（例如MSA）表现出与MSOX和MTOX中不同的结合模式，这从根本上阻止了在MSOX和MTOX中观察到的CT复合物的光开关反应的发生。可以断言，GOX这种紧凑且刚性的活性位点非常适合用于甘氨酸等小底物的脱氨基反应。此外，与黄素依赖性光酶FAP不同，GOX不能催化含有羧酸配体的光诱导脱羧反应。我们的量子力学/分子力学（QM/MM）计算表明，这主要是由于：（1）附近存在电子供体残基作为内在的、竞争性的激发态淬灭剂；（2）配体羧基在结合位点上的位置不当；（3）启动初始配体到黄素的电子转移反应所需能量较大。综合来看，这项工作强调了活性位点环境的微妙变化如何导致黄素酶功能的显著差异。这些结果不仅验证了利用超快光化学过程作为探测酶活性位点复杂构象的的有效手段，还为将热活性黄素酶重新开发为光驱动生物催化剂提供了可能的框架。

图表
参考文献
支持信息