呼吸复合体I中反转运蛋白模块中质子传输的门控机制的分子原理

《Journal of the American Chemical Society》：Molecular Principles of Gating Proton Transport in the Antiporter Modules of Respiratory Complex I

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呼吸复合物 I 是一种高度复杂的氧化还原驱动的质子泵，为所有生命领域的氧化磷酸化提供能量。然而，尽管做出了大量努力，其长距离能量转换的原理仍然存在很大争议。在这里，我们通过改造复合物 I 的抗转运模块来研究质子传输的分子原理。通过结合定向突变、时间分辨光谱和分子动力学（MD）模拟，我们确定了沿质子通道的保守残基，这些残基控制着质子穿过蛋白脂质体膜的传输速率。抗转运模块通过沿着质子通道的内在电场形成的瞬态水链来催化这种严格调控的质子传输。基于 MD 模拟，我们识别了由非极性残基建立的保守门控位点，这些位点在突变时调节质子传输背后的水合和电场效应。总体而言，我们的发现强调了复合物 I 的模块化能量转换机制如何利用静电和构象耦合原理来催化长距离质子传输，这与其他酶有显著的相似性。

**引言**
复合物 I（NADH/泛醌氧化还原酶）是一种氧化还原驱动的质子泵，它在线粒体和许多细菌中为细胞呼吸提供能量，(1?5) 使用一种完全可逆的长距离质子耦合电子转移（PCET）过程，该过程跨越了超过 300 ? 的距离。这一过程由尼古丁酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）和泛醌（Q）之间的电子转移驱动，从而推动其 200 ? 宽的膜域中的质子泵送（图 1A）。然而，尽管过去几十年进行了详细的实验和计算研究，(6?13) 复合物 I 的长距离能量转换机制仍然未得到解决，并且存在很多争议。

**图 1**
图 1. 复合物 I 的结构和功能。(A) NADH 驱动的泛醌还原为抗转运模块中的质子传输提供能量。(B) 末端（Nqo12）和倒数第二个（Nqo13）抗转运模块在膜上建立了假定的质子通道。

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对于每一个 NADH 氧化步骤，复合物 I 会将其膜域中的四个质子泵出。有人提出(8,14,16,17)，但参见参考文献(15)，每个类似抗转运的模块 Nqo12、Nqo13 和 Nqo14 以及 Nqo7/8/10/11（图 1A）共同形成了 S 形质子链，这些质子链由水分子和保守的可滴定残基组成，负责质子传输（图 1B,C）。这种水结构部分也得到了最近冷冻电子显微镜（cryo-EM）数据的支持，特别是在中央亲水轴上，尽管在膜正电荷侧（P 侧）的完整连通性迄今为止仅在末端 Nqo12 亚基中通过实验观察到(7,18)。保守残基在路径上的功能相关性通过突变实验得到间接支持(19,20)，其中替换会导致耦合的质子-电子传输活动部分或完全阻断。然而，亲水域中的电子转移活动与膜域中的质子泵送之间的紧密耦合使得研究功能相关残基变得非常具有挑战性，因为中心残基的突变会阻断这两种活动(9,10,19?22)。
我们提出(10,23,24)，复合物 I 中的氧化还原驱动的质子泵送是通过沿着膜模块传播的“质子化波”来实现的，这种波由亲水域和膜域交界处形成的醌分子触发(25?28)。每个类似抗转运的亚基都形成了一个 S 形质子链，在膜上建立了瞬态的氢键连接(14,29)（参见参考文献(15)和(30)），而每个抗转运模块内保守的离子对之间的构象变化刺激了沿着横向亲水轴的质子传输，并导致质子化反应逐步向末端 Nqo12 亚基传播。Nqo12 的 P 侧输出通道中的质子释放被认为会产生一个“回波”，涉及沿着 N 侧输入通道的逐步质子吸收以及离子对的构象变化，最终释放出结合在第二个膜结合位点的醌分子，这一点得到了分子模拟(31?33)和冷冻电子显微镜(5,34)数据的支持。
与波传播模型不同，在波传播模型中每个类似抗转运的亚基泵送一个质子，Sazanov 及其同事提出(7,18)，一半的类似抗转运的亚基（Nqo12 和 Nqo13）参与从 N 侧吸收质子，但所有四个质子都通过末端亚基 Nqo12 释放到 P 侧，这是通过沿着 200 ? 亲水轴的横向质子传输实现的。此外，还提出用于泛醌还原的两个“化学”质子通过所谓的 E 通道传输到醌腔中。这种“仅 Nqo12”模型部分是从末端抗转运亚基相对于其他抗转运亚基更高的局部水合程度推断出来的。实验解析的水结构在不同复合物 I 同型之间存在较大差异，总体上表明 Nqo12、Nqo13、Nqo14 和 Nqo8 中有质子输入位点，以及报告的 Nqo14 的可能的 P 侧输出位点(35)。然而，众所周知，高度水合的蛋白质结构也可能完全阻断质子传输，就像水通道蛋白一样(36)，而瞬态水合可以导致有效的质子跨膜传导(37)。因此，不能仅从水结构推断出质子传输活动，而需要对水合动力学和质子传输反应进行详细的结构和能量学探索。

**最近的研究**
Beghiah 等人(29)从复合物 I 中分离出了单独的抗转运模块，并表明这些分离出的蛋白质结构包含跨越蛋白脂质体膜传输质子所需的所有功能元素（图 1B,C）。具体来说，离子对元素以及沿假定性质子路径的可滴定（Lys、His 和 Glu）残基对于质子传输过程至关重要，这与波传播模型的机制要求一致。由于在质子通道上的中心残基发生突变时会显著抑制耦合的质子和电子传输活动，因此基于完整复合物 I 的实验很难获得类似的直接证据(9,10,19,21,38,39)。

**一般而言，质子泵在路径上使用分子门控装置来控制电荷转移反应，这些门控装置通过打开和关闭质子通道来响应氧化还原或质子化“信号”，以防止质子沿热力学上更有利的方向回流。在分子层面上，这样的门控可以通过水分子和非极性残基之间的相互作用来实现，这些残基在构象变化时阻止了类似 Grotthuss 的质子阵列的形成。为了研究复合物 I 中抗转运模块的门控机制和跨膜质子传输的分子原理，我们在这里结合了定向突变和时间分辨光谱、蛋白脂质体实验、体内测定以及原子级分子动力学模拟。**

**基于分子模拟的门控残基鉴定**
为了探究抗转运模块中质子传输的分子原理，我们对嵌入脂质膜中的 Nqo12 和 Nqo13 模块进行了原子级分子动力学（MD）模拟（见方法部分）。通过去除 N 末端的两亲性螺旋段（残基 516–606），得到了修改后的 Nqo12ΔTM 模块（以下简称 Nqo12）。除了对 WT 结构进行微秒级 MD 模拟（技术细节见方法部分）外，我们还通过逐步沿既定路径移动质子并利用之前的量子/经典（QM/MM）模拟（17,29,40）（参见参考文献(41)）来研究质子传输引起的构象和水合变化。

Nqo12（图 2A）和 Nqo13（图 2D）都在膜段上建立了瞬态的 S 形水链（见图 S1、S4、S7、S11），这与之前的观察结果一致(17,29)。正如一个严格门控的质子泵所预期的那样，水链不是连续的，而是动态地形成和断裂，并横跨路径上的保守残基（图 2B,E）。连通性强烈依赖于可滴定位点的质子化状态（图 S1、S4 和 S11），残基的质子化状态调节与下一个位点的接触。我们观察到水合动力学与路径上定向的内在电场的形成相关（图 2B,E 和 S2、S3、S5、S6、S8），这表明润湿转变受到电静力效应的调节（参见参考文献(42–49)）。

在 Nqo12 中，质子路径通过 K29212 到 H24112/K32912 形成，F33312 和 L22612 调节 N 侧输入通道和蛋白质内部的润湿作用。路径继续通过 H32512 和 H32112 到 K38512，然后通过 D38612 连接到 P 侧内部。整个路径被多个水分子占据，尽管我们观察到中间位点之间存在约 10 ? 的间隙（在通道坐标处，R = 10–20 ?、25–35 ? 和 50–58 ?，图 2B），而在质子沿路径传输时，我们观察到中心可滴定残基（K29212、H24112、K32912、K38512 和 D38612）的构象变化，这些变化 bridging 了润湿间隙（图 S1）。特别是，中心赖氨酸残基 K32912 和 K38512 的去质子化（图 S1D）可能在质子通过 P 侧出口位点时发生，从而导致有利于 N 侧接触的润湿的构象波动。此外，沿瞬态润湿位点的非极性大分子残基，特别是 F33312 和 L22612，会暂时取代水链（图 S9 和 S10）。这表明这些非极性残基可能建立了局部门控位点，调节质子传输反应（图 2A–F）。

在 Nqo13 中也形成了类似的质量子路径，通过 H21813 连接 K28213/D22813 到 K23513，这与之前的模拟结果一致(10,14,17)，在 F32613 和 L21413 处形成了非极性区域（R = 12 ? 和 18 ?，图 2E）。从“中央赖氨酸残基” K23513 开始，质子路径通过 H29213 继续到 E37713，后者通过两条可能的输出路径暂时连接到 P 侧内部（图 2D,E 和 S7）。其中一条路径位于与 Nqo12 中的 P 侧出口类似的位置，经过动态灵活的 F37813；另一条次要路径通过 Y31313 暂时形成了一条通往 P 侧内部的侧路。我们注意到，将 Nqo13 从其相邻亚基（Nqo12 和 Nqo14）分离出来可能会引入非天然的脂质-蛋白质接触，这可能会影响 P 侧输出位置的局部动态，特别是在后一条侧路上（但见下文）。有趣的是，在某些模拟中，从 P 侧内部转移的 Na+ 离子与 E37713 发生了瞬态相互作用（图 S4G）。然而，这一观察不应被视为抗转运蛋白参与钠转运的迹象，因为 MD 模拟使用的是固定的质子化状态，因此 Na+ 离子与 E37713 的瞬态协调可能表明该残基具有质子化变化的潜在热力学倾向。在这方面，先前的实验表明抗转运模块不会将 Na+ 离子穿过蛋白脂质体膜(29)。

**为了测试鉴定出的假定门控位点的功能性作用，我们接下来在计算机上用较小的（Ala 和 Val）或较大的（Trp）非极性氨基酸替换了这些残基，具体来说是 L226A12、F333A/V/W12、L214A13 和 F326A/V/W13（图 2G,H 和 S9–S12）。此外，我们还研究了将 Nqo12 的末端羧酸基团替换为苯丙氨酸（D386F12）的影响，反之亦然，将 Nqo13 中相似的苯丙氨酸替换为羧酸基团（F378D12）。我们进一步将这些模型与模拟假定的“开放/传导”通道构象的模型进行了比较，后者通过相应的 E132Q12 和 E123Q13 替换实现了“离子对打开”，从而增强了中央通道中的质子传输（参见参考文献(29)）。正如预期的那样，用较小或极性较大的氨基酸替代这些体积较大的残基（F333A12、F333V12、L226A12、L214A13 和 F378D12）会导致路径沿线局部水合作用的增加，同时电场成分也会发生变化，类似于 E132Q12 和 E123Q12 的开放状态（图 2G、H 和 S9–S12）。对于 F326A/V13 变体，我们观察到相邻疏水残基的微妙重排，其中 L38512 移动到了野生型（WT）中 F32613 所处的位置（图 S10C、D 和 S12D），填补了路径中的空隙，从而在质量上防止了过度的水合作用。根据类似的原则，引入体积更大的残基（D386F12 和 F326W13）会降低路径沿线的水合作用水平，进一步支持了这些残基具有潜在的门控功能（图 S9G、S10E 和 S11）。除了 F326A13 和 F326V13 变体中的结构重排外，我们还观察到 F333A12 变体中 TM7a/b 和 H24112 的微妙变化（图 S9C、S10C、D 和 S12D、G）。这表明 F33312 不仅控制路径沿线的水合作用水平，还可能影响断裂螺旋元素的开启/关闭动态。值得注意的是，H24112 在多个变体中显示出更大的灵活性（F333A12、F333W12 和 F333V12，图 S9 和 S12G），类似于 E132Q12 变体的导电状态。相比之下，F333W12 的替代通过吲哚环封闭了 N 侧输入通道，使其沿通道呈现水平构象（图 2G 和 S9E 以及 S12H）。

特别值得关注的是 Nqo12/13 中末端羧酸/苯氨酸的替换。在这方面，F378D13 导致 P 侧路径沿线的水合作用和电场强度显著增加（图 2H 和 S10G）。然而，这种“溢出”效应在野生型 Nqo12 模型中更为严重（图 S9A），表明 F378D13 替代可能导致显著的质子泄漏（见下文）。同样，D386F12 替代导致 P 侧输出通道的水合作用水平降低（图 2G 和 S9G），这与路径沿线电场强度的下降相关，尽管在模拟过程中仍观察到了瞬态质子传输。总体而言，我们的分子动力学（MD）模拟表明，Nqo12 和 Nqo13 都能通过膜建立瞬态质子通道，这些通道由可滴定残基之间的连续氢键接触形成，并受到残基自身质子化状态的严格控制。质子化状态的变化会在路径沿线产生局部电场（图 S2、S3、S5、S6），从而控制水合作用动态，并得到所识别的大型非极性残基的结构支持。我们的 MD 模拟确定了输入/输出通道上的潜在门控位点，这些位点调节质子通道的形成，而它们的替代会导致瞬态质子传导路径的水合作用状态发生变化。

为了实验性地评估质子门控过程的分子机制并测试计算确定的门控位点的影响，我们表达了单独的反转运蛋白模块 Nqo12 和 Nqo13，并在这些位点引入了突变。通过在蛋白脂质体中重新组装这些反转运蛋白模块与大肠杆菌 ATP 合酶，并在添加 ATP 时创建质子梯度，来探测质子导电性（图 3A）。这里我们采用了最近引入的月桂基麦芽糖新戊基二醇（LMNG）自动插入重组（LAiR）方法，该方法仅使用温和的洗涤剂 LMNG 来建立稳定的蛋白脂质体，而无需添加会破坏脂质体膜的胆酸盐。我们使用 pH 敏感的荧光染料吡喃（8-羟基芘-1,3,6-三磺酸，HPTS）来监测质子导电性，该染料被封装在蛋白脂质体内——这是一种比率荧光染料，其光学变化可以直接与 pH 值变化相关联（见图 S13A）。质子转移反应由添加 0.04 mM ATP 引发，ATP 合酶会水解 ATP 并通过质子泵送活动产生势能（pmf），从而使蛋白脂质体的内部体积酸化，导致吡喃荧光信号减弱（图 3B、C），随后通过添加质子载体Gramicidin 来消散产生的 pmf（图 3B、C）。

为了研究反转运蛋白变体的质子传导特性，我们将其重新组装到 ATP 合酶-蛋白脂质体中。我们观察到 Nqo12 和 Nqo13 构造在动力学上与 ATP 合酶的质子泵送活性竞争，质子传导导致的 ΔpH 值较小，Nqo12WT（ΔpH = 0.081）和 Nqo13WT（ΔpH = 0.075）（图 3B–E），这与我们之前使用半定量 9-氨基-6-氯-2-甲氧基吖啶（ACMA）染料进行的实验结果一致。（29）将质子通道上的非极性门控残基突变为较小或较大的疏水残基会显著改变反转运蛋白模块的质子传导速率。在这方面，当在假定的门控位点引入较小的侧链时，我们观察到相对于 WT 反转运蛋白模块，质子传导速率显著加快，ΔpH 值也更小（L226A12（ΔpH = 0.072）、L214A13（ΔpH = 0.046）、F333A/V12（ΔpH = 0.072/0.021）和 F326A/V13（ΔpH = 0.008/0.067）变体（图 3D、E）。有趣的是，在 F333V12 和 F326A13 变体中，传导速率明显快于其他变体，特别是 F333A12 和 F326V13，这表明这些替代会损害门控功能。相反，在门控位点引入较大的侧链会导致质子传导速率降低（即 ΔpH 值增大），相对于 WT 模块，F333W12（ΔpH = 0.090）和 F326W13（ΔpH = 0.082）。此外，正如我们的模拟所预期的，D386F12 替代导致质子传导速率相对于 WT 模块变慢（ΔpH = 0.087），而 F378D13 替代则表现出增强的质子传导（ΔpH = 0.031）（图 3D、E）。

接下来，我们应用停流光谱技术研究了 Nqo12 和 Nqo13 变体中的质子传导动力学（图 4A）。为此，我们监测了在加入 1 mM ATP 和 ATP 合酶/Nqo-蛋白脂质体后膜电位的生成，使用时间分辨率为 2 ms 的 oxonol VI （52）的吸收变化来进行测量。oxonol VI 的吸光度变化与 ATP 合酶建立的跨膜电位的积累相关（图 S13B）。我们获得单独使用 ATP 合酶时的初始 Δψ 形成速率为约 120 mV s–1，这与基于脂质体大小和电容估计的约 210 H+ s–1 的传输速率相当（见方法部分）。当 WT 反转运蛋白模块与 ATP 合酶重新组装时，膜电位显著降低，Nqo12 和 Nqo13 的速率分别为 53.5 mV s–1 和 26.7 mV s–1（图 4B–E）。将门控残基替换为较小的疏水侧链或可质子化残基会导致 Δψ 的积累减少，与 L226A12（45.0 mV s–1）、F333A/V12（40.7 mV s–1/9.95 mV s–1）、L214A13（14.0 mV s–1）、F326A/V13（15.4 mV s–1/10.8 mV s–1）、F378D13（22.1 mV s–1）的传导速率增加一致；而替换为较大残基则导致 Δψ 的积累相似或增加（F333W12（51.3 mV s–1）和 F326W13（28.4 mV s–1），D386F12 变体的初始速率虽然较 WT 慢（43.8 mV s–1），但总体 Δψ 值与 WT 相似（图 4B–E）。总的来说，我们的停流实验表明，反转运蛋白模块 Nqo12 和 Nqo13 在动力学上与 ATP 合酶的质子传输竞争，大型门控残基控制着蛋白脂质体膜上的势能（pmf）形成速率，这支持了我们从 MD 模拟中得出的分子观察结果。

为测试反转运蛋白模块在呼吸膜中的质子传导特性，我们接下来评估了在过表达反转运蛋白模块后孤立大肠杆菌膜中的呼吸速率。为此，我们在添加 NADH 作为电子供体时使用 Clark 氧电极测量了氧气消耗量，同时通过附着在模块上的 sfGFP 的荧光来量化反转运蛋白模块的表达水平（见方法部分）。在呼吸膜中表达质子传导反转运蛋白模块预计会损害势能（pmf）的形成，从而对细胞的能量代谢有害。细菌通过降低反转运蛋白模块的表达水平来补偿，这一点通过 GFP 的荧光观察到（图 S15）。总体而言，我们发现快速质子传导模块在门控区域减少的情况下会导致呼吸速度降低和反转运蛋白模块的表达水平下降（图 S15），而在表达门控区域增加的慢速质子传导变体中，我们观察到呼吸速率升高（见图 S15），F326W13 是例外（见下文）。快速质子传导模块与相对于 WT 构建的氧气消耗速率降低有关（100%），对于 L226A12（73 ± 7%）、F333A/V12（88 ± 9%/75 ± 13%）、L214A13（79 ± 12%）、F326A/V13（56 ± 9%/31 ± 4%）和 F378D13（65 ± 9%）（图 3F、G），而对于传导速度较慢的模块，我们观察到相对于 WT 的氧气消耗速率总体增加（100%），F333W12（201 ± 29%）和 D386F12（132 ± 25%），F326W13 的例外情况除外（91 ± 24%）（图 3F、G），其中替代可能导致蛋白质结构不稳定。这些发现共同支持反转运蛋白模块在呼吸膜中也传导质子。

在这里，我们通过结合原子级 MD 模拟、定点突变实验、蛋白脂质体中的光谱研究以及孤立膜中的呼吸测定，探讨了复合物 I 中反转运蛋白模块的质子传导机制。总体而言，我们的发现强调了紧密调控的水分子在质子传导中的作用，这些水分子暂时连接可滴定残基，并提供了跨膜的逐步质子通道（图 5A）。我们发现，水合过程是由局部电场效应介导的，并且这一过程得到了非极性门控残基的结构支持，这些残基能够实现可控的润湿/去润湿转变（图5A,B）。这些观察结果也可以解释为什么高分辨率冷冻电子显微镜（cryo-EM）和大规模分子动力学（MD）模拟仅显示出复合体I膜域中的部分“质子”连接性。实际上，这种严格控制的动力学门控对于多种氧化还原活性质子泵的功能至关重要（24,44,47,53,54）（图5C），因为持续的质子传导会导致质子泄漏。

图5. 复合体I中类似逆转运蛋白亚基的质子门控示意图。(A) 质子传输是通过可滴定残基和水分子（红色）在保守的离子对打开时发生的。中央的非极性大分子残基（蓝色）通过创建局部门控位点来调节质子传输，从而防止泄漏反应。(B) 上图：质子传输路径上的水分子占据情况与电场；中图：Nqo13中路径上的通道半径（不包括可滴定残基本身）；下图：基于对各种生物体类似逆转运蛋白亚基的统计分析，显示了路径上非极性和极性残基的分布。（C）Nqo13（PDB ID: 4HEA）和MrpA复合体（PDB ID: 7D3U）中质子通道的结构；细胞色素c氧化酶的质子传导D通道（PDB ID: 8OVD/8OVC），以及细菌视紫红质的质子流入通道（PDB ID: 5B6V）。该图显示了可滴定残基和假定的非极性门控残基。

我们进一步研究了基于MD模拟 identifed 的非极性门控残基在生物物理实验中的作用。我们的模拟表明，水合过程是由电荷转移过程本身引导的，引入突变会导致局部质子门的扰动，这一点通过突变体实验得到了验证。总体而言，这些发现为探索蛋白质和水合动态如何与质子传输的自由能景观相关联提供了基础（参见参考文献（40））。在实验中，我们通过改进建立的基于LMNG的重组自动插入方法（50），实现了对分离的逆转运蛋白模块中质子传输的高度控制条件，从而能够创建能够维持较大（约200 mV）质子梯度的质粒脂质体，并利用吡喃和oxonol VI的光谱定量技术监测质子传输，时间覆盖到毫秒级别。这种质子传导可能源于两个方向上质子传输的加权平均值，因为逆转运蛋白结构具有优先方向，其中N端通道大约朝向质粒脂质体的内部（29）。虽然在完整的复合体I中逆转运蛋白可以在两个方向上传输质子，但目前尚不清楚这两个方向的传导速率是否对称。在这方面，可能可以通过改变脂质组成和/或电荷来实验性地控制逆转运蛋白模块的方向，例如在bo3氧化酶中的研究（55），从而探究前后传导速率的差异。

我们的实验进一步支持了质子传输是由瞬态水通道的形成所控制的观点。引入较小的残基（例如Phe到Val/Ala）显著提高了质子传导速率，而较大的残基（例如Phe到Trp）则降低了整体质子传导速率。这些发现也与先前的研究一致（14,21），表明复合体I的氧化还原耦合质子泵送活性受到N端质子通道入口处残基替换的影响。虽然所有逆转运蛋白变体都产生了稳定的蛋白质结构（图S14），但我们的MD模拟表明某些突变可能会在结构中引入微妙的构象变化（图S10）。模拟还表明，质子沿通道的传输以及门控残基的突变可以在距离突变位点20–30 ?范围内引发润湿/去润湿转变，这表明别构效应可能参与了质子传输过程。我们的模拟表明，假定的门控位点的分子动力学过程受到路径上中心可滴定残基固有质子化状态的调控。这些固有的质子化状态可以在局部促进门控的打开，并改变润湿转变的自由能，进而调节决定质子跨膜传输速率的关键质子化步骤，时间尺度达到毫秒级别。更一般地说，这些发现反映了蛋白质功能通过不同时间尺度的层次结构相互关联，从快速的纳秒/微秒时间域到较慢的毫秒时间域，这也与酶催化过程中的观察结果一致（56）。有趣的是，类似于这里描述的非极性收缩位点也在其他系统中被发现，例如在相关的多重抗性及pH适应性逆转运蛋白（Mrp）以及复合体IV（细胞色素c氧化酶）和细菌视紫红质（图5C）中。除了与水合转变相关的空间阻碍外，这些残基还可能提供一个独特的介电环境，有助于支持质子传输反应。在全新设计的最小质子通道中也有类似的效果得到支持（37），这表明我们的发现可能指导未来的合成质子泵的设计。

基于直接实验证据，确定哪些逆转运蛋白模块直接参与质子传输一直较为困难，因为突变会影响全局质子耦合电子转移（PCET）反应，并导致整个PCET机制的受阻。在这里，我们通过基于理论指导的自下而上方法研究分离的逆转运蛋白模块来规避这一挑战。我们的发现提供了复合体I长距离质子泵送功能背后的机制细节。

特别值得关注的是末端Nqo12亚基，它包含一个额外的螺旋结构（TM15），该结构与末端残基D38612共同作用，可能有利于质子的释放并引发质子化的反向波（参见参考文献（23））。早期的MD模拟（57）发现Nqo12的P端出口通道有显著的水合现象，而对整个复合体I的模拟（14）也揭示了其他逆转运蛋白亚基中聚集的平均水分子位置。基于这些模拟中观察到的Nqo12相对于其他逆转运蛋白亚基更高的水合程度（14,58），Zhang和Li（51）提出只有末端Nqo12亚基可能参与质子传输。实际上，Sazanov及其同事（7）采用了类似的“仅Nqo12”（NuoL/ND5仅）质子泵送模型，其中实验确定了D38612和P端大分子之间的四个水分子。此外，Parey等人（15）比较了冷冻电镜数据和MD模拟，提出了一个“仅Nqo12”类似的泵送模型，其中三个逆转运蛋白亚基共同摄取两个质子，同时这些质子也沿着末端Nqo12传输（参见参考文献（59）中的修订提案）。

我们当前的研究结果挑战了“仅Nqo12”模型，因为我们能够量化质粒脂质体膜中Nqo12和Nqo13的严格调控的质子传输活性，这种活性受到已识别门控位点突变的显著影响。因此，我们的发现也与从完整复合体I中去除ND5（Nqo12）和ND4（Nqo13）后质子泵送活性减半的结果相符（11），并总体上支持所有逆转运蛋白亚基（Nqo12/NuoL, Nqo13/NuoM, Nqo14/NuoN, 和 Nqo7/8/10/11/1/NuoA/J/K/H）都参与跨膜的质子传输。此外，我们的发现表明，在Nqo13中引入带电末端残基会导致P端通道中的水分子无控制进入（图2H和S10G），并显著增加质子传导速率（图3C,E），这预计会导致整个复合体的质子泵送活性失去控制。在Nqo12中，我们认为末端带电残基被额外的螺旋结构所屏蔽，在提议的反向波过程中可能起到关键作用。此外，用苯丙氨酸替换Nqo12中的末端带电残基会导致P端通道的水合程度降低（图2G和S9G），同时质子传导速率下降但未完全消失（图3B,D），这进一步证实了Nqo13中的相同末端残基控制质子传导，并不是从完整复合体中分离出来的结果。

分离的逆转运蛋白模块在天然膜中也能传导质子，这在复合体I膜域的组装过程中具有有趣的后果。正如这里所示，分离的模块表达会导致不可控的呼吸速率，这与逆转运蛋白构建体中的质子传导速率相关（图3F,G）。在完整复合体I机器的组装过程中，我们推测逆转运蛋白亚基可能被组装因子所包裹，从而防止它们消耗 proton motive force（pmf）。实际上，如NDUFAF1和CIA84等假定组装因子会结合ND2和NDUFC2（在酵母中），以及心肌脂质重塑酶Taffazin（60），可能为质子通道提供这样的“盖子”。

总的来说，我们的综合发现强调了质子通道的瞬态水合与动力学门控在控制复合体I逆转运蛋白模块跨膜质子传输过程中的复杂相互作用。

通过结合停流光谱和突变实验与MD模拟，我们展示了末端（Nqo12/NuoL/ND5）和次末端（Nqo13/NuoM/ND4）逆转运蛋白亚基通过形成连接可滴定保守残基的瞬态质子通道来传导质子。我们识别了位于收缩位点的非极性门控残基，这些残基提供了核心的调控位点，并为完整复合体I中严格控制的远距离能量转换机制奠定了基础。此外，我们发现Nqo12和Nqo13末端残基之间的电荷交换支持这两种逆转运蛋白构建体都能传导质子，同时也显示了它们在传导特性上的内在差异。总体而言，我们的理论指导实验揭示了电场效应和水合动态在生物系统中控制长距离电荷传输的机制原理。

**材料和方法**
**逆转运蛋白构建体的表达和纯化**
逆转运蛋白构建体Nqo12和Nqo13是根据我们先前开发的方案表达和纯化的（参见参考文献（29））。在这种方法中，pWALDO（29,61）-Nqo构建体被转化并过表达到Lemo21（62）大肠杆菌感受态细胞中。准备了含有l-鼠李糖（Nqo12为0.1 mM，Nqo13为0.5 mM）、氯霉素（30 μg/mL）和氨苄西林（100 μg/mL）的TB培养基，然后将培养物置于37°C下，并在OD600为0.5时加入IPTG（0.4 mM），随后温度降至25°C，并过夜培养。收集细胞并在重悬缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl）中匀浆。使用Emulsiflex进行裂解，通过高速离心（25,000 g，4°C，20分钟）去除细胞碎片。膜通过超速离心（250,000 g，4°C，2小时）收集。膜在2% LMNG（总蛋白浓度为6 mg/mL）中溶解，并搅拌1小时后，通过超速离心（250,000 g，4°C，30分钟）去除不溶性膜。上清液多次加载到5 mL His-Trap HP柱（Cytiva）中，该柱已预先用纯化缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole）平衡。用不同浓度的imidazole（20, 70, 125, 和 150 mM）洗涤柱子，然后用300 mM imidazole进行洗脱。纯化的蛋白质加载到HiLoad 16/600 Superdex 200pg分子排阻色谱柱中。相关组分被汇集并浓缩，使用NanoDrop分光光度计测量蛋白质浓度。

**门控突变的Design**
使用设计的引物（Thermo Fisher）（表S1）在pWALDO-Nqo表达质粒中引入单点突变，并通过DNA测序（Eurofins，瑞典乌普萨拉）进行确认。

**大肠杆菌ATP合成酶的表达和纯化**
ATP合成酶的纯化使用之前建立的类似方案进行（参见参考文献（29）。简而言之，在DK8大肠杆菌感受态细胞中表达了pFV2质粒。细胞在含有氨苄西林（100 μg/mL）和MgCl2（1 mM）的LB培养基中过夜培养。收集的细胞重新悬浮在裂解缓冲液（50 mM HEPES pH 8.0, 100 mM NaCl, 5%甘油）中。使用Emulsiflex进行裂解，通过高速离心（25,000 g，4°C，20分钟）去除细胞碎片。膜通过超速离心（250,000 g，4°C，1.5小时）收集。这些膜使用2%的LMNG在重悬浮缓冲液中（50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM KCl, 150 mM蔗糖, 0.8% II型大豆脂质）进行溶解，溶解浓度为每克细胞1.5 mL，随后通过超离心（250,000 g, 30分钟, 4 °C）去除未溶解的膜。上清液被分两次加载到5 mL的His-Trap HP柱（Cytiva）中，并用纯化缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5, 200 mM KCl, 150 mM蔗糖, 0.005% LMNG, 20 mM咪唑）预平衡。柱子先用含有20 mM和90 mM咪唑的纯化缓冲液清洗两步，然后使用285 mM咪唑进行洗脱。相关片段被收集并浓缩。纯化的蛋白质被加载到HiLoad 16/600 Superose 6pg柱（Cytiva）中进行大小排阻色谱分离。相关片段再次被收集并浓缩。浓度通过NanoDrop分光光度计进行测量。

蛋白质被重新组装成含有吡喃（HPTS）的蛋白脂质体。ATP合成酶和抗转运蛋白构建体的重组是通过使用II型大豆脂质制备脂质体，并将其重新悬浮在蛋白脂质体缓冲液（2 mM HEPES pH 7.3, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2）中，浓度为5 mg/mL来完成的。重新悬浮的脂质体经过7次冻融处理以破坏多层脂质结构。吡喃（HPTS—8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐）通过3次冻融过程掺入脂质体中，最终浓度为2 mM HPTS。通过将脂质体在100 nm孔径的膜（Nuclepore膜，Whatman Ltd.）上挤压21次来选择脂质体的大小。ATP合成酶和Nqo构建体（以ATP合成酶与Nqo亚基的摩尔比为3:4，脂质与蛋白质的比例为200:1）被加入到0.5 mg的预先制备好的脂质体中，并按照LMNG自动整合（LAiR）方法进行插入。重组过程在室温下进行40分钟后，使用PD-10柱（Cytiva）去除外部的吡喃。蛋白脂质体通过超离心（50,000 rpm, 4 °C）沉淀30分钟，然后用含有20 mg/mL脂质的蛋白脂质体缓冲液重新悬浮。

使用吡喃（HPTS）测量质子传导：抗转运蛋白构建体的质子传导通过Cary Eclipse荧光分光光度计（Agilent Technologies）和吡喃荧光来检测，激发波长分别为405 nm和460 nm，发射波长为510 nm。质子传导测试在塑料比色皿（d = 1 cm）中进行，使用5 μL的蛋白脂质体悬浮液，补充1 nM的缬氨霉素，最终体积为500 μL的蛋白脂质体缓冲液。基线在37 °C下平衡 until 信号稳定。测试在加入0.04 mM ATP后开始，并在7分钟后加入革兰霉素以消除产生的ΔpH。质子传导通过HPTS在460 nm和405 nm处的发射强度比值（R = I460/I405）来估算，并根据pH=a·log10(R)+b的关系进行pH值的计算，其中参数a和b来自校准曲线（图S13），得到a = 1.931和b = 7.926。ΔpH值计算为添加ATP前的初始pH值与加入革兰霉素后的最终pH值之差。初始pH值取第一分钟的均值，最终pH值通过单指数函数拟合实验曲线得到。数据来源于6-10次独立测量。HPTS实验的时间分辨率为600 ms。

使用Oxonol VI的停流实验：蛋白脂质体首先通过7次冻融循环从脂质悬浮液（5 mg/mL）中制备，然后使用孔径为100 nm的膜（Nuclepore膜，Whatman Ltd.）进行挤压。蛋白质使用LAiR方法（50）进行重组，ATP合成酶与抗转运蛋白的摩尔比为3:4。重组系统在室温下放置40分钟后，通过超离心（50,000 rpm, 4 °C）沉淀。蛋白脂质体用含有5 μM Oxonol VI（Sigma-Aldrich）的蛋白脂质体缓冲液重新悬浮，其中脂质浓度为0.2 mg/mL。蛋白脂质体与2 mM ATP一起加载到停流装置（Applied Photophysics）中，并在混合比色皿中最终达到1 mM的ATP和0.1 mg/mL的蛋白脂质体浓度。Oxonol VI的吸收信号在588 nm和625 nm下监测20秒，每个样本平均10-15次测量，以基于校准（图S13）来关联蛋白脂质体膜上的Δψ变化。校准通过将ΔA588nm–625nm与Δψ相关联，Δψ是通过不同钾浓度在脂质膜上的变化确定的（图S13，表S4）。初始速率通过反应开始后的第一秒的线性拟合获得。停流实验的时间分辨率为2 ms。

膜中的氧气消耗测量：使用Clark电极（Hansatech Oxygraph+）测量含有表达的抗转运蛋白构建体的分离膜的氧气消耗。测量在37 °C下进行，使用1 μL的分离膜在1 mL的膜重悬浮缓冲液（25 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl）中。在基线收集30秒后加入400 μM NADH开始反应。为了计算氧气消耗速率，将测量数据的线性范围拟合到线性函数中，数据来自6-10次独立测量。最终值经过Pierce BCA蛋白测定试剂盒校正总蛋白浓度，并用FeCN测定法校正NADH脱氢酶活性。为此，使用UV–vis分光光度计（UH5300 Hitachi）测量410 nm处的FeCN吸收。塑料比色皿中最终体积为1 mL的膜重悬浮缓冲液，加入1 mM FeCN和0.1 mM NADH。测试通过添加1 μL含有表达Nqo构建体的分离膜开始，并在37 °C下进行。FeCN吸收衰减速率基于线性拟合计算（图S18）。sf-GFP荧光（63）使用Cary Eclipse荧光分光光度计（Agilent Technologies）检测，激发波长为485 nm，发射扫描范围为500至600 nm。在此过程中，20 μL的分离膜被重新悬浮在500 μL的膜重悬浮缓冲液中。最终值从510 nm的发射峰获得，并根据总蛋白浓度进行校正。

分子动力学模拟：在POPc/POPG/CDL脂质膜中嵌入的孤立抗转运蛋白模块Nqo12和Nqo13上进行了原子级（MD）模拟，采用了之前的MD模型。（29）Nqo12和Nqo13从T. thermophilus Complex I（PDB ID：4HEA）中提取，（4）然后去除Nqo12的两亲性螺旋（残基516–606）。抗转运蛋白模块被嵌入膜中，用TIP3P水分子水化，并用150 mM NaCl中和。模型分别包含约59,400个（Nqo13）和约98,000个（Nqo12）原子。在Visual Molecular Dynamics（VMD）中创建了计算机模拟替换。（64）模拟在T = 310 K、p = 1 bar下进行1000 ns的三重实验，时间步长为2 fs，并使用CHARMM36m力场。长距离静电作用采用Particle Mesh Ewald方法处理，网格间距为1 ?。MD模拟使用NAMDv.2.14/v.3.0进行，（65）而VMD（64）和MDAnalysis用于可视化和分析。更多模拟细节见表S1和S2。（66,67）

质子路径分析：使用Caver3.0中实现的基于结构的隧道搜索算法（69）来识别质子路径。重原子通过范德华半径近似为球体，并从用户指定的起点向溶剂体积方向搜索最大的腔体。隧道探针半径设置为0.9 ?，搜索起点分别位于Nqo12的K329和Nqo13的K235，同时排除可质子化的残基以及通道中的大体积门控残基。初始隧道通过将隧道延伸到溶剂体积手动优化，组合隧道段以获得跨整个膜段的连续区域。水分子占据率通过计算给定隧道坐标周围2 ?半径内的水分子数量获得。（68）隧道占据率计算为含有水分子的帧数与总分析帧数的比值。给定隧道坐标处的电场向量通过内部脚本结合TUP?（69）进行量化，排除溶剂分子，并使用2 ?的截止值进行可视化，使用VMD（64）。

参考文献与支持信息。