多实验室评估揭示了电喷雾离子化质谱中离子种类的差异性

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Multi-Laboratory Assessment Reveals Variable Ion Species Profiles in Electrospray Ionization Mass Spectrometry

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电喷雾离子化（ESI）是质谱（MS）中的基础技术，广泛应用于测量各种化学和生物样品中的非挥发性分子。然而，ESI-MS仪器、操作设置以及溶剂组成等参数的变化会形成特定的局部离子化环境，从而影响特定分析物的离子种类形成。随着ESI不断推动分析发现的发展，理解离子种类形成变化对实验内和实验间结果的影响程度至关重要。在这里，我们通过分析四种供应商（Agilent Technologies、ThermoFisher Scientific、Shimadzu Corporation和Waters Corporation）的高分辨率ESI-MS仪器在十个实验室中制备的内部保留时间标准（IRTS）混合物来评估离子种类形成情况。选择这些仪器供应商并非为了评估性能，而是为了捕捉与商业平台固有的源设计、离子光学系统及分析仪/探测器等方面的差异。尽管使用了标准化的提取和色谱协议，但由于仪器配置、源条件和方法执行的不同，导致不同供应商之间、同一供应商的不同实验室之间，甚至同一实验室内部也存在离子种类形成的差异。这些发现表明，即使采用标准化的方法，局部离子化环境对离子种类形成的综合影响仍然是解释LC–MS小分子数据并提高研究间重现性和可比性的关键障碍。

**特别专题**
作为《美国质谱学会杂志》“Biemann: 接受未知”特别专题的一部分发表。

**引言**
自1984年首次发表以来，电喷雾离子化（ESI）通过实现非挥发性分子的离子化，对质谱技术产生了变革性影响。(1,2) 这一进展促进了包括蛋白质组学、代谢组学和脂质组学在内的广泛研究。(3?5) 在蛋白质研究中，ESI加深了我们对蛋白质表达、结构和修饰的理解，阐明了生物信号机制及其在多种疾病状态下的变化。(6,7) 同样，代谢组学和脂质组学利用ESI-MS来表征植物对环境压力的响应、人类疾病的发生机制，以及农业、食品与人类健康之间的复杂相互作用。(8?11) 伴随ESI的技术创新还使得测量大分子成为可能，例如千道尔顿到兆道尔顿级别的系统，如天然膜蛋白、RNA-配体复合物和病毒衣壳。(12?14) 因此，ESI现在已成为一种广泛商业化的离子化技术。尽管不同MS供应商采用相同的核心原理，但在源几何结构设计和辅助机制（如保护气/帘幕气体、升温等）方面的工程应用存在差异。(15) 例如，Agilent Technologies的Jet Stream ESI技术使用加热的保护气来增强离子传输。(16) 相反，ThermoFisher的加热ESI（HESI）源应用于某些Orbitrap仪器中，采用沿毛细管均匀分布的加热保护气，这与Jet Stream系统的集中式应用有所不同。(17) 在其他ESI-MS系统中，如Shimadzu仪器上，设计了双离子化功能，允许快速切换ESI和大气压化学离子化（APCI），进一步扩展了可测量小分子的范围。(18) 实际应用中，这种设计通常需要权衡ESI毛细管电压的降低，但通过辅助加热器来补偿这一影响。离子化后，商用MS仪器还使用独特的离子路径和聚焦技术来促进下游分析和检测。(19) 随着各供应商对其系统中的ESI和离子传输过程进行改进，证据表明，不同供应商之间以及同一供应商不同型号仪器之间的源设计和操作条件的差异会影响离子种类形成。(20?23)

然而，离子化不仅受源设计和操作的影响。实际上，ESI微环境中喷雾溶液的化学组成是一个关键的可调控参数，可以用来引导特定离子形成路径。(24?26) 例如，溶剂组成显著影响液滴行为，有机溶剂促进更快的脱溶，而质子溶剂则稳定氢结合簇并促进[M + H]+加合物的形成。(18,27) 此外，酸碱添加剂和盐修饰剂也被广泛用于提高离子化效率并定向形成加合物。例如，铵盐可以促进[M + NH4]+的形成，而酸和碱（如甲酸或氨水）可以改变质子化平衡，从而偏向于特定加合物的形成。(20,25,28,29) 总之，ESI是一个强大且多变的离子化过程，受可控和不可控因素的共同影响。

在基本层面上，影响局部ESI离子化环境的因素对离子种类形成有显著影响。结合对ESI机制的不完全理解，这导致了多因素变异性，从而挑战了ESI-MS生成数据的可重复性和可比性。(25,26,30,31) 这种变异性的一个关键方面是离子种类形成（包括加合物、中性损失和多聚体），这是离子生成、检测、注释和量化的关键步骤。(26,32) 尽管长期以来人们已经认识到离子种类形成在ESI-MS中的重要性，但对实际应用中离子种类形成模式如何差异的系统评估仍有限，尤其是在仪器平台和方法实现可能不同的情况下。对于多样化的小分子研究领域，这种差距尤为明显，需要理解离子种类形成如何影响靶向和非靶向代谢组学应用。

**方法**
**材料和试剂**
**内部保留时间标准（IRTS）**
反向相位内部保留时间标准（IRTS）由AnalytiCon Discovery（德国波斯特达姆）制备。IRTS混合物中的33种化合物被选为：(i) 可通过LC-ESI-MS检测；(ii) 不太可能自然存在于食物中；(iii) 在标准反向相位方法的整个色谱范围内能被分离；(iv) 具有商业化潜力，可作为全球 distribute 的非靶向代谢组学试剂。(33) IRTS化合物及其使用rdkit（版本2025.09.3）计算的理化性质详见支持信息表S-1。(34)

**胡萝卜的采购和加工**
在美国科罗拉多州Fort Collins的超市购买了橙色胡萝卜（Daucus carota subsp. sativus）。随机选取了约200克商用胡萝卜，并在标准商业处理和储存条件下运输到实验室。所有胡萝卜合并后制成一个统一样品。采集后，去除胡萝卜顶部和外皮，切成半英寸大小的块状，并在-80°C下冷冻。冻干后经过72小时完全干燥。干燥后的胡萝卜块用咖啡研磨机均质化，分成55 ± 5毫克的样品。这些样品在-80°C下保存，直到分发时与干燥的IRTS材料一起用干冰运送到参与实验的实验室。实验室A2和T1使用类似的方法独立采购和加工本地胡萝卜（表S-2）。

**实验室特定试剂**
各实验室收到的IRTS和胡萝卜样品为干燥粉末状，收到后储存在-80°C。每个实验室按照标准化协议进行复悬、提取和LC–ESI-MS数据采集，允许灵活选择试剂和材料。所有溶剂均由各实验室根据实际情况选择，以反映全球各地实验室现有的资源。(35) 实验室特定试剂的完整清单详见支持信息表S-3。

**样品制备**
**IRTS的复悬和稀释**
收到后，IRTS样品在每个实验室准备的1.1 mL 80:20甲醇/水（MeOH/H2O）溶液中复悬。对于实验室A2和T1，该溶液用于制备不同浓度的IRTS溶液；其他实验室制备单一浓度的IRTS溶液，然后通过固相提取（SPE）进行分析。

**固相提取**
胡萝卜和空白IRTS样品按照PTFI标准化的非靶向代谢组学方法进行提取。(33) Agilent的SPE Captiva柱子首先用120 μL 80:20 MeOH/H2O和480 μL 5:1乙腈/水溶液（含1%甲酸）（冲击溶液）进行预处理。实验室W1、A1、A4、S2和T2采用正压歧管，每3–5秒滴加一次溶剂；实验室T1、T3、A2、A3和S1使用真空过滤系统实现类似的溶剂洗脱。完成后，样品在气体流动下放置10分钟以确保完全干燥。

冻干的胡萝卜样品在室温下恢复至室温（约30分钟），然后每个样品用12 μL 80:20 MeOH/H2O复悬。在此步骤中，还为每个样品加入600 μL 80:20 MeOH/H2O以制备空白样品。样品在室温下涡旋10分钟后，以14,000 RCF离心。每个样品的上清液（120 μL）加入预装了480 μL冲击溶液的SPE柱中，再加入10 μL复悬的IRTS。然后在氮气加压下，设置流速为每3–5秒滴加一次样品。收集的洗脱液在3500 RCF下离心10分钟后干燥；除使用SpeedVac的实验室A3和T2外，其他实验室使用氮气蒸发器完成干燥。样品随后在事先确定的最佳体积（根据仪器类型而定）的80:20 MeOH/H2O中复悬。样品在室温下再涡旋10分钟，然后暂时储存以待LC–MS分析。提取条件的具体参数详见支持信息表S-4，所用溶剂信息见表S-3。

**数据收集**
**LC–MS数据采集**
各实验室按照PTFI标准化的非靶向代谢组学工作流程进行反向相位LC–ESI–MS数据采集。(33) 色谱分离使用Agilent Zorbax SB-Aq RRHD柱（2.1 mm × 100 mm × 1.8 μm粒径），并配有Agilent内联过滤器（0.3 μm，2 mm内径），温度设置为30°C。流动相A为LC–MS级水（H2O）含0.1% LC–MS级甲酸，流动相B为LC–MS级乙腈含0.1% LC–MS级甲酸。所有实验室均使用表S-3中列出的溶剂进行相同的色谱分离，流速设置为0.6 mL/min，线性梯度时间为15分钟。色谱开始时B相浓度为1.8%，保持1分钟后升至90%再维持10分钟，随后再平衡至1.8%持续3.2分钟。除实验室A4外，所有实验室向柱中加入2 μL样品。IMS分离时需要4 μL样品和4位IM多路复用以增强信号强度。(36,37) 质谱数据仅在Waters仪器（1台）、Shimadzu仪器（2台）、ThermoFisher仪器（3台）和Agilent仪器（4台）上以“仅前体”模式采集。对于TOF分析仪，采集率为每秒2–3次扫描。建议实验室采用质心模式采集数据以支持文件共享。其他质谱仪设置由各实验室自行根据小分子分析需求调整。各实验室的具体参数和型号信息详见支持信息表S-5–S-8。

**确认性IMS数据采集**
LC–IM–MS数据由范德比尔特大学创新技术中心（Lab A4）使用Agilent 1290 Infinity II UHPLC和Agilent 6560 IM-QTOF MS平台采集。IM-MS数据是通过正负ESI技术在m/z 50至1700范围内收集的，周期时间为每秒2.1帧。在ESI之后，离子在陷阱中积累3900微秒，然后释放到使用超高纯度（UHP）氮气的离子迁移率漂移管中180微秒。离子迁移率扫描以7的瞬态速率和4位复用技术收集，以增强占空比。分离的最大漂移时间设置为60毫秒。

为了验证选定IRTS加合物的物种，科罗拉多州立大学分析资源核心团队（Lab W1）使用与支持信息表S-4中相同的LC和ESI设置收集了数据依赖性采集（DDA）数据。Waters的DDA数据是在Xevo MRT上收集的，使用包含列表来优先选择单个IRTS分子的加合物（表S-9）。还使用了动态排除技术，排除窗口为6秒，质量差异为100 ppm。初始时，前体扫描在m/z 50–1200范围内进行，速率为每扫描0.1秒。当单个离子强度超过3000时，采集方式切换到MS/MS。在此期间，MS/MS数据收集直到离子积累达到TIC阈值100,000或收集了0.2秒的数据。在整个MS/MS采集过程中，LM分辨率设置为6.0，以将四极杆传输窗口限制在M0同位素上。

原始的、由供应商编码的LC–ESI–MS数据使用Skyline（版本24.1.0.414）进行处理。(38) 为目标IRTS分子开发了目标库，这些分子在负模式或正模式下都有观测到。搜索的正ESI离子物种包括质子化形式([M + H]+)、钠化形式([M + Na]+)、钾化形式([M + K]+)、铵加合物([M + NH4]+)和质子化二聚体([2M + H]+)。对于负ESI，搜索的离子物种包括去质子化形式([M – H]?)、甲酸根加合物([M + COOH]?)、醋酸根加合物([M + C2O3H]?)、氯加合物([M + Cl]?)以及去质子化的水损失([M – H2O – H]?)。

跨仪器的 data 通过电离模式一起处理。每个IRTS的候选峰根据其质量准确性（≤5 ppm）和原始保留时间值与先前建立的PTFI保留时间库值的接近程度进行评估。(33,39) 值得注意的是，由于配置差异（如从LC出口到MS入口的死体积）在原始保留时间数据中没有考虑，PTFI保留时间库在不同仪器之间的准确性是可变的。(40) 然而，这些差异的一致性导致峰的可重复洗脱，无论这些差异如何，仍然支持IRTS的识别。一旦识别出来，所有IRTS信号在导出最终数据之前都进行了手动积分（表S-10）。所有数据以及原始的、由供应商编码的文件都可在Panorama Public上找到（https://panoramaweb.org/5co3dQ.url）。(41) IMS数据分析LC–IM–MS数据使用PNNL PreProcessor（版本4.0）进行处理，以解卷积复制的信号。(42) 然后将文件上传到IM-MS Browser（Agilent，版本10.0），在那里使用实验开始时获取的校准离子（tune mix）进行对齐。(43) 从那里开始，搜索IRTS加合物，并使用单场CCS方法（方程1）确定到达时间和实验碰撞截面（CCS）值。(43)CCS=(??A???fix)??????B+??a??a?????????????√CCS=(tA?tfix)zβmB+mama(1)其中，tA和ma是特定离子物种的到达时间和质量，mB是缓冲气体（N2）的质量，z是离子电荷。参数β和tfix是从校准曲线斜率和tune mix的标准CCS值的回归中获得的。实验CCS值在支持信息表S-11中呈现。

DDA数据使用SeeMS软件进行分析，其中根据先前采集的m/z和保留时间值选择前体分子。(44) 手动处理过程中，将洗脱窗口隔离出来，以提取每个目标分析物的DDA数据。同时采集了IRTS样品和80:20 MeOH/H2O空白样品的数据。然后将光谱数据输入到R（版本4.4.3）中，使用ggplot2（版本4.0.0）和dplyr包（版本1.1.4）绘制IRTS和溶剂空白样品的原始DDA谱图。(45) 原始数据也可在Panorama Public页面（https://panoramaweb.org/5co3dQ.url）上找到。(41) 数据处理、可视化和统计分析数据处理Skyline中的数据在R（版本4.4.3）中使用tidyverse包（版本2.0.0）进行处理。(45) 这包括将提取的离子色谱图（EIC）数据与元数据合并，以定义每次注射的实验室、仪器和样品类型。负模式和正模式的强度（峰面积）阈值分别为2000和5000。这些阈值是通过计算平均噪声值并乘以三来确定的。为了去除错误注释，使用了额外的质量过滤器≥15 ppm。任何与PTFI保留时间库值（±1分钟）不符的注释在数据对齐之前被手动从数据中移除。

为了考虑每个实验室优化的不同重悬体积（RV）和注射体积（IV），定义了一个稀释因子（DF）。这个术语还包括了一个样品浓度因子（SCF），以适当地处理双浓度（2X）样品（方程2）。DF=RV(????)/IV(????)SCFDF=RV(μL)/IV(μL)SCF(2)这个稀释因子与原始面积值相乘，以考虑IRTS制备中的变异性，并确保在每个仪器上的最佳分析。然后这些数据被归一化到每次注射中所有离子的总IRTS信号上，以完成数据的定量对齐（表S-12）。处理后的数据（表S-12）用于定性评估实验室之间以及同一实验室内重复注射之间的离子物种形成。对于每次注射中的每个IRTS化合物，首先识别最丰富的离子物种。为了评估实验室之间的差异，通过跨实验室的计数汇总了最丰富的离子物种。同样的方法应用于重复注射，以评估同一供应商内以及单个实验室内的仪器一致性。所有分析都是分别对空白+IRTS和胡萝卜+IRTS数据集进行的。

为了评估谱型，生成了观察到的离子物种及其相对强度的箱线图和须状图，以比较不同平台上的相对加合物物种分布。使用Kruskal–Wallis检验进行统计分析，随后使用Dunn检验来确定成对显著性。(46,47) 在确定显著变化之前，所有p值都使用Benjamini–Hochberg校正进行了调整（α ≤ 0.05）。(48) 这些测试的结果在支持信息表S-13中呈现。通过比较为IRTS + 空白或IRTS + 胡萝卜样品收集的个别重复样本来评估实验室内的离子物种谱型。

为了评估离子物种形成的差异，我们在十个实验室实施了Periodic Table of Food Initiative（PTFI）标准化的非靶向代谢组学方法（图1A）。为了分析，所有实验室都收到了PTFI内部保留时间标准（IRTS）混合物，该混合物的开发是为了通过对准色谱数据来支持这种方法的可比性（详见支持信息表S-1中的完整IRTS列表）。IRTS混合物以干粉形式发送，以确保参与实验室的全球网络中的样本完整性。收到后，实验室在采集LC–MS1数据之前实施了标准化的重悬和准备IRTS的工作流程。在执行过程中，由于可用设备和试剂的差异，方法转换出现了一些变化。然而，所有材料都符合最低标准（即所有溶剂都是LC–MS级试剂），以考虑对离子物种形成的潜在影响。例如，LC–MS级乙腈（ACN）的溶剂供应商根据采购的可行性、成本和实验室偏好而有所不同（详见表S-3中的更多溶剂信息）。同样，根据可用设备的不同，样品制备使用正压歧管或真空过滤完成。一旦准备好进行LC–MS1分析，实验室就在独立优化的仪器上实施了标准化的色谱方法，以获取正负ESI的小分子数据。

图1图1. 所有IRTS化合物的离子物种形成概览。(A) 实验设置的示意图，其中均匀的IRTS混合物被分发到合作实验室。实验室首先将其在80:20甲醇/水中重悬，然后稀释到最佳浓度（数据未显示）。实验室按照PTFI非靶向代谢组学标准化的反相LC方法收集数据。(33) MS数据使用每个实验室为小分子分析优化的参数进行收集。尽管有标准化协议，但由于便利性和物流原因，不同实验室在方法采用上仍存在差异，包括溶剂的来源、重悬体积和仪器设置。(B) 所有仪器供应商中最丰富的负模式离子物种显示（[M – H]?，红色；[M + HCOO]?，橙色；[M + Cl]?，粉色；以及未检测到，白色）。(C) 所有仪器供应商中最丰富的正模式离子物种（[M + H]+，蓝色；[M + Na]+，绿色；[M + K]+，浅绿色；[M + NH4]+，蓝绿色；以及未检测到，白色）。对于这两种图，最丰富的离子物种是通过计算所有注射中最丰富的离子物种来确定的。IRTS化合物的完整参考以及方法实施和仪器参数可在支持信息表S-1、S-3–S-8中找到。

高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片这里呈现的结果反映了来自十个实验室的数据，每个实验室都使用来自四个领先商业供应商的独特仪器模型：Agilent Technologies（4个实验室，A1-A4）、Shimadzu Corporation（2个实验室，S1–S2）、Thermofisher Scientific（3个实验室，T1–T3）和Waters Corporation（1个实验室，W1）。提及供应商并不是为了暗示性能差异，而是为了提供一个实际框架，以捕捉由于来源设计、离子光学和与商业平台耦合的分析仪不同而产生的变异性。实际上，标准化方法的转换还包括其他几个可能驱动实验内外离子物种形成变化的因素。这些数据用于使用负正电喷雾离子化评估33种IRTS化合物的离子物种谱型的变异性。在这些化合物中，有32种在正离子模式下被检测到，26种在负离子模式下被检测到。

我们首先通过识别每个实验室每次注射中最丰富的离子物种，并汇总顶级离子物种的数量来确定每个仪器供应商中最丰富的离子物种来评估IRTS化合物的离子物种谱型。按仪器供应商分组考虑了来源设计、离子光学和与商业平台耦合的分析仪的固有差异。实际上，离子物种形成的变化还受到其他因素的影响，并不反映个别仪器的性能。这些谱型在每个仪器供应商之间进行了比较，数据是在负正ESI模式下收集的。在负模式下，26种IRTS化合物中有19种（73%）在所有供应商中被检测为相同的离子物种（5 [M + HCOO]?，14 [M – H]?）（图1B）。剩余七种IRTS化合物的首选离子物种在不同仪器平台上有所不同。其中，三种化合物表现出单一的异常值。例如，259_XZAC在所有供应商的仪器上都被检测为[M – H]?，除了Shimadzu，该化合物在那里未被检测到。这种观察可能受到ESI/APCI双源设计的影响；然而，无法做出明确的归因，因为影响电离的其他因素在这些比较中也有所不同。(18) 同样，326_MADN和484_FKDB在所有仪器上都被检测为[M – H]?，除了ThermoFisher和Shimadzu；而在ThermoFisher上则优先检测到[M + HCOO]?。IRTS化合物345_VKUB和393_SEKI在不同仪器供应商上的离子物种形成模式更为多样，而在Shimadzu仪器上这两种化合物都没有被检测到，而在Thermo仪器上[M + Cl]?和[M + HCOO]?更受青睐。此外，对于345_VKUB，在Agilent仪器上检测到的最丰富离子形式是[M + HCOO]?，使其成为唯一一个在所有仪器供应商中观察到的不同（即不是[M – H]?）最丰富的离子物种。值得注意的是，在三个报告使用安捷伦仪器并提及溶剂供应商的实验室中，LC–MS级丙腈和甲醇的来源和目录编号是相同的，这为这种一致性提供了一个潜在的解释，而这种一致性超出了仪器本身的范畴。在19种IRTS化合物中，有相同的离子种类在各个实验室中被观察到是最丰富的，每种化合物至少检测到两种离子种类。值得注意的是，IRTS化合物的计算物理化学性质（包括LogP、极性表面积和氢受体/供体数量）都无法解释离子种类形成的模式（表S-1）。尽管不同供应商之间的IRTS离子种类存在差异，但同样值得注意的是，离子种类形成的变化也可能来源于方法执行、溶剂来源和样品制备的差异。在不同的供应商中，没有两个实验室完全以相同的方式执行标准化方法，这强调了观察到的变异性反映了仪器、溶剂来源和实验室操作的综合影响。

接下来，我们考虑了使用正ESI检测时不同仪器供应商之间的离子种类谱。在这里，32种IRTS化合物中有17种（53%）在所有仪器上都检测到相同的离子种类([M + H]+）（图1C）。对于剩余的15种IRTS化合物，最丰富的离子种类在不同仪器平台上是变化的（还有其他变化因素）。值得注意的是，虽然在正ESI下更多化合物表现出这种变异性，但趋势是相似的。即在8种IRTS化合物（230_MWSU、239_QQKI、339_YZKY、393_SEKI、400_OOAY、484_FKDB、553_YWXP和582_ULGJ）中，有一种独特的离子种类只在其中一个商业供应商的仪器上被检测到。这种独特性最常见于Waters仪器上，上述7种IRTS化合物中有5种在该仪器上被检测为独特离子种类。这个ESI-MS供应商只在一个实验室中出现，并且包括了可能与该观察结果相关的溶剂供应商和样品制备等外部因素。化合物339_YZKY在除了ThermoFisher之外的所有仪器上都被检测为[M + Na]+，而在ThermoFisher上则被检测为[M + NH4]+；化合物582_ULGJ在除了Agilent之外的所有仪器上都被检测为[M + Na]+，而在Agilent上则被检测为[M + NH4]+；化合物230_MWSU在除了Shimadzu之外的所有仪器上都被检测为[M + Na]+，但在Shimadzu上未被检测到。这些特定IRTS化合物的缺失仅在Shimadzu仪器上观察到，可能反映了特定分析物的电离效率受到独特来源设计的影响。然而，其他因素也可能导致这些观察结果，包括整体仪器灵敏度、污染物、离子抑制或源内裂解等。同样，不同实验室之间方法执行的差异也可能对此有所贡献。

五种IRTS化合物（259_MAYK、304_PUZK、306_OOPX、314_XVJI和345_VKUB）在至少两个供应商的仪器上显示出动态的离子种类形成。具体来说，459_OFAM在安捷伦和Waters仪器上被检测为[M + Na]+，在ThermoFisher仪器上被检测为[M + H]+，在Shimadzu仪器上被检测为[M + NH4]+。类似地，565_NYJF在安捷伦和Waters仪器上被检测为[M + Na]+，在ThermoFisher仪器上被检测为[M + NH4]+，但在Shimadzu仪器上未被检测到。正负ESI模式下的动态偏好共同表明了小分子离子种类形成的复杂且多变的进程，这可能反映了仪器设计和操作以及其他变量（如方法执行、溶剂组成、样品制备、仪器灵敏度以及可能的源内过程，包括裂解或离子抑制）的综合影响。

不同供应商仪器之间独特离子种类的形成并不令人意外；然而，我们预期在同一供应商的仪器内部应该差异较小。为了探讨这一点，我们汇总了使用同一供应商仪器的多个实验室的数据，从而评估仪器操作和方法采用的内部变异性。这包括Shimadzu（2个实验室：S1和S2）、ThermoFisher（3个实验室：T1、T2和T3）和Agilent（4个实验室：A1、A2、A3和A4）的数据。由于只有一家实验室使用Waters仪器（W1），因此没有包括Waters仪器的数据。

我们首先评估了同一供应商内部最丰富离子种类形成的连贯性（图2A），发现与不同供应商之间观察到的偏好离子种类的多样性相比，同一供应商内部的变异性较小。也就是说，在两个Shimadzu实验室（S1和S2）中，所有IRTS化合物的最丰富离子形式是相同的。尽管IRTS制备条件和仪器型号存在差异，这些差异可能导致来源、离子路径和其他组分的差异（支持信息表S-3、S-4和S-7）。相反，ThermoFisher和Agilent仪器之间的离子形式有所不同，ThermoFisher供应商组的3种仪器对于五种IRTS化合物显示了不同的偏好离子形式。同样，使用Agilent仪器的四个实验室也检测到了五种IRTS化合物的不同偏好离子形式。有两种IRTS化合物，326_MADN和345_VKUB，在ThermoFisher和Agilent系统中的离子形式是一致的（图2B）。其余具有变化离子谱型的IRTS化合物分别仅存在于ThermoFisher（304_PUZK、393_SEKI和454_FKDB）或Agilent（314_XVJI、400_OOAY、459_OFAM）仪器中。

图2
图2. 负ESI模式下商业仪器供应商中的离子种类形成。（A）饼图反映了Shimadzu（2个实验室，左侧）、ThermoFisher（3个实验室，中间）和Agilent（4个实验室，右侧）仪器中所有IRTS化合物的加合物种类形成谱型。饼图的深色部分表示在各个实验室中观察到相同离子种类的IRTS化合物的比例。浅色部分表示在各个实验室中离子种类不同的IRTS化合物的比例。（B）特定IRTS化合物的维恩图，显示了在不同实验室中离子种类不同的情况：Thermo仪器（左侧），Agilent仪器（右侧）。（C）三种ThermoFisher实验室（左侧）和四个Agilent实验室（右侧）中IRTS化合物326_MADN的离子种类丰度的标准化箱线图（以面积表示）。每种仪器供应商内部离子种类的显著差异（p值≤0.05）用星号标示。（46?48）（D）实验室A1和A4中326_MADN离子种类的提取离子色谱图（EICs）。实验室T1中326_MADN离子种类的EIC：高浓度（左侧），低浓度（右侧）。

从这里，我们进一步研究了使用同一供应商仪器的不同实验室之间离子种类谱型的变化，尽管模型、操作设置和其他方法采用变量仍然存在差异。我们分析了使用IRTS化合物326_MADN的离子种类谱型的ThermoFisher和Agilent实验室的数据。在每次进样中，离子面积被标准化并绘制成图表，以显示每个实验室中离子种类丰度的变化。在使用ThermoFisher仪器的实验室中，数据显示了326_MADN负ESI离子种类形成的几个独特特征（图2C）。具体来说，在实验室T1中，[M – H]?和[M + HCOO]?都非常丰富，分别平均占326_MADN信号的48.1%和44.4%。这显著高于[M + Cl]?，后者仅占326_MADN信号的7.5%。相反，在实验室T2中，[M + HCOO]?占326_MADN信号的76.5%，而[M – H]?和[M + Cl]?离子种类分别较低，分别为18.8%和4.8%。在实验室T3中，[M + HCOO]?再次成为最丰富的离子种类，占326_MADN总信号的54.8%。这种离子种类与[M – H]?（17.6%）和[M + Cl]?（27.6%）离子种类之间没有显著差异。使用Agilent仪器的实验室中326_MADN的标准化离子谱型也有所不同。具体来说，在实验室A1中，[M + HCOO]?占326_MADN总信号的54.2%。这显著高于[M + Cl]?的11.5%，但与[M – H]?离子种类相当，后者占总信号的34.3%。实验室A2显示了类似的326_MADN离子种类分布，[M + HCOO]?、[M – H]?和[M + Cl]?的相对强度分别为51.7%、41.1%和7.2%。相反，实验室A3和A4的仪器更偏好[M – H]?离子种类。在实验室A3中，[M – H]?占326_MADN总信号的62.6%，这显著高于[M + Cl]?的3.9%，但与[M – H]?离子种类相当，后者占总信号的33.5%。在实验室A4中，[M – H]?是最丰富的，占326_MADN总信号的93.5%，显著高于[M + Cl]?的6.1%和[M – H]?的0.6%。在所有Agilent和ThermoFisher仪器中，仪器型号和操作参数（例如电压、温度、溶剂来源）的差异可能导致观察到的离子种类形成变化。值得注意的是，实验室A4是唯一使用Agilent 6560系统的，该系统包含一个额外的漂移管离子迁移阶段，这可能解释了[M + HCOO]?加合物种类的显著缺失。

为了对这些模式进行背景分析，我们检查了来自Agilent和ThermoFisher仪器的代表性离子种类，以突出共同特征和供应商特定的特征。实验室A1显示以[M + HCOO]?为主的谱型，[M – H]?和[M + Cl]?的丰度较低。相比之下，实验室A4表现出明显的反转，其中[M – H]?是最丰富的离子种类（图2D）。实验室T1的稀释系列数据提供了关于离子种类强度依赖于浓度的额外见解。即在较低的分析物浓度下，甲酸盐离子种类占主导地位，而在较高浓度下，脱质子化种类变得占主导。这些结果表明，除了实验室之间的差异外，最丰富的离子种类还可能受到分析物浓度的影响。其他研究也展示了哌啶类似物的浓度依赖性离子形成偏好，为解释非靶向和半靶向小分子应用中离子种类形成的因素增加了另一层复杂性。

这项分析也对正ESI模式下的离子种类形成进行了研究。我们观察到所有三个供应商之间的离子种类谱型存在差异（图3A）。对于Shimadzu仪器（两个实验室：S1和S2），两种IRTS化合物的最丰富离子种类不同；而对于ThermoFisher仪器（三个实验室：T1、T2和T3）和Agilent仪器（四个实验室：A1、A2、A3和A4），十一种IRTS化合物的最丰富离子种类不同。没有一种IRTS化合物在所有三个供应商的仪器上都显示出变化的离子种类谱型（图3B）。然而，有六种IRTS化合物在Agilent和Thermo实验室之间显示出离子种类形成的变化。这些化合物包括256_MAYK、314_XVJI、345_VKUB、459_OFAM、484_FKDB和582_ULGJ。Shimadzu实验室仅对一种IRTS化合物326_MADN的离子种类形成显示出独特变化。值得注意的是，这种化合物在负ESI模式下也在Agilent和ThermoFisher仪器上显示出变化。ThermoFisher实验室在四种IRTS化合物的最丰富离子种类上也显示出变化：230_MWSU、304_PUZK、332_YZKY和565_NYJF。同样，四个Agilent实验室在五种IRTS化合物的最丰富离子种类上也显示出变化：201_BWJD、239_QQKI、393_SEKI、400_OOAY和553_YWXP。值得注意的是，304_PUZK和400_OOAY在负ESI模式下也显示出变化的偏好离子种类。总体而言，这些结果揭示了正ESI模式下离子种类形成的变化比负ESI模式更大。

图3
图3. 正ESI模式下商业仪器供应商中的离子种类形成。（A）饼图反映了Shimadzu（2个实验室，左侧）、ThermoFisher（3个实验室，中间）和Agilent（4个实验室，右侧）仪器中所有IRTS化合物的离子种类形成谱型。饼图的深色部分表示在各个实验室中观察到相同离子种类的IRTS化合物的比例。饼图的浅色部分反映了在不同实验室中离子种类存在差异的IRTS化合物的比例。(B) 一个Venn图展示了在不同实验室中离子种类存在差异的具体IRTS化合物：ThermoFisher仪器（左）、Agilent仪器（右）和Shimadzu仪器（上）。(C) IRTS化合物306_OOPX的离子种类丰度的标准化箱线图，分别展示了两个Shimadzu实验室（上）和三个ThermoFisher实验室（下）的数据。在每个仪器供应商内部，如果离子种类存在显著差异（p值≤0.05），则用星号表示。(46?48)高分辨率图片下载MS PowerPoint幻灯片

关注IRTS化合物306_OOPX，我们进一步研究了在Shimadzu和ThermoFisher仪器中离子种类形成的变化。在两个Shimadzu仪器的数据中，我们检测到独特的离子种类（图3C），其中[M + Na]+最为丰富，占306_OOPX总信号的69.6%，[M + NH4]+占剩余的36.4%。在S2中，306_OOPX的唯一观察到的离子种类是[M + NH4]+。虽然Shimadzu仪器在306_OOPX的离子种类谱上通常具有相对简单的特征，但需要注意的是，这项工作没有考虑任何可能的离子簇、多聚体或原位碎裂，这些因素也可能导致306_OOPX的离子通道出现变化。(55,56) 在三个ThermoFisher实验室中，离子种类谱同样每种实验室都是独特的（图3D）。具体来说，T1实验室观察到了四种离子种类：[M + H]+、[M + K]+、[M + Na]+和[M + NH4]+，其中[M + Na]+的比例显著高于其他离子种类（75.1%）。在T2实验室，除了[M + K]+之外，所有离子种类都被检测到，[M + NH4]+占306_OOPX总信号的69.1%，这显著高于[M + H]+（11.6%）但低于[M + Na]+（19.4%）。最后，T3实验室检测到了所有四种离子种类，但由于该数据集的重复次数较少，没有显著差异。总信号分布为：[M + H]+（41.0%）> [M + NH4]+（34.3%）> [M + Na]+（23.3%）> [M + K]+（1.4%）。尽管正离子模式数据显示了单个IRTS化合物中最丰富离子种类的相似独特性，但正离子模式中的趋势被夸大了，不仅不同实验室之间的离子种类谱存在显著差异，而且不同仪器之间离子种类的存在/缺失也有所不同。这种仪器间离子种类形成的一致性缺乏进一步复杂化了使用单一“共识”离子种类来识别和报告小分子分析物的过程，强调了使用RAMClust、MZMine和CAMERA等方法对离子种类进行分组的重要性。(57?59) 在负离子和正离子ESI模式下，离子种类形成的波动对小分子应用的标准化报告提出了实际挑战。这里呈现的结果表明，可控因素（如离子源或MS设置）和不可控因素（如商用仪器设计、溶剂组成的微妙差异或样品处理）的集体影响可能导致离子种类形成不一致，即使在同一供应商的不同实验室之间也是如此。在这些数据中，即使在同一供应商的不同实验室之间，特定离子种类的出现率也相差超过65%。这些观察表明，实施给定方法时常常未被重视的微小变化可能对离子种类形成产生不成比例的显著影响。虽然评估IRTS化合物混合物可以揭示这些变化，但重要的是要认识到，在实际的小分子应用中，由于首选离子种类的形态通常未被表征，这些差异可能会干扰准确的注释和定量。

为了区分仪器驱动的效果和实验室间的差异，我们通过评估同一仪器上的多次注射来考察单个实验室内的离子种类变化，从而有效减少了由于实验室间标准化方法采用差异造成的变化。这项分析显示，在10个实验室中有6个实验室的一个或多个IRTS化合物的最丰富负离子种类存在波动（图4A）。在正离子模式下，10个实验室中有9个实验室观察到了最丰富离子种类的变化。在仪器供应商内部，我们也观察到了这些离子种类的形成差异。具体来说，Shimadzu和ThermoFisher仪器在最丰富离子种类上的一致性最高，而Waters和Agilent仪器在最丰富离子种类上的一致性最低。为了进一步理解这一点，我们考虑了每个实验室的数据收集方式。在10个实验室中有7个实验室，重复数据是在不同的采集期间收集的（例如，在几个星期或几个月内不连续的日子里），因此可能使用了不同的流动相制备或仪器性能，这可能导致了实验室内首选离子形态的不一致性。对于剩下的三个实验室W1、A1和A4，数据是在连续的采集期间收集的（例如，在系统清洁、添加流动相等常规大规模实验研究中的同一天或连续几天内）。即使在这些情况下，几种IRTS化合物在正离子模式下的离子种类形成仍然存在变化。A4实验室还在负离子模式下观察到了离子种类变化。

接下来，我们试图通过比较一个实验室内重复IRTS空白注射中单个IRTS化合物的离子种类形成谱来定义这些变化的定量影响（图4B）。出现了两种不同的谱型：在四次注射中，[M + H]+是最丰富的离子种类（58.3–56.1%），其次是[M + Na]+（43.8–40.6%）。在其余八次注射中，观察到了三种离子种类，[M + Na]+是最丰富的（62.7–60.1%），其次是[M + H]+（31.2–26.4%）和[M + K]+（11.0–8.2%）。在橙色胡萝卜的复杂基质背景下，也观察到了这种化合物的类似趋势，其中共洗分析物的干扰可能会影响离子的生成路径。(60) 在三次注射重复中，[M + H]+是最丰富的（63.7–61.1%），其次是[M + Na]+（38.8–36.2%）；在其余六次注射重复中，[M + Na]+是最丰富的（60.4–58.0%），其次是[M + H]+（33.4–28.5%）和[M + K]+（11.1–8.3%）（图4C）。值得注意的是，这两种离子种类谱型也与采集时间线相对应，早期的分析包含两种离子种类，而后期的注射观察到三种。这项分析是更大规模（>100个样本）研究的一部分，并通过三个实验批次进行分析，结果显示第1批次与第2和第3批次之间存在明显差异，这与离子谱型的差异相符。在每个采集批次之间，进行了离子源的清洁和流动相的更新。在第2批次之后，还更换了分析柱。尽管这些程序变化在时间上与观察到的差异一致，但由于变化的数量较多，无法建立直接的因果关系。此外，这一观察结果与其他报告一致，这些报告表明特定分析物的MS谱稳定化可能需要几个小时。(61) 尽管如此，这些变化对于注释和定量都是值得注意的，因为它们表明依赖单一离子种类可能会误表征数据，因为最丰富的离子种类在不同注射之间是有所变化的。(62,63) 在控制了实验室内外部溶剂供应商和方法采用变化的影响后，我们接下来考虑了 artsifact信号是否可能混淆了实验室内的离子种类观察结果。为了进一步理解这些变化，我们检查了A4实验室在Agilent 6560 IM-qTOF上收集的离子迁移率数据（图5A）。在七个观察到离子种类形成的变化的IRTS化合物中（一个在负离子ESI下检测到，六个在正离子ESI下检测到），有五种化合物表现出一种或多种离子种类的两个或更多独特迁移时间。离子迁移率数据中多个峰值的观察可能表明存在一个干扰信号，该信号影响了这种离子种类的强度。然而，这些样品只含有溶剂和IRTS化合物，这表明任何等温干涉都是由于污染或artifact信号造成的。更可能的解释是IRTS化合物存在独特的3D构象（构象体）或在不同位点的质子化（原体），从而为单一IRTS化合物创建了电荷异构体。对于其他两种IRTS化合物400_OOAY和459_OFAM，每种离子种类只观察到一个迁移时间，这表明要么不存在异构离子种类，要么由于DTIMS分离的分辨率相对较低（<60），未能分辨出这些异构体，从而掩盖了具有小结构差异的离子构型的存在。(42)

对于在W1仪器上表现出离子种类形成变化的IRTS化合物，我们使用了LC–MS/MS（数据依赖性采集）进行了确认性分析，针对每个离子种类使用了包含列表。582_ULGJ的[M + Na]+离子种类的碎片化在IRTS样品中显示出与溶剂空白样品不同的碎片化模式（图5B）。这种行为在所有评估的IRTS化合物中都是一致的，只有一个例外。在分离205_SGGZ的[M + H]+离子种类时，IRTS样品和溶剂空白样品中也观察到了类似的碎片化模式（图5C）。尽管这可能是样品携带的结果，但其他IRTS化合物中没有类似行为，且这一观察仅限于205_SGGZ的单一离子种类，因此携带的可能性不大。相反，这一观察表明IRTS样品中205_SGGZ的[M + H]+信号可能是由溶剂或其他artifacts的背景贡献所混淆的。总的来说，确认性的IMS和MS/MS数据表明可能存在共洗的、未被识别的干扰，这些干扰使得精确总结离子种类强度变得复杂，从而阻碍了通过所有观察到的离子进行定量比较的挑战。

可控和不可控因素对离子种类形成的影响对于LC–ESI–MS在科学挑战中的应用至关重要。对于未知“真实”答案的非靶向应用，驱动离子种类偏好的根本变化对小分子的鉴定和定量都构成了障碍。这些挑战还扩展到半靶向方法，因为在这些方法中，并非每种化合物都有可用的稳定同位素标记的内标。在这里，我们提供了关于10个实验室使用Agilent、Shimadzu、ThermoFisher和Waters仪器进行的相同样品分析的结果，每个实验室在方法上略有不同。在这个网络中，无论是在负离子模式还是正离子模式下，最丰富的离子种类在不同仪器之间的变化都不一致，这并不令人惊讶，因为不同平台的离子源配置和操作条件存在差异，加上实验室采用方法的方式也有所不同。然而，进一步的探索揭示了即使使用相同供应商的仪器，不同实验室之间也存在着首选离子种类的差异。更令人惊讶的是，这些差异在同一实验室的数据中普遍存在，甚至在大型实验中连续进行的实验中也同样存在。通过进一步的IMS和DDA分析，发现了可能的背景干扰因素，这些因素可以解释某些（但并非所有）观察结果，这表明仪器设备、电离环境以及离子种类的形成路径之间存在复杂的相互作用。一些分子特征在不同实验和实验室中表现出重复的离子种类变化模式，而另一些则在特定条件下仅出现过一次。对于没有结构鉴定的分子，这些反复出现和短暂的离子种类变化反映了随机因素和特定环境因素共同作用的结果。这些发现不仅对分析物的鉴定至关重要，也对实验室内部和相互之间的定性和定量报告具有重大意义。随着组学领域数据存储库和方法标准化的不断推进，这里提供的数据凸显了仅依赖单一“高置信度”离子种类或简单累加离子种类来报告可靠、可比较数据的局限性。尽管方法标准化可以提高一致性，但我们的结果表明，由于受控和不受控因素的影响以及人为因素对数据趋势的扭曲，要在实际实验室条件下实现电离行为的完全统一仍然具有挑战性。因此，数据库建设应优先考虑整合来自多个平台和实验条件的数据，以更全面地反映可能观察到的离子种类多样性。在这种情况下，提供全面的元数据、对加合物进行分类，并为每种化合物记录多种离子种类，对于提高数据库的稳健性和实现更可靠的跨研究比较至关重要。同时，系统地评估、识别和处理ESI-MS应用中的离子种类变异性，以明确各个变量和ESI对齐方式的贡献也是必不可少的。综上所述，这些发现强调了审慎对待而非过度简化离子种类的复杂性，对于建立跨平台和实验室的可复现、可比的LC-ESI-MS数据集至关重要。