基于本源质谱技术揭示了肿瘤抑制蛋白p53与不同DNA响应元件之间的结合模式

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Native Mass Spectrometry Reveals Binding Modes of the Tumor Suppressor Protein p53 to Different DNA Response Elements

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我们使用质谱（MS）技术研究了 p21 DNA 应答元件（DNA-RE）的架构如何控制肿瘤抑制蛋白 p53 的结合模式。我们分析了四聚体的全长野生型 p53，并将其 DNA 结合行为与二聚体变体 p53L344A 进行了比较。总共通过质谱技术检测了 37 种来自 p21 DNA-RE 的 DNA 构建物，包括全位点序列、分离出的半位点序列、长度和组成不同的变体以及随机 DNA 序列。目的是利用质谱技术作为强大的平台，确定 p53 结合所需的最小 DNA 要求，从而对 p53:DNA 组合物进行比较分析。我们的结果表明，完整的 20 个碱基对（bp）的 DNA-RE 侧翼区域对 p53:DNA 复合物的初始形成没有影响。然而，完整的 20 bp 位点对于野生型 p53 和 p53L344A 以四聚体形式结合到 DNA 上是必需的。单个二聚体与分离出的半位点的结合不足以生成稳定的四聚体 p53:DNA 复合物。这些发现表明，二聚体之间的相互作用对于稳定四聚体 p53:DNA 复合物至关重要。

**引言**
质谱（MS）是一种强大的方法，可以用来表征蛋白质组装，因为它能够保持非共价相互作用。(1?3) 蛋白质-蛋白质、蛋白质-核酸和蛋白质-小分子之间的相互作用可以通过质谱技术进行详细研究。利用质谱技术可以有效地研究肿瘤抑制蛋白 p53 与 DNA 之间的界面。p53 作为一种转录因子，以四聚体形式与其 DNA 应答元件（RE）结合。(4) 质谱技术非常适合研究 p53 的相互作用，因为它能够分辨单聚体、二聚体和四聚体形式的 p53。(5) 此外，通过离子迁移率质谱技术已经成功解析了 26 个碱基对（bp）DNA-RE 的不同 p53:DNA 复合物的化学计量比。(6) p53 通常被称为“基因组的守护者”，因为它能确保基因组的完整性。(7) 它响应细胞压力时会影响细胞周期停滞、凋亡、衰老和 DNA 修复。(8,9) 在功能上，p53 作为一种序列特异性转录因子，可以识别目标基因的启动子和增强子中的 DNA-RE。(10) p53 DNA-RE 包含两个十聚体半位点，其保守序列为 RRRCWWGYYY（R：嘌呤；Y：嘧啶；W：腺嘌呤或胸腺嘧啶；C：胞嘧啶；G：鸟嘌呤）。(11,12) 在 p53 最为人所知的下游靶标中，p21 是一个重要例子，它包含多个高亲和力的完整 DNA-RE，这些 DNA-RE 可以介导 p53 的结合。(13) 因此，p21 DNA-RE 成为了研究 p53 及其 DNA 识别基序的高亲和力识别和协同组装的范例。(13?15) p53 与 DNA 的相互作用的一个重要原则是它依赖于 p53 的寡聚体状态。一个 p53 二聚体可以与 DNA-RE 的一个半位点结合，并部分稳定这种相互作用。p53 二聚体:DNA 复合物的亲和力低于 p53 四聚体:DNA 复合物。(16,17) p53 四聚体是生理上相关的 DNA 结合单元：每个 p53 二聚体结合一个十聚体半位点，占据整个 DNA-RE，从而实现高亲和力结合、协同稳定以及对目标基因（如 p21）的转录调控。(8) 在这里，我们首次使用质谱技术来分析 p21 DNA-RE 的架构如何控制 p53 的结合模式。在我们的研究中，我们使用了四聚体的全长野生型 p53（p53wild-type）。此外，我们还利用二聚体 p53 变体来比较 p53 的两种不同聚化状态（四聚体和二聚体）的 DNA 结合行为。为了产生二聚体 p53 变体，在第 344 位点引入了一个突变，将亮氨酸替换为丙氨酸（p53L344A）。(18) 我们总共检测了 37 种来自 p21 DNA-RE 的 DNA 构建物，包括全位点序列、分离出的半位点序列、长度和组成不同的 DNA 变体以及随机 DNA 序列（见支持信息表 S1）。这项工作的目的是利用质谱技术作为强大的平台，确定 p53 结合所需的最小 DNA 要求，从而对 p53:DNA 组合物进行比较分析。

**实验部分**
**化学品**
所有使用的化学品均为的最高纯度产品，购自 Sigma-Aldrich。DNA 应答元件从 Microsynth 购买（见支持信息表 S1）。

**p53 的表达和纯化**
野生型四聚体（p53wild-type）和二聚体 p53（p53L344A）按照先前描述的方法，在 Escherichia coli BL21 (DE3) 细胞中表达，并带有 N 端组氨酸-脂酰基域烟草蚀刻病毒标签（HLT）。(5,19) 细胞在 18°C 下孵育 16 小时后收获，并在 50 mM 2-[4–2-羟乙基哌嗪-1-基]乙烷磺酸（HEPES）、300 mM NaCl、2.5 mM 三(2-羧乙基)膦（TCEP）和 20 mM 嘌唑（pH 7.4）的溶液中通过超声裂解。蛋白质通过 FPLC 系统（?KTA Pure，GE Healthcare）上的 HisTrap HP 柱（Cytiva）进行亲和层析纯化，随后在 50 mM HEPES、300 mM NaCl、2.5 mM TCEP、10% (v/v) 甘油（pH 7.4）的条件下进行尺寸排阻层析（SEC，Superdex 200 柱，GE Healthcare）纯化。在 4°C 下进行 TEV 切割后，再次重复 SEC 纯化步骤过夜。纯化的 p53wild-type 和 p53L344A 的功能通过质谱技术验证，显示它们可以形成四聚体和二聚体，并通过之前的方法进行 DNA 结合测定。(5,19)

**质谱技术**
蛋白质（p53wild-type 和 p53L344A，浓度均为 9 μM）与等摩尔量的 DNA-RE 元素在 4°C 下孵育过夜。p53wild-type 和 p53L344A 的缓冲液系统更换为 500 mM 醋酸铵（pH 6.8），使用 Amicon Ultra 离心过滤装置（0.5 mL；截留分子量 3 kDa、10 kDa 或 30 kDa，Millipore）。质谱分析在 High-Mass Q-TOF 2 仪器（Waters Micromass/MS Vision）上进行，配备纳米电喷雾离子化（ESI）源。毛细管电压范围为 1.2 至 1.4 kV，样品锥电压为 100 至 160 V，提取锥电压设置为 15 V。碰撞池中的加速电压范围为 30 至 90 V。源压力调整为 10 mbar，碰撞池中的压力调整为 1 × 10–2 至 2 × 10–2 mbar。数据使用 MS profile 模式测量，以引导离子进入感兴趣的 m/z 区域。数据用铯碘化物（CsI）进行重新校准。

**图 1**
图 1. p53 结构概述及 p21 DNA-RE 库的设计。(A) p53 的结构域，包括转活化域（TAD）、脯氨酸富集区（PRR）、DNA 结合域（DBD）、核定位信号（NLS）和四聚化域（TET）以及 C 端域（CTD）。(B) 基于 p21 应答元件（p21-RE）设计的 DNA 库，包括全位点 DNA-RE、半位点 DNA-RE 以及内源性和随机延伸序列。

**结果与讨论**
**p53 结合的 DNA 库设计**
肿瘤抑制蛋白 p53 是一种多结构域蛋白（图 1A），作为转录因子与其 DNA 应答元件（p21 DNA-RE）结合（图 1B）。为了进行质谱研究，生成了 37 种不同的 DNA-RE，以研究 p21-DNA-RE 组成对 p53wild-type 和 p53L344A 结合的影响。DNA 库的设计如下：生成含有(i) 两个十聚体半位点加上长度可变（10 至 40 bp）的内源性延伸序列，(ii) 仅一个或没有十聚体半位点，(iii) 两个十聚体半位点加上长度可变（10 至 40 bp）的随机延伸序列（ATG 重复序列）的 DNA-RE。通过这种方式，我们试图研究 p21 DNA-RE 侧翼区域对 p53 二聚体和四聚体变体结合的影响，并检查 p53 是否仅能与 DNA-RE 的一个十聚体半位点或其他 DNA 序列结合。本研究中使用的所有 37 种 DNA-RE 的详细信息见支持信息（表 S1）。

**p53:DNA 复合物的质谱分析**
所有 37 种 DNA-RE 都被检测了其与 p53wild-type 和 p53L344A 形成特定复合物的能力。p53:DNA 复合物的化学计量比通过质谱技术确定。所有质谱数据的详细展示见支持信息（图 S1–S37）。

**半位点和全位点 DNA-RE 对 p53wild-type DNA 复合物形成的影响**
在没有添加 DNA 的情况下，p53wild-type 的质谱图中可以看到四聚体、三聚体和二聚体以及单聚体形式的 p53 信号（图 2A），其电荷状态分别为 m/z ～6000 至 7500 的 +24 至 +29（四聚体），m/z ～5400 至 5800 的 +23 至 +24（三聚体），m/z ～4250 至 5200 的 +17 至 +20（二聚体），m/z 2750 至 4000 的 +11 至 +15（单聚体）。值得注意的是，无论是否添加 DNA，所有质谱图中都观察到了未结合 DNA 的 p53wild-type 的四聚体、三聚体和单聚体形式。我们不能排除这些可能是由于气相中 p53:DNA 复合物的部分解离所致；然而，我们的结果与之前的质谱研究结果完全一致。(5,6) 当与全位点（20 bp）DNA-RE 孵育时，观察到了特定的 p53:DNA 复合物的形成，其信号分别位于 m/z ～6400 至 8200（电荷状态 +23 至 +29）和 m/z ～4900 至 5600（电荷状态 +18 至 +20），对应化学计量比 4:1 和 2:1（p53:DNA）（图 2B）。对于一个带有内源性延伸序列（10 bp）的半位点 DNA-RE，仅形成了 2:1 的 p53:DNA 复合物（图 2C）。

**解释**
为了排除 p53wild-type 的非特异性 DNA 结合，使用了一条仅包含 ATG 重复序列的随机 20 bp DNA 链（图 2D）。有趣的是，对于这条随机 DNA 链，观察到的结合行为与含有 DNA-RE 的半位点几乎相同，也形成了 2:1 的 p53:DNA 复合物。初步看来，p53wild-type 以类似的方式同时结合特定的 DNA-RE 和非特异性的随机 DNA 这一点令人困惑。然而，这些结果明确表明，必须存在全位点 DNA 序列（20 bp）才能诱导形成 4:1（p53:DNA）复合物。显然，仅存在半位点序列不足以诱导 p53 四聚体与 DNA 的结合。这是首次详细研究 DNA-RE 与肿瘤抑制蛋白 p53 结合的最小要求。

**半位点和全位点 DNA-RE 对 p53L344A:DNA 复合物形成的影响**
在没有 DNA 的情况下，二聚体变体显示出单聚体、二聚体和三聚体形式的信号，这与 p53wild-type 的质谱结果一致（图 2A）。出乎意料的是，也观察到了微弱的四聚体 p53L344A 信号。这一现象可能归因于本研究中使用的蛋白质浓度，该浓度可能促进了气相加合物的形成。(20) 与 p53wild-type 一样，p53L344A 在所有测量中都检测到了未结合 DNA 的物种（图 2）。当与全位点（20 bp）DNA-RE 孵育时，p53L344A 形成了 2:1（电荷状态 +18 至 +20，m/z ～4900 至 5600）和 4:1（电荷状态 +23 至 +29，m/z ～6400 至 8200）的 p53:DNA 复合物（图 2B），与 p53wild-type 的结果一致。相反，当与含有单个半位点（10 bp）的 DNA-RE 以及内源性 10 bp 延伸序列或随机 20 bp DNA 序列孵育时，p53L344A 显示出与 p53wild-type 相似的结合行为，仅观察到 2:1（p53:DNA）复合物（图 2C 和 D）。这些发现表明，p53L344A 仅在存在全位点 DNA-RE 的情况下才能形成 4:1 复合物。再次证明，仅存在半位点序列不足以促进 p53 四聚体与 DNA 的结合。

**DNA-RE 延伸序列对 p53wild-type:DNA 复合物形成的影响**
为了评估 DNA-RE 延伸序列对 p53wild-type:DNA 结合的影响，在全位点 DNA-RE 的 5′ 和 3′ 端分别添加了 10 bp 的延伸序列（图 1，表 S1）。同样的 10 bp 延伸序列也添加到了半位点 DNA-RE 的 5′ 和 3′ 端。所有四种扩展的 DNA-RE 都被测试了其与 p53wild-type 和 p53L344A 的相互作用（图 3）。p53野生型（左图）和p53L344A（右图）的MS分析。(A) 全位点p21 DNA-RE（20 bp）加上5′端内源性DNA延伸（10 bp）。(B) 半位点p21 DNA-RE（10 bp）加上5′端内源性DNA延伸（10 bp）。(C) 全位点p21 DNA-RE（20 bp）加上3′端内源性DNA延伸（10 bp）。(D) 半位点p21 DNA-RE（10 bp）加上3′端内源性DNA延伸（10 bp）。p53（蓝色圆圈），p53:DNA复合物（红色圆圈），DnaK（黄色方块），未知112 kDa物种（黑色三角形）和未知156 kDa物种（黑色五边形）。高分辨率图像下载MS PowerPoint幻灯片

将p53野生型与全位点DNA-RE孵育后，检测到了非DNA结合的单体、二聚体、三聚体和四聚体p53信号，这与之前的观察结果相同（图2和图3）。此外，还检测到了特征性的2:1和4:1（p53:DNA）化学计量比，其电荷状态在m/z约为5000至5900时为+18至+21（2:1复合物），在m/z约为6500至8500时为+23至+29（4:1复合物）（图3A,C）。

将p53野生型与两端各延伸10 bp的半位点DNA-RE孵育后，同样检测到了非DNA结合的单体、二聚体、三聚体和四聚体p53信号。此外，还观察到了m/z约为4900至5600时电荷状态为+18至+20的2:1（p53:DNA）复合物的形成（图3B,D）。

对于含有全位点和半位点DNA-RE的随机延伸序列也观察到了类似的结果（图S19,S20,S25和S26）。这些发现强调了全位点（20 bp）DNA-RE在4:1（p53:DNA）复合物组装中的必要性。DNA-RE的延伸似乎对p53:DNA复合物的初始形成几乎没有影响。

对于p53L344A，与全位点DNA-RE孵育后也观察到了类似的结果（图3A,C）。2:1和4:1（p53L344A:DNA）复合物的存在支持了先前的研究结果，表明全位点DNA-RE是形成4:1（p53L344A:DNA）复合物所必需的（图3）。

将p53L344A与一个半位点DNA-RE孵育后，得到的结果与p53野生型一致：仅检测到了2:1（p53L344A:DNA）复合物（m/z约为4900至5600时电荷状态为+18至+20）（图3B,D）。对于含有DNA-RE的随机延伸序列也观察到了相同的行为（图S19,S20,S25和S26）。这些数据再次强调了全位点（20 bp）DNA-RE在成功组装4:1（p53L344A:DNA）复合物中的必要性，这与p53野生型的情况相同。值得注意的是，对DNA-RE的额外延伸对p53:DNA复合物的初始形成几乎没有影响。表1总结了p53野生型和p53L344A与DNA-RE形成的复合物的化学计量比。

结论

我们的研究表明，全位点（20 bp）DNA-RE的侧翼区域对p53:DNA复合物的初始形成几乎没有影响。显然，全位点DNA-RE是p53野生型和p53L344A与DNA形成四聚体所必需的（图2和图3）。如果只存在一个半位点DNA-RE，只有p53二聚体会结合。二聚体显然不足以形成稳定的4:1（p53:DNA）复合物，这种情况适用于p53野生型和p53L344A。我们的发现支持了这样的假设：二聚体-二聚体相互作用是p53四聚体与DNA结合所必需的。