解吸电喷雾离子化-质谱成像技术能够提供关于用于防治番茄植株上Phytophthora capsici感染的潜在生物控制剂的时空化学信息

《Journal of the American Society for Mass Spectrometry》：Desorption Electrospray Ionization–Mass Spectrometry Imaging Provides Spatiochemical Information on Potential Biocontrol Agents against Phytophthora capsici Infection in Tomato Plants

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生物防治剂可以提供一种环保且更可持续的替代传统化学农药的方法，有效抵御诸如 Phytophthora capsici 等有害病原体，同时减少农业系统中使用合成农药可能带来的环境危害。本研究评估了 Bacillus vallismortis、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus thuringiensis 和 Bacillus subtilis 对这种广泛分布的植物病原体的防治效果。结果显示，在体外和体内外温室实验中，Bacillus thuringiensis 和 Bacillus subtilis 能促进植物生长并抵御 Phytophthora capsici；而 Bacillus vallismortis 和 Bacillus amyloliquefaciens 在体外有效但在体内无效。具体而言，Bacillus thuringiensis 不仅能抑制 Phytophthora capsici 的生长，还能增强植物对该病原体的抵抗力，经处理的植物根长增加了 94.4%，茎高增加了 74.0%。为了探究生物防治剂与病原体之间的分子相互作用，我们使用解吸电喷雾电离-质谱成像（DESI-MSI）技术对 Bacillus thuringiensis 和 Phytophthora capsici 的共培养物进行了分析，从而识别出对生物防治剂效果起关键作用的七个独特表型区域。本文展示了生物防治剂在番茄种植中的优势，并强调了解吸电喷雾电离-质谱成像技术在农业相关微生物空间结构分析中的应用价值。

特别刊
作为《美国质谱学会杂志》“纪念 Richard M. Caprioli”特刊的一部分发表

引言
Phytophthora capsici 是一种著名的丝状卵菌植物病原体，主要通过引发根腐病、果实腐烂和叶斑病对番茄生产造成严重损害。Phytophthora 属病原体通过称为吸器的特殊结构释放效应蛋白，用于感染和吸收宿主植物的养分。这些效应蛋白会阻碍植物吸收水分和养分的能力，导致生长受阻和活力下降。(1,2) 鉴于 Phytophthora 属病原体是一些最具破坏性的植物病害的致病因子，它们成为研究植物与入侵病原体之间复杂分子相互作用的理想模型。

历史上，化学农药被广泛用于控制卵菌植物病原体。然而，合成农药存在多个缺点，如因化学残留物积累导致的土壤污染。这些化学物质会破坏土壤微生物群落，降低微生物多样性并改变群落结构，进而影响土壤的基本功能。此外，农药的选择压力会促使病原体产生抗性，使害虫控制变得更加困难，并可能增加病原体的毒力。(3,4) 这些因素共同导致了土壤健康状况下降、对化学投入的依赖性增强以及环境和农业问题的加剧。一种有前景的替代方案是使用有益细菌作为生物防治剂（BCA），它们相对于传统化学农药具有诸多优势。尤其是根际生长的促植物生长细菌（PGPB），通过竞争排斥、产生抗菌化合物、增强植物免疫反应以及改善根际环境等方式保护植物。(5,6) 这些机制不仅有助于控制病原微生物，还有利于提高植物的整体健康和生产力。许多 PGPB 会产生抗生素和溶菌酶等抗菌物质，抑制或杀死病原微生物。(7) 这些化合物可以直接抑制或杀死病原体，降低其感染植物的能力。PGPB 还能触发植物的防御机制（ISR），当植物检测到 PGPB 发出的特定信号时，会激活多种防御反应，增强抵抗病原体的能力，包括产生防御性化学物质、强化细胞壁和激活与压力相关的蛋白质。(8) 此外，PGPB 还能激活植物的免疫系统，使其在病原体侵袭时反应更快更强烈。另一种保护机制是 PGPB 能够预先占据并定殖于植物根表面和内部组织，形成物理屏障，减少病原体感染的机会。PGPB 还能通过调节 pH 值、产生挥发性有机化合物或改变某些养分的可用性等方式改变根际的化学和物理性质，从而不利于病原体的生存和生长。(8,9)

Bacillus 属细菌通过多种机制在植物病原体的生物防治中发挥重要作用，这类有益细菌能产生多种生物活性化合物并适应不同的环境条件。(10?12) 本研究通过体外实验考察了 Bacillus spp.（B. vallismortis (Ps)、B. amyloliquefaciens (Psl) 和 B. thuringiensis (IMC8) 对 P. capsici 的防治效果。结果表明，B. amyloliquefaciens 和 B. vallismortis 减少了菌丝生长；而体内实验显示其防治效果优于系统性杀菌剂 metalaxyl。(13) 尽管一些 PGPB 已显示出作为生物防治载体的潜力，但目前仍需进一步研究细菌次级代谢物的生态功能、调控其产生的变量及其理化性质。(14) 用细菌 BCA 替代合成杀菌剂用于植物病原体管理是一种可行且前景广阔的方法，因为它具有生态效益、减少农业产品和环境中的残留物，并适用于多种农业系统。(15,16) 然而，在实施这些替代方案之前，还需进一步研究和分析其作用机制，以明确 BCA 与病原体相互作用的代谢组和潜在生化过程。

基于质谱（MS）的工作流程常用于生化分析，因为质谱具有高灵敏度、高特异性和快速分析小分子的能力。(17) 质谱成像（MSI）技术在定位采样过程中能够获取空间化学信息，生成记录采样区域内检测到的化学信号的分子图谱。这些技术不仅能够实现检测，还能提供关于样本中特定分析物分布的重要见解。MSI 在医学领域得到广泛应用，可用于组织切片成像以表征疾病状态、识别外源性化合物的位置，甚至提供生物分子浓度的定量数据。(18?21) 在各种 MSI 实施方法中，解吸电喷雾电离（DESI）尤其具有前景，因为它结合了传统喷雾电离方法和固相样品分析的优点。(22) 重要的是，DESI 实验可以在常温条件下进行，无需显著影响小分子的分析。(23) 本研究探讨了使用 DESI 来研究涉及细菌内生菌（如 Bacillus thuringiensis）的植物病原体生物防治的农业生物系统的可行性。通过 DESI-MSI 对 Bacillus thuringiensis 和 P. capsici 的共培养物进行空间分析，比较了特定 BCA 对番茄植株的影响，发现 B. thuringiensis 在减轻病害严重程度和促进植物生长方面效果最显著，这促使我们进一步研究了这两种生物之间的相互作用机制。DEI MSI 允许我们在原位直接观察活体共培养物，并提供了相关的空间分辨化学谱型。

方法
BCA 和病原体培养
本研究使用的所有细菌菌株列于补充表 1 中。内生细菌菌落通常在 Luria–Bertani (LB) 营养液中培养，30 °C 下孵育 16–20 小时，转速为 200 rpm。培养物调整至 600 nm 处的光学密度 1.0，相当于大约 10^8 CFU/mL。随后将培养物涂布在 LB 球脂板上，30 °C 下孵育 16 小时以进行短期保存或直接用于种子处理。P. capsici 从 5 mm 的菌株块（储存在室温下的蒸馏无菌水中）在 V8 果汁琼脂（20% V8 果汁、0.2% CaCO3、1.5% 球脂）中室温下暗培养 5–7 天。通过将平板浸入冷无菌蒸馏水中并小心提取菌丝表面来制备游动孢子悬浮液，浓度调整为 10^4 个游动孢子/mL。双培养实验中，将 5 mm 的 V8 果汁琼脂菌株块置于含有 50/50 LB/V8 混合液的 70 mm Petri 盘中心。

评估生物防治细菌对 Phytophthora capsici 的拮抗作用
为了测试 BCA 对植物生长和抵御 P. capsici 病原体的效果，番茄种子 (Solanum lycopersicum L. “Rutgers”) 在 1% 次氯酸钠中表面消毒 10 分钟，然后用双蒸水冲洗三次，每次 60 秒，直至漂白剂气味消失。种子用无菌纸巾擦干后放入 50 mL 的锥形管中，加入 30 mL 含 10^8 CFU/mL BCA 细菌悬浮液，在 4 °C 下培养 24 小时。对照组种子浸泡在不含细菌的无菌 LB 营养液中。种子在无菌层流罩中风干 2 小时后，播种在经过热灭菌的 Miracle-Gro 盆栽土中，每个处理重复七株植物，按随机设计排列。实验在 26 ± 3 °C 的生长室和使用非无菌土壤的温室环境中进行。

为了制备含有病原体的土壤，将植物根部浸入含有 10^4 个游动孢子/mL 浓度的 P. capsici 游动孢子液悬浮液中。植物按照上述方法进行 BCA 处理后，在生长室中培养 6 周，然后移至温室环境中继续培养四周（总共 10 周），之后通过测量根部和茎部的干重以及总干重来评估植物生长促进活性和病原体保护效果。实验在包含 Murashige 和 Skoog 基础培养基（Sigma-Aldrich，0.03% phytagel，pH 5.7）的培养板上进行。(11 × 11 cm 正方形)。在培养板底部约 35 mm 处放置两个 5 mm 的 P. capsici 菌株块。使用 ImageJ 软件测量 7 天和 14 天龄幼苗的根部和茎部高度。

双培养体外显微镜分析
将含有活跃生长 P. capsici 菌丝的 5 mm 球脂菌株块置于 50/50 V8/LB 球脂板的中间位置。让菌株块生长 48 小时后，在距菌株块边缘约 3 cm 处涂布 20 mL 含 10^8 CFU/mL 细菌培养基。培养板置于室温下的黑暗环境中监测 72 小时。使用解吸电喷雾电离显微镜（Olympus XZS-ILLD2）结合 HD 4K 相机测量和分析抑制区，并评估 BCA 与 P. capsici 之间的拮抗作用。

DESI 样品制备和采集设置
为了进行 DESI-MSI 分析，将 5 mm 的 P. capsici 菌株块放置在一个尼龙膜上，该膜设于 50/50 LB:V8 球脂基础上。随后在膜上涂布 B. thuringiensis，并在室温低光条件下孵育 5 天。准备了三种不同的共培养物，并分别进行了多次DESI-MSI分析，每次分析都有三个生物学重复样本，且在不同日期进行。本研究中使用的尼龙膜的孔径为0.22微米，直径为47毫米（Sigma-Aldrich，Z290807）。在成像之前，将膜和共培养物从琼脂中取出，并使用Mayo剪刀剪切成所需大小。切割后，让膜和细菌干燥5分钟，然后使用双面Scotch胶带将其粘贴在玻璃显微镜载玻片上。安装好的膜随后直接进行成像。成像实验是在配备原型DESI-MSI探针的Synapt G2-S高分辨率质谱仪（Waters Corporation）上进行的。(24) 优化后的DESI源参数为：毛细管电压-5千伏、源温度150°C、氮气流0.45巴以及消融直径0.7毫米。DESI的几何定位设置为x、y、z分别为-2、+2、+2.75，喷雾角度为70°。DESI电离溶剂由90/10的乙腈/水组成，还包括0.2纳克/微升的亮氨酸-脑啡肽和0.1%的氢氧化铵。像素尺寸为100微米×200微米，扫描速率为150微米/秒。该仪器使用甲酸钠盐簇进行质量校准，达到95%的置信区间，残余质量的均方根（RMS）小于0.5 ppm。所有采集的数据质量范围为m/z 50–1200，实验在负离子模式下进行。

数据处理和空间化学分析
所有原始成像文件均使用HDImaging软件（Waters）进行处理，分析了MSI中最丰富的4000个特征。使用亮氨酸-脑啡肽内标进行了锁定质量调整。随后对处理后的文件在R Studio（RStudio Team 2024，v1.1.383；R版本3.3.3）中进行了空间分析。特征强度首先归一化到总离子色谱图，然后再归一化到亮氨酸-脑啡肽内标，以考虑喷雾器的一致性和样品形态的变化。特征通过10 ppm窗口进行峰值提取。通过绘制每个像素位置处与峰值提取特征相关的强度，生成了空间归一化的热图。在分割之前，根据实验情况经验性地确定了初始家族数量（k）和收缩参数（s）。(25) 通过Cardinal MSI软件包中的空间收缩质心（SSC）分析实现了无监督分割，从而能够识别共培养物中的不同空间化学区域。(26) 对于特征的正确认识，是将测量的m/z值与Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）、METLIN、LipidMaps和ChemSpider进行比对。所有暂定识别都采用了10 ppm的质量准确性和80%的同位素相似性标准。

结果与讨论
BCA处理的植物表现出生长促进和病原体保护作用
人们对使用根瘤菌抑制番茄和其他茄科植物及葫芦科植物上的P. capsici越来越感兴趣。先前的研究表明，B. amyloliquefaciens的分离株显著促进了幼苗的生长，并减少了根部的病原体负荷，表明具有广谱的抗真菌生物控制特性。(27) B. thuringiensis通常被用作对抗昆虫害虫的生物控制剂。然而，新的研究揭示了其作为预防性细菌生物控制剂的潜力，能够基于其产生的抗菌化合物、与病原体在根际竞争养分和空间资源以及诱导番茄系统抗性来控制P. capsici感染。(27?29) 我们的分析确定了两种BCA分离株，B. thuringiensis (IMC8)和B. subtilis (Prt)，在处理后的3周内对番茄幼苗具有生长促进作用（图1B,C）。BCA处理的植物在暴露于P. capsici时表现出与未接种P. capsici的对照植物相似的生长特征，并且其生物量比接种了P. capsici的植物更重（图1D）。未接受BCA处理的植物在暴露于P. capsici后生物量显著减少，感染率增加，10周后仅有38%的植物存活。而接受BCA处理的IMC8和Prt植物存活率为75%（图1E）。在存在P. capsici的情况下，用B. amyloliquefaciens (Psl)和B. vallismortis (PS)处理的植物存活率分别为38%和25%。这表明IMC8和Prt的BCA对P. capsici提供了比PS和Psl更好的植物保护作用。值得注意的是，未经病原体处理的IMC8、Prt和Psl处理的植物在10周后存活率为100%，这表明BCA处理可能还提供了额外的保护，以防止温室中使用非无菌土壤中存在的其他潜在病原体，因为未经BCA处理的对照植物在10周后仅有50%存活（图1E）。然而，体外研究表明，所有BCA处理的幼苗都表现出病原体保护和生长促进作用（图2）。这一观察结果表明，IMC8不仅促进了植物生长，还帮助植物抵御了P. capsici，整体植物重量明显高于未接受BCA处理的对照组。Bacillus分离株Prt、IMC8和Psl在体外对番茄枝条的生长促进效果具有统计学意义（p值<0.05，95%置信区间）（图2C），但在温室中存在病原体的10周研究期间，IMC8处理的番茄幼苗的生物量增加最为显著（图1D）。这表明生长促进和疾病保护可能取决于初始处理后的BCA和病原体接种浓度等因素。

图1
图1. 生物控制剂（BCA）对接种了Phytophthora capsici的番茄幼苗的有效性。(A) 番茄种子用细菌分离株处理的示意图。番茄种子在1%次氯酸钠（Clorox漂白剂）中消毒10分钟，用无菌水冲洗三次，然后用热灭菌纸巾吸干。处理后的种子在4°C下浸泡在含有10^8菌落形成单位（CFU）的BCA细菌悬浮液中24小时，使用的细菌为Bacillus thuringiensis (IMC8)、Bacillus subtilis (Prt)、Bacillus amyloliquefaciens (Psl)和Bacillus vallismortis (PS)。每组包含10到12个单独的植物重复样本。然后将种子播种在保持在26 ± 3°C的生长室中的热灭菌土壤中，并在3周后评估其茎的高度（B, C）。随后将这些植物移植到接种了10^5游动孢子/mL的P. capsici的非无菌土壤中，并从生长室转移到温室环境中。10周大的番茄幼苗根据全植物生物量（D）、植物干重（E）以及植物在温室中存活率（E）进行评估，后者基于存活的植物比例来衡量。所有误差条代表标准误差。对于全植物生物量的比较，平均值用x表示，星号表示意义（t检验p值<0.05），用于比较每种单独接种条件与未处理的对照组。

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图2
图2. 接受生物控制剂（BCA）处理的番茄幼苗与同时接受BCA处理和Phytophthora capsici (PC)暴露的番茄幼苗的生长变化。(A) 仅接受BCA处理的组包括应用了Bacillus thuringiensis (IMC8)、B. subtilis (Prt)和B. amyloliquefaciens (Psl)的种子。每组包含7个单独的植物重复样本。(B) 对于暴露于病原体的组，在种子下方约35毫米处放置了5毫米长的活性生长P. capsici菌块。在仅BCA处理的组和暴露于病原体的组中，蓝色和粉色背景分别代表第7天和第14天的时间点。(C) 使用ImageJ在第7天和第14天记录了根和茎的平均测量值。误差条代表标准误差，星号表示意义（t检验p值<0.05），用于比较不同的接种条件及其各自的对照组。对于这些比较，未经任何处理的种子作为仅BCA处理的对照，而仅接受病原体处理的种子作为BCA和病原体组的对照。

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接受BCA处理并暴露于P. capsici的番茄幼苗在14天后表现出更长的根和茎（图2C）。与未处理的对照组相比，接受Prt (B. subtilis; 78.5%增长)、IMC8 (B. thuringiensis; 57.9%增长)和Psl (B. amyloliquefaciens; 41.4%)处理的植物的茎高度显著增加。未经BCA处理的植物在暴露于P. capsici后根长度减少了53.9%，茎高度减少了24.1%。然而，接受IMC8处理的植物在暴露于P. capsici后的根长度仅减少了10.3%。根生长受到的抑制比茎生长更明显，这可能是由于病原体通过土壤灌洗的方式接种，导致根部分先于茎暴露于病原体。在接受BCA处理的植物中，IMC8 (94.4%)、Prt (63.3%)和Psl (91.6%)的根长度增加更为显著。这些结果表明，生物控制细菌对P. capsici的生长和结构完整性具有显著的抑制作用，突显了它们作为有效管理这种植物病原体的潜力。

显微镜和DESI-MSI分析
显微镜分析显示，在共培养48小时后，BCA作用区内的P. capsici菌丝形态发生了明显变化。在没有BCA的条件下生长的对照P. capsici菌丝看起来健康，结构光滑、强壮且均匀呈管状（图S1）。相比之下，当P. capsici菌丝靠近IMC8的活性培养区生长时，它们开始显示出结构完整性的下降，包括菌丝分支减少（图3A–D）。最明显的是，在抑制区内菌丝广泛发生塌陷，表现为菌丝的扁平化和碎裂（图3C–D）。受影响的菌丝发生收缩，整体结构稳定性降低，表明细胞壁和膜受到了破坏。显微镜检查还显示，靠近B. thuringiensis的菌丝出现了细胞质泄漏和液泡化（图3D）。这些症状表明细胞受损，菌丝细胞内的内部压力降低，导致其塌陷。这些在卵菌菌丝之间观察到的视觉差异表明，在B. thuringiensis存在的情况下，P. capsici内诱导出了不同的代谢状态。系统中小分子的种类和数量的变化通常可以与潜在的生物学机制相关联，因此研究这些小分子对于理解任何可能的代谢变化至关重要。

图3
图3. BCA对P. capsici菌丝形态的影响（光学显微镜观察）。(A) 双培养物的明场显微照片（7×），其中包含一个5毫米长的P. capsici菌块与内生菌IMC8 (B. thuringiensis)共同生长。(B) P. capsici的正常菌丝形态（20×）。(C, D) 抑制区菌丝塌陷在20×和40×下的情况。(E) P. capsici和B. thuringiensis共培养的样品处理工作流程图。最初微生物单独培养，然后在微孔膜支架上进行培养。当共培养物生长到所需阶段后，将膜从琼脂中取出，剪切成适当大小，并粘贴在玻璃显微镜载玻片上进行DESI-MSI采集。

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为了准确描述B. thuringiensis和P. capsici共培养的空间动态，采用了DESI-MSI技术（图3E）来分析在尼龙膜上培养的固相细菌生长。通过在微孔膜支架（MMS）上培养共培养物，最小化了活性样品的处理，从而在样品处理和分析过程中保持了微生物生长期间表达的化学信号的完整性。(30) 通过MMS技术与DESI-MSI结合的原位分子分析是在环境条件下进行的。与基于真空的MSI不同，DESI-MSI采集的Ambient（环境）特性使得它能够更好地测量不稳定和易挥发的分析物，这对于全面表征至关重要。(31) 重要的是，虽然之前使用MMS的工作仅应用于革兰氏阴性原核生物的共培养物，但这项研究首次对跨领域的微生物共培养物进行了MMS DESI-MSI研究，表明MMS方法适用于多种微生物样本。(31) 这种特定的实验设计展示了MMS平台的多功能性，因为它允许在动态生长条件和时间尺度下进行物种的共培养。在这里，我们证明了MMS和DESI-MSI在代谢探针和BCA与病原体相互作用的空间表征方面的有效性，这一点通过空间分辨的代谢物鉴定得到了证实。在DESI-MSI采集过程中，测量了细菌-卵菌共培养物中4000个总分析物的空间分布，并将其处理成定位分辨的化学轮廓（图4B）。为了识别空间相关且统计上显著的特征，使用了无监督分割算法来分析完整的化学特征信息。(26) 这种基于空间收缩质心（SSC）的k均值聚类算法在共培养物中划分出七个化学上不同的区域，同时忽略了对应于噪声的信号以及具有均匀空间分布的分析物，这些特征是化学背景的特性（图4B）。通过将分割算法的输出与成像前的样品光学图像（图4A）进行比较，这三个区域可以被定性地划分为三类。在确定的化学不同区域中，有三个区域与BCA生长的不同阶段相关（片段5、6、7），三个区域与物种间相互作用相关（片段2、3、4），一个区域与卵菌生长相关（片段1，图4D）。物种间相互作用区域（片段2、3和4）对于理解共培养条件下发生的代谢状态改变特别重要，因为这些区域是两种物种发生化学接触的地方，也与显微镜观察到的抑制区相对应（图3A）。

图4．辣椒疫霉（P. capsici）和苏云金芽孢杆菌（B. thuringiensis）共培养的空间化学分析的工作流程。（A）在尼龙膜支架上生长的共培养物的光学图像（顶部），以在样品转移和数据采集过程中保持化学信号的空间位置。增强对比度的图像突出了两种物种和DESI-MSI分析期间的感兴趣区域（ROI）。(B) 应用无监督分割算法的数据分析工作流程。原始数据在导入R之前进行HDimaging处理，然后使用cardinal包执行无监督分割算法，通过空间收缩的质心来确定具有不同化学轮廓的区域。(C) 离子叠加显示选定的离子图像；不同颜色对应不同的分子信号。(D) 空间分割分析的输出，算法以无偏见的方式确定了7个不同的空间化学区域。刻度条如图所示。

从广泛范围的DESI-MSI分析中测量的4000个总分析物特征中，通过无监督分割识别出584个与苏云金芽孢杆菌和辣椒疫霉的代谢状态相关的空间相关分析物信号。这些信号的位置分辨特性可以通过离子叠加的形式可视化，其中每个片段在成像区域内占据离散的区域（图5A）。每个片段都显示了独特的化学特征，无论是存在的分析物类别还是测量的信号强度（图5B）。特征的重要性由信号在SSC框架内确定单个空间簇的贡献程度决定，正的t统计值对应于由于丰度和特征而更有效地区分独特空间片段。在片段1中优先考虑的分析物信号（378个特征）包括溶血磷脂酰胆碱（LysoPC）类和溶血磷脂酰肌醇（LysoPI）类脂质、饱和游离脂肪酸（FFAs）和不饱和FFAs。片段2中的显著特征（458个特征）主要是非脂质物种，其余为不饱和FFAs。在片段3中发现了五类显著的化合物（130个特征），包括磷脂酰甘油（PG）脂质、磷脂酰乙醇胺（PE）脂质、饱和FFAs、己糖基神经酰胺（HexCer）脂质，以及非脂质物种。片段4中观察到的四个显著类别的化合物包括饱和FFAs、羟基FFAs、PG脂质和非脂质物种（47个特征）。片段5中识别出了六类化合物（48个特征）。从识别出的显著特征数量最多的到最少的排序，这些类别是PG脂质、饱和FFAs、PE脂质、不饱和FFAs、HexCer脂质和非脂质物种。片段6由饱和FFAs、不饱和FFAs、非脂质物种和羟基FFAs组成。片段7（58个特征）位于距离以卵菌为主的区域最远的区域，其显著成分被确定为饱和FFAs、不饱和FFAs、PG脂质、羟基FFAs和LysoPC脂质。每个片段中观察到的特征的完整描述和重要性可以在补充表S2中找到。

图5．通过DESI成像的辣椒疫霉和苏云金芽孢杆菌共培养物的代谢表型分析的结果。(A) 分割算法的输出（顶部，左侧）和离子叠加（1-7）显示了由基于SSC的k均值聚类确定的七个区域中的每个区域发现的信号。离子叠加用于传达图像分析算法识别的片段中信号的确切空间定位。(B) 通过分割无偏见确定的每个表型区域内显著特征的类别细分。饼图表示前20个最显著特征的类别细分，信号识别是通过使用10 ppm阈值的质谱准确性计算确定的。

对于图像的两个远端区域（片段1和7），观察到的非脂质数量有限，这两个片段中识别出的所有显著分析物都是脂质。根据光学图像叠加，这些区域主要分别由两种单独的物种辣椒疫霉和苏云金芽孢杆菌占据。在这些远端区域，FFAs在测量的丰度方面占主导地位，包括饱和和不饱和FFAs以及偶数链和奇数链FFAs。与这些观察结果相比，标记为物种间相互作用的区域（片段2-4）具有与非脂质物种相关的主要显著信号。在片段2中发现的两个非脂质物种包括与己糖和庚糖相关的信号。这些糖主要是通过精确的质量测量来识别的，因此代表了许多可能的异构体，需要进一步的实验（例如色谱、串联质谱、离子迁移）来确定具体的糖异构体。通过比较每个片段相关的化学类别分布，可以推断出将这些微生物物种共培养在一起所带来的代谢状态改变的影响。这些广泛的化学成像结果提供了对共培养中特定化学生态的洞察，通过识别每个片段表型特征的关键代谢物，并同时表征它们的空间分布。在片段之间观察到的大多数可识别差异是由于脂质谱型的变化，特别是FFAs和脂质尾部的脂质烷基链的长度和饱和度的变化。例如，在片段4中没有观察到显著的不饱和FFAs信号，而这一类在每个其他片段中都占了相当大的比例。众所周知，脂质的饱和度在膜流动性、膜通透性和细胞应答中起着重要作用，饱和脂肪酸对应于更刚性和渗透性较低的膜，由于碳链上没有双键而不易受到氧化应激的影响。(32) 在物种间相互作用区域（片段4）中没有观察到显著的不饱和FFAs，这可能对应于在抑制区发生的细胞反应，该区域由于靠近病原体而倾向于具有上述特性的膜。在七个片段中FFAs的分布之间的另一个显著差异是除了片段2和5之外，每个区域都存在奇数链FFAs的显著存在。根据对这些菌株的先前研究，预期会有奇数链脂肪酸的存在，尽管在空间分析的背景下这种观察的生物学解释尚不清楚。(33,34)

使用热图可以可视化单个m/z值和不同分析物的空间分布，从而揭示成像区域内分析物的具体位置（图6）。DESI-MSI在共培养物中识别出的主要脂质类别之一是PG脂质。在共培养物中发现了十二种不同链长和三种不同饱和度的PG脂质，它们分别定位在特定的区域。这种异质的脂质分布意味着由于结构差异而产生的不同功能，并强调了图像分析期间计算的统计观察结果。饱和的PG脂质PG 29:0、PG 30:0和PG 31:0，以及不饱和的脂质PG 32:2、PG 33:2和PG 34:2主要集中在BCA和卵菌之间的物种间相互作用区域（片段2、3和4）。相比之下，饱和的PG脂质（PG 32:0、PG 33:0和PG 34:0）主要分布在与苏云金芽孢杆菌相关的三个区域（片段5、6和7），而三种单不饱和脂质则分布在与卵菌和物种间相互作用区域相关的区域（片段1、3和4）中。图S2中提供了FFA脂质的额外代表性热图。如果没有MMS DESI-MSI分析提供的空间化学信息，将个别信号归因于共培养物中的特定物种或区域将是具有挑战性的。DESI-MSI提供的更深层次的分析特别适用于研究两种共培养物中都产生的代谢物类别，例如这些PG脂质和FFAs。

图6．磷脂酰甘油（PGs）的DESI分子图像揭示了辣椒疫霉和苏云金芽孢杆菌共培养物中的异质脂质分布。这些MSI热图按PG链长（行）和饱和度（列）组织，链长从上到下增加，双键总数从左到右增加。

PG脂质在原核生物膜功能中起着重要作用（例如基于电荷的自组装、蛋白质转运、复制起始等），并且有文献证明这两种物种在营养生长过程中都存在PG脂质。(33,34) 此外，本研究中初步识别的PG脂质特征与之前对芽孢杆菌菌株的环境MSI和IM-MS研究结果一致，包括那些专门探测苏云金芽孢杆菌脂质组的研(34?37)。由于这些热图是空间标准化的，因此可以将异质的化学信号分布直接与微生物相互作用不同区域中发生的生理反应联系起来。如果这些信号仅仅是背景脂质组成的反映，那么它们预计会在整个图像中均匀分布或仅限于单一物种来源。然而，DESI-MSI分析观察到特定脂质信号在物种间相互作用区域内的独特集中表明这些分子要么是直接响应卵菌-细菌相互作用产生的，要么是在两种生物膜的通用成分中积累的。特别是，在相互作用区域观察到的饱和脂质和FFAs的增加表明了对物种间压力的生理适应。膜刚性的增加、渗透性的降低以及对氧化降解的抵抗力是微生物对竞争性和恶劣环境的已知反应。因此，这些脂质物种在物种间相互作用区域的定位强有力地证明了两种物种之间的相互作用驱动了每种生物体脂质组的代谢变化。虽然某些PG脂质信号的增加表明了生理反应，但FFA信号可能是与脂质降解相关的标记。这项研究首次通过分析活细菌与卵菌的共培养体系，观察到了多相油脂（PG lipids）和游离脂肪酸（FFAs）的非均匀空间分布情况，这直接有助于更深入地理解微生物生物炭（BCAs）的生化过程。未来的研究将尝试采用互补的正交技术以及时间分辨采集方法，以进一步提升对本文观察到的代谢变化的生物学解释能力。

**结论**

在这项研究中，评估了B. vallismortis、B. amyloliquefaciens、B. subtilis和B. thuringiensis作为促进番茄生长发育和生物防治Phytophthora capsici的菌株的效果。虽然B. subtilis和B. thuringiensis在体外和生长室环境中均能促进植物生长并提供对P. capsici的防护作用，但在非无菌土壤温室实验中，B. vallismortis和B. amyloliquefaciens的效果较差。利用DESI-MSI对病原体与生物炭的共培养模型进行分析，揭示了P. capsici与B. thuringiensis之间的相互作用及化学信号传导机制，这些分子相互作用构成了其生物化学特性的基础。研究表明，DESI-MSI是一种有效的分析手段，能够对生物炭产生的生物活性化合物进行空间分析，从而更深入地了解生物炭在番茄栽培中的益处。虽然这项工作主要展示了直接环境质谱分析在解析植物-微生物共生关系方面的分析潜力，但未来的研究将集中于考察特定分子标志物的动态变化过程，并结合离子迁移分离技术，我们认为这一技术对于区分异构体、支持结构鉴定以及弥补色谱法可能会丢失的峰容量分析至关重要。