适合课堂使用的多维学习高效液相色谱实验：利用丙二醇作为绿色无害的流动相测定对乙酰氨基酚

《Journal of Chemical Education》：Classroom-Friendly HPLC Experiments for Multidimensional Learning: Assay of Acetaminophen Using Propylene Glycol as a Green and Safe Mobile Phase

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本研究展示了开发和实施适用于课堂教学的高性能液相色谱（HPLC）实验，这些实验将分析化学原理与绿色化学和实际应用相结合。该方法基于一种最初为制药行业开发的新方法，使用丙二醇（PG）作为低毒性的、对环境友好的流动相，用于检测对乙酰氨基酚（AC）和咖啡因（CF）片剂。该方法经过调整后可用于教学，并扩展到包括实验室废水的环境分析以及药物质量控制。由于丙二醇的低风险特性，学生可以安全地进行HPLC操作，同时深入了解可持续分析实践中绿色溶剂的选择。此外，该方法分析速度快——每次运行大约需要2分钟——非常适合时间有限的课程。

该实验分为四个部分：（1）流动相制备和仪器设置；（2）使用外部和内部标准进行AC片剂检测，以及单点和多点校准方法；（3）实验室废水处理后的HPLC分析；（4）初步的绿色性评估。这种模块化设计可以灵活地适应不同的学习目标和时间安排。课后调查表明，学生在概念理解、定量数据分析、可持续性意识以及专业相关性方面表现出色。通过将化学分析与注重安全的设计相结合，这项工作为将绿色化学融入仪器分析课程提供了实用模型，培养了现代科学实践中所需的技术能力和可持续性思维。

**引言**
高性能液相色谱（HPLC）是一种广泛用于制药（1,2）、环境（3）及相关领域（4,5）的分析技术，因为它具有高精度和能够分离多种化合物的能力。尽管仪器和消耗品的成本较高，限制了其在教育环境中的使用，但所用溶剂的安全性同样重要。像乙腈和甲醇这样的挥发性有机溶剂对健康和环境构成重大风险（6-9），尤其是在缺乏适当化学处理和废物处理基础设施的机构中。这些安全挑战是阻碍HPLC进入教学环境的主要障碍。

目前，绿色分析化学已成为推动更安全和更可持续分析实践的指导框架（10），提高了分析人员的安全性，同时减少了生态足迹（10）。在HPLC应用中，用更环保的溶剂（如乙醇（11-14）、乳酸乙酯（15,16）或水（17,18）替代传统溶剂显示出了巨大潜力。为了应对行业日益增长的环境问题（19），化学教育者也开始将绿色化学原理纳入学术课程（20-25）。这些努力旨在加深学生对可持续实践的理解，促进更安全的实验室活动，并培养负责任的科学公民（20-25）。最近的研究描述了在教育环境中使用HPLC的方法，包括量化糖果产品中的色素（26）、药用植物中的活性成分（27）、药片（28）和护肤配方（29），以及使用HPLC模拟器的虚拟练习（30）。然而，只有少数适用于课堂的实验室模块能够让学生在进行真实安全的HPLC分析的同时，加强基本分析概念并整合绿色化学原理。

在我们最近的工作中，我们首次成功使用丙二醇（PG）作为绿色流动相溶剂，同时检测药片中对乙酰氨基酚（AC）和咖啡因（CF）的含量。这种方法最初是为药物质量控制设计的。它可以有效分离与AC相关的杂质4-氨基酚（AP），并且其性能可与标准药典程序相媲美（32）。除了低毒性和对环境影响小外，PG在室温下几乎不挥发，因此无需复杂的通风设备。与甲醇或乙腈不同，PG不属于易燃液体，大大降低了火灾风险。此外，由于PG没有全球统一制度（GHS）规定的危险等级，其采购、使用和处置只需遵循较宽松的安全规定。这些特性使PG特别适合缺乏专门化学安全资源的教育实验室和机构（33）。

基于这种方法，本研究展示了如何将制药行业的一种成熟分析技术重新应用于适合课堂的动手实验。调整后的活动让学生了解基本概念，包括色谱操作、校准技术和定量数据分析，同时强调实验室实践中溶剂安全的重要性。除了在药物质量控制中的应用外，该方法还扩展到检测处理前后实验室废水中的AC残留物，增强了实验在环境监测和责任方面的相关性。通过参与这些实验，学生获得了实用技能，并更广泛地理解了分析化学在公共卫生和可持续性中的作用。这种方法符合现代科学教育的目标，强调体验式学习、批判性思维以及培养具有环境意识的科学家。

**原型方法及其在教育实验中的应用背景**
本实验中使用的HPLC原型方法最初是为同时分析组合片中AC和CF而开发的，同时还能分离AP杂质。有关该方法开发和验证的详细信息可以在原始出版物中找到（31）。简而言之，通过系统优化关键色谱参数（即流动相pH值和PG百分比、流速和柱温），实现了AC、CF和AP的快速高效分离，并将背压保持在200巴以下。使用了长度为10厘米的C18柱以最小化流动阻力。选择pH值为4以获得最佳分离效果和柱稳定性。25%（v/v）的PG使得所有分析物在2分钟内洗脱完毕，并保持较低的背压。流速设定为2.0毫升/分钟，以实现快速分析和高通量，同时不超出压力限制。柱温设定为50°C，以降低粘度和背压。综合这些条件，该方法在目标范围内实现了高效分离，并由于PG在极性和分析物相互作用方面的最佳平衡，表现出优于其他非挥发性溶剂（包括基于甘油的流动相）的性能。

该方法根据既定指南进行了严格验证。结果显示准确率在98-102%之间，日内和日间测定的相对标准偏差（%RSD）低于2%，并且具有很强的特异性（无峰重叠，峰纯度因子≥0.99），证实没有辅料干扰。此外，该方法表现出良好的稳定性（%RSD≤2%），当关键参数（流速、柱温、流动相中的PG百分比和检测波长）被故意改变时，没有统计学上的显著差异（p>0.05）。尽管其主要应用于药物质量控制，但该方法具有显著的教育价值。安全性、快速性和实用性使其非常适合动手分析化学实验，为学生提供了与行业相关技术的真实经验。虽然教师可以选择使用完整的原始方法来分析多组分药物制剂，但在本教育背景下，该方法被简化为更简单、更直接的应用方式。具体来说，它被用于检测单组分AC片剂（这些片剂作为非处方药更为常见）。原型方法中的CF被重新用作内部标准。通过这些调整后的实验室活动，学生了解了关键分析概念，包括HPLC仪器的操作和使用外部和内部标准进行定量数据分析的方法。学生还练习了单点和多点（标准曲线）校准技术，从而比较了不同定量策略的优点和局限性。通过使用低风险、环境友好的PG作为流动相，该实验清楚地展示了基于安全考虑的溶剂选择。这有助于学生理解绿色化学原则的实际应用，并强化了对实验室安全和环境责任的核心价值观。

除了用于药物质量控制外，该方法还用于检测实验室废水中的AC残留物——在废物处理前后使用 inexpensive 吸附剂进行检测，这是对原始方法的新扩展。这种调整不仅展示了该方法在药物分析之外的多功能性，还让学生了解了实际的环境监测，并鼓励他们思考实验室实践对生态系统的影响。通过参与这些真实的分析挑战，学生从多个维度上了解了分析化学在促进公共卫生和环境管理中的作用。总体而言，这些多方面的学习经历使学生能够将理论知识与实际应用联系起来，培养科学素养和具有环境责任感的分析化学家的思维。

**表1** 总结了分析的色谱条件。这些条件使得AC、CF和AP在大约2分钟内快速完全分离（图1），使该方法适用于时间有限的实验室课程，最多可以完成10次注射（例如5个标准和5个样品），大约需要30分钟。该方法在AC浓度为0.025至0.125毫克/毫升的范围内表现出线性响应，回归方程为y = 9982.78x + 5.9585（y = 峰面积；x = 浓度，毫克/毫升），相关系数（r2）为0.9998。AC的检测限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.0022毫克/毫升和0.0068毫克/毫升。

**实验概述**
在这项教学研究之前，研究方案获得了Silpakorn大学机构审查委员会的人体研究伦理审查豁免（豁免证书：68.0529–057）。在数据收集之前，所有参与学生都获得了口头同意。在本研究中，实验室课程持续6小时。然而，模块化设计允许教师根据需要进行调整。例如，课程可以分为两个3小时的阶段——第一天专注于仪器分析和数据收集，第二天进行定量数据分析、绿色性评估和讨论。

在此介绍的实验室版本中，十名参加药品分析选修课的五年级药学学生被分成两个五人小组。使用了两台根据表1设置的HPLC系统，每个小组使用各自的仪器。这种设置可以根据不同的班级规模或HPLC可用性进行调整。

在实验之前，所有参与者（包括学生和教师）都必须学习网站上的在线实验室手册（34）。这种无纸化和交互式的资源提供了简洁的介绍、明确的学习成果、详细的程序、指导性问题及活动，以及外部链接（如回归和置信区间计算器）。它还作为数据记录的文档模板，使学生能够方便地记录实验结果（通过输入、手写或插入图像），并将最终文档导出为PDF格式提交给教师。该文件可用作复习和考试准备的参考资源。对于离线版本，实验室手册和报告也被编入PDF文件中，作为支持信息的第1部分。

该实验结合了动手实验室工作、数据分析和协作活动，提供了全面的学习体验。课程从流动相制备和HPLC设置开始（柱连接、清洗和平衡）。在等待基线稳定期间，学生准备药物片剂样品溶液。系统准备好后，他们进行HPLC注射并收集色谱数据。除了分析药物样品外，课程还通过废物处理活动强调了良好的实验室实践。学生使用活性炭或其他容易获得的吸附剂处理含有醋酸（AC）的模拟高效液相色谱（HPLC）废液。然后，他们利用相同的HPLC系统和校准曲线，在吸附前后测定醋酸的浓度。这使他们能够评估吸附效率、判断处理效果，并在实际应用中运用他们的分析技能。数据收集完成后，学生通过多种定量技术（包括外部和内部标准方法以及单点和多点校准）计算检测结果。整个过程由实验手册中的结构化问题引导，以加深对概念的理解。

为了进一步提高环境意识，学生还会根据手册中规定的评估标准，比较所使用分析方法的环保性（例如溶剂的选择）与传统方法。通过这种多维度的体验，学生能够掌握色谱分析技术、培养批判性思维、科学沟通能力，并了解可持续的实验室操作规范。绿色化学原则与实际应用的结合，使学生能够在制药和环境领域发挥积极作用。

**注意事项：**
本实验中使用的分析物和PG溶剂毒性较低，适合教学使用。PG不易燃，挥发性低，接触时风险很小。所有标准化学试剂都只使用微量分析级。主要风险来自冰醋酸，它具有腐蚀性，可能刺激皮肤和眼睛；其蒸气不得吸入。因此，即使向流动相中加入的冰醋酸少于1毫升，也必须在通风橱中进行操作。实验过程中必须佩戴标准个人防护装备（护目镜、手套和实验服）。建议学生阅读安全数据表（SDS），并遵守所有化学品处理和安全规程。

**实验室活动详情：**
实验室活动分为四个独立部分，为教学提供了结构化且灵活的框架。这种模块化设计允许教师根据具体学习目标、学生水平及时间限制调整各部分的内容和重点。该格式还支持灵活的实施方式，例如将实验工作与数据分析分开，或根据课堂时间调整各部分的深度。教师可以根据教学目标和实际情况调整操作细节。例如，当课堂时间有限时，教师可以提前准备流动相或预处理HPLC系统，让学生专注于样品制备和注射；或者使用学生实际分析过程中的废水样本来增强实验的实用性。

**图2**展示了四个部分的总体结构，**表2**则提供了六个小时实验室流程的时间线。所有实验步骤和学习活动的详细描述见于配套的实验手册中。

**表2. 6小时HPLC实验室的活动时间线（按部分划分）**
| 时间段 | 活动内容 |
|--------|--------------------------------------------|
| 第1时段 | 实验介绍；流动相制备与仪器设置 |
| 第2时段 | 醋酸片剂的检测；标准品和样品制备 |
| 第3时段 | 通过吸附技术处理实验室废液；运行吸附实验 |
| 第4时段 | 评估分析方法的环保性；结果展示与讨论 |

**图2.** 一个适合课堂的HPLC实验结构图，体现了其在仪器分析、绿色化学原理、实际应用和环境责任方面的多方学习内容。

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在本部分中，学生学习如何制备流动相并设置HPLC系统，获得色谱分析基本步骤的实际操作经验。学生按规定比例混合溶剂，加入适量冰醋酸调整pH值至4，然后过滤并脱气以去除颗粒物和溶解气体。接着连接HPLC柱子，验证安装正确性，并用制备好的流动相进行系统清洗和平衡。通过本部分的学习，学生应理解流动相通常由两种溶剂组成的二元体系，其极性和pH值对色谱分离效果至关重要。他们将掌握HPLC系统设置的实际技能，并认识到平衡对于确保系统稳定性的重要性。

在流动相制备过程中，学生会发现PG的粘度比常见的HPLC溶剂（如甲醇或乙腈）更高。这种高粘度限制了PG在液相色谱中的应用。为防止系统背压超过仪器安全限制，流动相中PG的最大比例受到限制。因此，PG不能作为常规有机溶剂的通用替代品。例如，需要强洗脱条件的非极性分析物（如含有超过50%有机修饰剂的样品）无法用PG有效洗脱。此外，为控制背压可能需要使用更短的柱子或更低流速，从而影响含相近洗脱组分的混合物的分离效率。

虽然PG的高粘度限制了其应用范围，但这为教学提供了契机。教师可以利用这一点回顾学生在仪器分析课程中学到的核心HPLC方法开发概念，特别是降低系统背压的策略（如降低PG浓度、缩短柱长或提高柱温）。这里使用的条件（25% PG、10厘米柱子、50°C）使这些策略得以应用，确保系统在200巴以下稳定运行。同时，这也让学生了解绿色分析化学中的科学权衡：虽然PG在本实验中对醋酸具有有效的分析效果且安全性较高，但仅在特定条件下对特定目标分析物最适用。

**图3** 显示了使用外部和内部标准方法得到的醋酸标准曲线示例。

**下载MS PowerPoint幻灯片：醋酸片剂的检测**
当HPLC系统准备好后，学生可运用HPLC技术对含有多种辅料和潜在杂质的复杂样品中的目标化合物进行定量分析。学生准确称量并稀释醋酸片剂（Cemol，Central Poly Trading，泰国），配置方法参数、注入样品并收集色谱数据。通过讨论极性和溶解度等概念，理解醋酸与其他化合物（如CF）的洗脱顺序。在定量前，学生先通过确认醋酸峰的保留时间和紫外光谱（由HPLC二极管阵列检测器记录）与标准溶液的一致性来进行定性鉴定，随后使用外部标准方法建立校准曲线并计算含量。同时进行内部标准方法以获得更准确的定量结果。

**图3.** 使用外部和内部标准方法得到的醋酸标准曲线比较。

**下载MS PowerPoint幻灯片：单点校准**
本部分介绍了单点校准技术（药典检测中常用）作为多点校准的替代方案。学生通过统计分析y截距的置信区间来评估其可行性和可靠性。需要注意的是，参与实验的学生已在课程的理论部分学过这些校准技术的原理，因此教师在实验中不再重复讲解不同校准类型及其适用场景。对于没有相关背景的学生，教师可以详细解释每种校准方法的适用情况。通过完成这部分内容，学生将掌握基于校准的定量技能，加深对分析灵活性的理解，提高数据解释能力，并理解药品质量控制中方法选择的重要性。

**图4.** 通过吸附技术处理实验室废液**
由于活性药物成分（APIs）对人类健康和生态系统的潜在危害，其存在于环境中的问题日益受到关注。尽管实验室不是主要来源，但含API的废液长期排放仍需认真处理。本部分采用实用的、负责任的可持续方法处理这类废液。学生继续使用HPLC，但重点转变为分析含有约0.1 mg/mL醋酸和0.013 mg/mL CF的模拟废液中的残留醋酸。使用的活性炭是一种低成本、70目粉末，由蒸汽活化椰壳制成。该材料具有高比表面积（>1300 m2/g），能在短时间内有效去除废液中的醋酸和CF。学生可以直接观察处理过程，了解自己在保护环境中的作用。这种实践经验不仅拓宽了HPLC的应用视野，还提升了环保意识。

**表4.** 模拟废液中的醋酸和CF色谱图（a）处理前和（b）处理10分钟后。

**下载MS PowerPoint幻灯片：评估分析方法的环保性**
在现代化学分析中，随着行业向可持续发展转变，分析过程的环境影响日益重要。本部分让学生了解评估方法“环保性”的概念，增强他们对环境责任的实际认识。学生通过查阅安全数据表和相关科学文献，评估分析方法的安全性和环境影响（如溶剂毒性、使用量和废液产生量）。虽然本实验未进行全面的环保性评估，但鼓励使用Analystical GREEnness指标（AGREE）或Green Analytical Procedure Index（GAPI）等工具进行综合评价（条件允许的情况下）。这一过程不仅提高了学生的科学判断能力，还培养了现代科学实践所需的可持续性思维。

**学生表现与满意度评估：**
学生表现评估基于四个方面：实验室操作（30%）、数据记录与分析（25%）、回答与讨论（25%）及书面考试（25%），每个方面都与具体预期学习成果（ELOs）相对应，涵盖实践技能、数据解释、批判性思维和理论理解。为确保评估的一致性和透明性，制定了详细的评分标准（见支持信息第二部分）。本研究中所有评估均由同一位教师完成。实验室操作和报告（包括数据记录/分析和讨论）按两组（每组五名学生）进行评分，而书面考试则单独评分。总体平均总分为91.50 ± 3.10（满分为100），表明达到了预期的学习成果。学生在实验操作方面的表现非常出色（28.00 ± 0.00/30分），展现出在高效液相色谱法（HPLC）准备和操作方面的持续能力。在数据处理（23.00 ± 1.05/25分）和报告撰写（23.00 ± 1.05/25分）方面的出色成绩反映了他们良好的分析理解和沟通技巧。尽管笔试成绩略低（17.50 ± 1.72/20分），但仍处于高水平范围内，说明他们对相关概念有扎实的掌握。在本研究中，某些评估项目中观察到的高分和较小的变异度（标准差较低）可能归因于学生群体特征和评分机制。作为已经修过第三年仪器分析课程的五年级药学学生，参与者具备先前的技术技能，能够高效完成实验。此外，小规模团队（n=2组）内进行的实验操作和报告评分方式本身导致分数分布较为集中。总体而言，研究结果表明该实验模块有效地培养了学生的实践能力和认知能力，成功达到了所有设定的学习目标。根据教师观察，在实验实施过程中没有发现显著困难。

通过实验后问卷收集的数据（见支持信息第4部分）显示，学生在所有学习领域中的自我评估成绩都非常高。具体来说，学生在解释HPLC基本原理和分析数据解释方面的能力很强，平均得分为4.70 ± 0.48（五点李克特量表：1=“强烈不同意”，5=“强烈同意”）。与实验室废物管理和分析方法环境影响初步评估相关的能力也获得了高分，平均得分为4.60 ± 0.70。这些结果表明，实验不仅帮助学生掌握了知识，还提高了他们在药学分析背景下对环境责任的认识，这是将绿色化学融入实验教育的核心目标之一。学生的满意度同样令人印象深刻。他们对整个课程内容的覆盖度评价很高（平均4.70 ± 0.48），并且对互动式学习活动的参与度和价值感知也非常高（平均4.90 ± 0.32）。这表明该模块不仅促进了认知发展，还带来了积极的情感体验，这对有意义和持久的学业成果至关重要。模块内容的组织结构、清晰度和相关性被认为是影响学生对其效果评价的关键因素。

定性反馈进一步证实了这些定量结果。许多学生表示，在参与该模块后，他们的概念理解和实际操作技能都有显著提高。一些人提到，动手操作的HPLC实验和明确的操作指导使他们能够将理论知识与实际应用联系起来，从而加强了科学推理能力和对复杂分析的信心。一些评论还反映了学生对可持续实验室实践的增强意识，认识到在开发或选择分析方法时需要尽量减少化学废物的产生并考虑环境影响。值得注意的是，学生表示，在本实验中学到的知识和技能可以直接应用于未来的研究项目、药学执照考试以及他们在制药行业的职业生涯中。这种技能的转移性凸显了该模块的广泛教育价值。学生的积极参与度和高积极性也强调了相关、实践性强且符合职业要求的实验室体验对于深度学习的重要性。

需要说明的是，这项全面的教学研究仅针对10名选修该药学分析课程的五年级药学学生进行了一次。尽管样本量有限，但这些参与者能够准确代表该专业实验的目标群体。因此，所获得的反馈和结果与预期的教育目标高度相关。此外，正面且一致的反馈（无论是定量还是定性）都支持了研究结果的可靠性。我们认识到这一局限性，并鼓励未来的研究采用更大的样本量、不同的移动相溶剂或不同的教学环境来重复实验，以进一步验证和推广这些结果。同时，评估策略、方法和评分标准可以根据实际学习环境进行调整，例如根据学生的具体技能水平和先前知识来调整实验设置。

总之，本研究成功地展示了如何通过采用工业标准的HPLC方法——使用PG作为绿色且安全的移动相溶剂——为本科生创造一个富有吸引力的、多维度的实验体验。PG无毒、不易燃且对环境的影响极小，这一创新使得HPLC实验在教学环境中既可行又安全。这种方法直接解决了传统系统中溶剂相关的安全隐患问题，体现了绿色化学原则的实际应用。然而，也需要认识到，虽然PG有助于提高实验效果，但其高粘度要求特定的技术调整，例如使用更短的色谱柱、提高温度和限制有机修饰剂的用量，这限制了其在某些分析物上的适用性。通过充分利用PG的优点并透明地解决其分析局限性，实验使学生能够在实践中进行真正的药学分析和环境分析，同时整合了实验室废物管理实践，并评估分析方法的环保性，从而实现了理论知识和实际应用的结合。

整合这一绿色HPLC模块的学习成果体现在学生的高成绩、高满意度以及他们在技术和环境能力方面的提升上。学生们不仅掌握了色谱技术和定量分析的扎实技能，还对可持续和负责任的实验室实践有了更深刻的理解。虽然参与者来自同一课程群体，样本量有限，但积极且一致的正向反馈说明了该教学模式对其目标受众的强大教育价值。这项研究强调了在分析教育中融入环境意识和安全性的重要性，这种做法既实用又具有影响力。这种适合课堂操作的HPLC实验为现代科学教育提供了坚实的基础，不仅培养了学生的分析能力，还增强了他们对可持续性和负责任科学实践的承诺。