通过虚拟筛选与基于构象生物传感器的联合方法发现GPR3配体

《Journal of the American Chemical Society》：GPR3 Ligands Discovered through Combined Virtual and Conformational Biosensor-Based Screening

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GPR3属于G蛋白偶联受体（GPCRs）蛋白质超家族，在良性和恶性生理过程中都起着核心作用，例如脂肪细胞中的能量消耗和阿尔茨海默病的病理机制。尽管受体激动剂和反向激动剂都具有治疗潜力，但迄今为止GPR3还缺乏类药配体和创新筛选技术，这阻碍了针对该受体的有效药物发现工作。为了克服基于cAMP积累或β-阻滞蛋白招募的传统配体筛选技术的局限性，我们开发了一种构象GPR3生物传感器，能够在活细胞中以高通量筛选（HTS）兼容的灵敏度和稳健性监测受体活性。结合针对GPR3同源模型的虚拟化合物筛选和经典药物化学方法，这种生物传感器使我们能够识别出新的配体，其中一种配体（化合物33）以纳摩尔级别的平均效力调节GPR3依赖性的Gs活性。我们的研究不仅提供了用于未来优化工作的新型GPR3配体，并为进一步扩展GPR3配体库铺平了道路，而且我们的传感器方法也为靶向其他具有治疗吸引力但具有挑战性的孤儿GPCRs提供了蓝图。

**引言**
G蛋白偶联受体（GPCRs）蛋白质超家族的成员是超过30%的FDA批准药物的靶点。然而，超过三分之二的非嗅觉GPCRs仍未被用于疾病治疗，包括许多孤儿GPCRs——这些受体尚未发现内源性配体。虽然A类孤儿GPCRs之一GPR3最近才被去孤儿化（1-3），但它仍然缺乏类药配体；此外，用于更好地研究这种受体的创新技术才刚刚出现（4）。GPR3与GPR6和GPR12在系统发育上与结合鞘氨醇-1-磷酸（S1P）、溶血磷脂酸（LPA）、大麻素和前阿片黑皮质素衍生肽的受体相关。GPR3活性参与了良性和恶性生理过程。在中枢神经系统（CNS）中，GPR3促进神经突起生长和神经元存活（5,6），但也与阿尔茨海默病有关（7-10）。在周围组织中，GPR3调节卵母细胞成熟并驱动脂肪细胞中的热生成程序（11）。这些例子表明，GPR3的激动剂和反向激动剂可能对多种病理状况具有治疗价值。尽管研究人员尝试发现针对GPR3的分子已有二十多年时间，但目前只有有限的一组在独立实验室中得到验证的配体（图1）。虽然S1P和大麻二酚（CBD）对GPR3的活性仍有争议（12-16），但AF64394及其结构类似物已证明其作为GPR3特异性反向激动剂的可行性（4,17,18）。此外，二苯碘化物（DPI）是一种经验证的GPR3合成激动剂，其衍生物以亚微摩尔级别的效力促进GPR3依赖性的cAMP产生（12,19）。此外，最近的生化和结构研究表明，内源性长链脂质和脂肪酸可稳定GPR3的活性构象（1,2）。

**图1**
图1. 建议的GPR3配体结构

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**有限的成功案例表明，当前的GPR3靶向药物发现受到对该受体在细胞信号传导中作用理解不足以及用于检测活细胞中GPR3活性的可用检测方法有限的阻碍。这一点从以下几个事实可以看出：目前验证的少数GPR3配体是通过两种可用的检测原理之一——cAMP积累或β-阻滞蛋白招募发现的（12,17,18）。这两种检测方法只能检测GPR3的某些特定细胞功能，可能无法代表GPR3在细胞中介导的所有事件。因此，这些检测方法在识别GPR3靶向化合物方面存在局限性，我们认为需要一种创新的检测方法来提高GPR3配体筛选的成功率。我们的目标是开发一种能够在中至高通量筛选（HTS）格式中独立于通路地检测化合物诱导的GPR3活性变化的传感器。基于NanoLuciferase（Nluc）（20）和HaloTag（21）之间的生物发光共振能量转移（BRET）的新一代构象GPCR传感器满足了这些要求（22-24）。在这里，我们介绍了首个具有HTS兼容灵敏度和稳健性的孤儿GPCR构象生物传感器的开发过程。我们还展示了这种光学工具如何通过结合针对3D受体模型的虚拟化合物筛选和经典药物化学方法来识别新的GPR3配体。我们最有效的新型GPR3配体是一种反向激动剂，它以低微摩尔级别的效力诱导GPR3的构象变化，并降低GPR3下游的Gs活性，平均效力在纳摩尔范围内。

**结果与讨论**
**构象GPR3传感器的设计与验证**
为了开发一种可用于微孔板格式的构象GPR3生物传感器，我们采用了之前已验证的多种GPCR的分子内BRET设计（22-24）。BRET供体NanoLuc被融合到受体的完整C末端，而自标记蛋白质标签HaloTag被插入到GPR3的第三个细胞内环中，位于Arg231和His232氨基酸之间（图1a；序列见图S1）。这种GPR3-HaloTag/Nluc融合构建体甚至在表面表达水平上高于野生型GPR3，这一点通过使用这些GPR3构建体的N末端HA-Tag进行的整个细胞ELISA得到了证实（图1b）。当在人类胚胎肾293A细胞（HEK293A）中表达GPR3-HaloTag/Nluc时，用HaloTag NanoBRET 618配体进行荧光标记并添加Nluc底物furimazine后，受体基础构象下的BRET在发光光谱中通过约620 nm的特征受体峰显示出来（图1c）。此外，用GPR3反向激动剂AF64394处理后，BRET随时间和配体浓度增加（图1d,e）。AF64394的EC50值为161 nM，与其对N末端Nluc融合GPR3的亲和力以及其在GPR3野生型依赖性cAMP测定中的效力相当（4,17），证明了这个构象GPR3生物传感器的功能性。另外，用AF64394结合受损的GPR3-HaloTag/Nluc突变体（4）（图1e）以及基于HaloTag/Nluc的α2A和β2-肾上腺素能受体（β2AR）的生物传感器（22）进行的实验验证了AF64394诱导的GPR3生物传感器反应的特异性（图S2）。与反向激动剂AF64394不同，内源性激动剂OEA和油酰胺会导致BRET浓度依赖性降低（图1f），证实了生物传感器能够报告配体的有效性。为了评估这种新传感器是否适合中至高通量配体筛选，我们在四个独立实验中测量了其Z′因子（25），证实了其高灵敏度（平均值±SEM Z′因子=0.78 ± 0.02）和低日间变异性（变异系数=6.3%）（图1g和S3）。最后，我们使用cAMP生物传感器（26）验证了GPR3传感器的信号传导能力（图1h）。这些实验显示，当共表达GPR3-HaloTag/Nluc时cAMP水平升高（图1i），而AF64394则导致cAMP浓度依赖性降低（图1j），证明GPR3构象生物传感器具有类似于野生型的信号传导能力。

**虚拟筛选新GPR3配体**
为了展示这种独立于信号通路的受体活性检测方法在配体发现中的价值，我们使用构象生物传感器筛选调节GPR3活性的化合物。为了预选体外测试的化合物，我们进行了基于结构的计算机模拟筛选（27）。在本研究开始时，没有GPR3或其相关受体GPR6和GPR12的实验结构。因此，我们根据系统发育相关的 cannabinoid受体1的实验结构（PDB ID分别为6N4B和5TGZ）（图S4a-c）构建了活性状态和非活性状态的GPR3同源模型。在对这两个GPR3模型的正构口袋进行的探索性对接计算中，AF64394及其两个结构类似物比随机选择的虚拟化合物库（约700个分子）排名更优，表明这些模型确实能够识别这些GPR3配体（图S4d,e）。虽然这一发现令人鼓舞，但最近获得的GPR3与AF64394复合体的实验结构显示该配体不结合到正构口袋（31），因此如果项目今天才开始，我们就不会包括这一步骤。然后，我们将来自瑞典化学生物学联盟（CBCS）的约70,000种易获化合物库中的化合物（pH 7 ± 2）对接到这些结构上。基于对接得分的前100个分子的姿态进行了视觉检查。接着，根据2D相似性对来自每种对接计算的120个分子进行了聚类，以获得高结构多样性的化合物供测试。最终，从对接GPR3两种模型的列表中获得了31个化合物，从共识列表中获得了20个化合物用于体外测试。

**体外测试虚拟候选化合物**
最初，所有93个化合物在1 μM浓度下在GPR3生物传感器上进行了活性测试（图2a）。只有三种化合物诱导的BRET反应超过了平均载体反应±3倍标准差的阈值，随后这些化合物被稀释后应用于表达GPR3-或β2AR-HaloTag/Nluc的细胞中（22）（图S5a-c）。所有三种化合物都诱导了GPR3特异性的构象变化。因此，我们寻找了这些化合物的商业可用衍生物，并获得了14种额外的化合物。在这些类似物中，又有两种化合物诱导了GPR3特异性的构象变化（图S5d-f）。从虚拟筛选中选出的五种化合物中的三种——以下简称虚拟候选化合物1-3——被选中进行内部化学合成（化合物52、93和115；参见方案1，图S6），并获得了纯度≥99%的化合物用于验证（NMR光谱：图S7-S142；HPLC纯度：图S143-S218）。对于VH1，合成并使用了外消旋混合物rac-VH1/52进行测试。化合物52、VH2/93和VH3/115（图S6）随后使用GPR3生物传感器进行了验证，其中β2AR-HaloTag/Nluc作为阴性对照。所有三种化合物都引起了浓度依赖性和GPR3特异性的构象变化，效力范围从25 μM（rac-VH1）到85 μM（VH3）（图2b-d）。VH1-3类似物的合成 21–37 (A)、52–77 (B, C)、80–84 (D)、93–100 (E)、115–124 (F)
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试剂和条件：
(a) N-溴代琥珀酰亚胺 (1.2 当量)，PhPh3 (1.2 当量)，DCM，4 小时，0 °C；
(b) 丁-2-酮，48 小时，90 °C；
(c) 20 M NaOH，丙酮，2 小时，60 °C；
(d) 乙醇，48 小时，100 °C；
(e) CH3I (1.2 当量)，K2CO3 (3.0 当量)，DMF，过夜，室温；
(f) LiAlH4 (2.0 当量)，TFA，4 天，0 °C 至室温；
(g) 甲磺酰氯 (2.0 当量)，TEA (2.0 当量)，DCM，过夜，0 °C 至室温；
(h) 钠盐 (3 当量)，DMF，过夜，110 °C；
(i) 20% TFA 在 DCM 中，过夜，0 °C 至室温；
(k) 双环羧酸 (2.0 当量)，DIPEA (3 当量)，HATU (1.1 当量)，DMF，过夜，室温；
(l) 4-甲基苯胺 (1 当量)，TEA (2 当量)，DCM，4–6 小时，0 °C 至室温；
(m) 叔丁基哌嗪-1-羧酸酯 (3 当量)，K2CO3 (5.0 当量)，CH3CN，5 小时，80 °C；
(n) 50% TFA 在 DCM 中，3 小时，室温；
(o) 3-苯丙酸衍生物 (1 当量)，DIPEA (2–3 当量)，HATU (1.2–1.5 当量)，TEA (2 当量)，DCM，12 小时，-15 °C。

在我们已经通过构象读数鉴定出第一个 GPR3 配体之后，我们接下来想要了解这些化合物是否可以在基于 cAMP 的检测方法中被检测到，因为这种方法在过去被广泛用于筛选 GPR3 配体。因此，我们在表达 cAMP 生物传感器的细胞中测试了 rac-VH1/52、VH2/93 和 VH3/115。有趣的是，只有 rac-VH1（以及在较小程度上的 VH2）诱导了依赖于 GPR3 的 cAMP 浓度变化，这表明基于 cAMP 的筛选方法可能会错误地将 VH3 分类为无活性物质（图 3）。

图 3
图 3. rac-VH1/52、VH2/93 和 VH3/115 对 GPR3 依赖性 cAMP 生成的影响。
(a–c) 通过在 HEK293A 细胞中瞬时转染 cAMP BRET 传感器和 pcDNA 或 GPR3，由 rac-VH1/52 (a)、VH2/93 (b) 或 VH3/124 (c) 引起的 BRET 变化（车辆校正后）。数据显示三次独立实验的平均值 ± SEM。统计显著性通过双向 ANOVA 和 Sidak 多重比较进行测试（*：p < 0.5；**：p < 0.01）。

不幸的是，使用 10 和 100 μM 的化合物处理观察到的 GPR3-HaloTag/Nluc 反应表明，其他 18 种 VH1/2/3 相关分子（参见补充信息中的选择过程）并没有显著超过模板分子的效果（图 S219–S221）。因此，我们决定利用这些信息，采用传统的药物化学策略以较小步长对 VH1/VH2/VH3 进行结构修饰，获得与模板更相似的类似物（图 S222）。总共合成了 48 种不同的 VH1 类似物（21–37、52–77 和 80–84；包括 rac-VH1/52）、17 种 VH2 类似物（93–110）和 9 种 VH3 类似物（115–124）（参见方案 1），对其分子的不同区域进行了修饰。关于这些分子的合成和分析验证的详细信息可以在支持信息中找到（NMR 光谱：图 S7–S142；HPLC 纯度：图 S143–S218 和方案 1）。所有 74 种 rac-VH1/VH2/VH3 类似物首先在两个不同的浓度下进行了测试，10 μM 和 100 μM，并将观察到的 BRET 变化与同一生物重复实验中的 VH1/2/3 进行了比较（图 4a 和 S223）。从这些结果中，选择了一些有前途的类似物进行全浓度-反应实验，使用 GPR3-HaloTag(618)/Nluc。从这个分析中产生了三种有趣的 VH1 衍生物：化合物 56 和 80 仅显示出浓度-反应曲线的轻微左移（即，效力更高）与模板分子 rac-VH1/52 相比（图 4b,c），而化合物 33 则表现出大约 6 倍的配体效力提升（图 4d）以及对 GPR3 的选择性优于 β2AR（图 4e）。从结构上看，化合物 33 与已知的 GPR3 反激动剂 AF64394 的相似性很小（原子对 Tanimoto = 0.22；使用 chemminetools.ucr.edu 上实现的 PubChem 指纹的最大共同子结构 Tanimoto = 0.20 (28)），这突显了该化合物作为 GPR3 配体的新颖性。

图 4
图 4. VH1 类似物的体外测试。
(a) GPR3-HaloTag(618)/Nluc 在车辆对照、rac-VH1/52 和 49 种化学类似物作用下引起的 BRET 变化。
(b–d) 使用 GPR3-HaloTag(618)/Nluc 传感器获得的 VH1 类似物 80 (b)、56 (c) 和 33 (d) 的浓度反应曲线。
(e) 在 GPR3-HaloTag(618)/Nluc 和 β2AR-HaloTag(618)/Nluc 传感器下 33 的反应比较。
(f, g) 使用 GPR3-HaloTag(618)/Nluc 传感器获得的 rac-VH1/52 及其类似物 21、23、26、27、33 和 34–37 的浓度反应曲线。数据显示在稳定表达指定生物传感器的 HEK293A 细胞中进行的三次独立实验的平均值 ± SEM。

33 在 GPR3 构象生物传感器上的 EC50 值为 5 μM（95% CI：1–19 μM）。值得注意的是，33 在 GPR3 构象变化读数中的幅度减小（但在我们所有的独立实验中仍然可以稳定重复；图 S224），表明从 rac-VH1/52 到 33 的修饰导致反向激动剂效力的丧失，同时增强了配体亲和力。为了更深入地了解 rac-VH1/52 和 33 的结构-活性关系，我们进一步收集了该类似物系列其他衍生物的浓度-反应数据（图 4f,g）。我们的分析显示，羟基和醚基团以及对位氯取代基对 VH1 的作用不是必需的，因为 21 和 23 的效力与 rac-VH1/52 相似。此外，26 和 27 的 BRET 反应减弱表明 33 的反向激动剂活性丧失可能是由于中心杂环系统与“上部”芳香环之间的连接链缩短所致（图 4f）。然而，这种侧链截断的效果严格依赖于环丙基取代基，因为其他被截短的饱和 VH1 类似物（34–37）并未表现出 33 的低微摩尔效力（图 4g）。

为了提出 VH1 到 33 效力显著丧失的原因，我们计算预测了这两种分子在 GPR3 中的结合姿态（图 5a）。我们的对接分析表明，VH1 的对位取代苯环及其连接链向细胞外空间延伸，没有与受体发生接触。相比之下，33 的环丙基环仍埋藏在受体的跨膜核心中。此外，对 GPR3 配体的进一步能量最小化显示，化合物 33（而不是 VH1）可以采取一个能量上有利的结合姿态，更接近跨膜螺旋 2（图 S225）。值得注意的是，这些计算预测的 VH1 和 33 的姿态得到了 GPR3 突变体的实验数据支持，这些突变体表现出野生型类似的表面表达水平（4）。虽然在细胞外环 2 中插入庞大的色氨酸残基会使 rac-VH1/52 在 GPR3 生物传感器上的浓度-反应向右移动（图 5b），但 33 并没有受到这些修饰的影响（图 5c）。我们还用另一种在跨膜螺旋 3 中含有 T3.37A 突变的 GPR3 生物传感器测试了 33 的结合模型（参见补充信息中的方法和材料部分）。根据 Boltz-2 计算得到的 33 的另一种预测姿态（参见补充信息），这种突变应该会妨碍 33 与 GPR3 的结合。然而，我们使用野生型和突变型 GPR3 生物传感器的实验并未显示出这种效果（图 S226）。综合这些结果，支持图 5 中描绘的结合姿态，并表明 33 与 GPR3 的结合方式与 VH1 不同，这可能与 VH1 到 33 的反向激动剂效力下降的机制基础有关。

图 5
图 5. 提出的 VH1 和 33 的结合姿态。
(a, b) 基于 PDB 8X2K 的 VH1 (a) 和 33 (b) 在 GPR3 中的计算预测结合姿态。
(c, d) 使用野生型和突变型 GPR3 构象传感器获得的 rac-VH1/52 (c) 和 33 (d) 的浓度反应曲线。数据显示在瞬时转染 HEK293A 细胞中进行的三次独立实验的平均值 ± SEM。pEC50 值的统计差异使用额外平方和 F 检验进行测试（*p < 0.05）。

为了进一步阐明 33 的药理特性，我们评估了它在 GPR3 下游信号通路中的活性。当 33 应用于表达我们的 Gs 解离生物传感器 Gs-CASE 的 HEK293A 细胞时，观察到浓度和 GPR3 依赖性的 BRET 增加，EC50 值为 250 nM（95% CI：13 nM–3 μM）（图 6a,b）。这些数据确认 33 是 GPR3 的反向激动剂。我们还研究了 33 是否会阻断先前验证的 GPR3 配体——激动剂 DPI 和反向激动剂 AF64394——在 cAMP 检测中的活性（图 30）。有趣的是，33 对 AF64394 的作用没有影响（图 6c），这与最近关于 AF64394 非正交结合的实验结果一致（31），但抑制了 DPI 诱导的 cAMP 生成（图 6d）。这些数据支持了我们之前的观察，即 DPI 和 AF64394 与 GPR3 中的不同位点结合，并表明 33 与 DPI 竞争 GPR3 的结合位点。此外，我们还观察到在与 33 共孵育后，OEA 的效力降低，而 oleamide 的效力未受影响（图 S227）。OEA 和 oleamide 之间的差异可能反映了它们在 GPR3 结合口袋内的构象和/或位置灵活性差异。这种差异得到了在 GPR3 中对 oleamide 的 MD 模拟（1）以及在 GPR3 和 GPR6 中非常相似的口袋中油酸结合姿态的比较（2,32）的支持。

图 6
图 6. 化合物 33 的药理特性。
(a) 用于评估 GPR3 依赖性 Gs 活性的活细胞 Gs 异三聚体解离/重新结合的示意图。
(b) 使用共转染 GPR3 或空载体对照（pcDNA）的细胞中的 Gs 解离传感器获得的 VH1 类似物 80 (b)、56 (c) 和 33 (d) 的浓度反应曲线。
(c, d) 在共表达 GPR3 并预先用 30 μM 33 或车辆对照处理的细胞中，使用 cAMP 生物传感器获得的 AF64394 (c) 和 DPI (d) 的浓度反应曲线。
(e) 在共转染 GPR3、GPR6、GPR12 或空载体对照（pcDNA）的细胞中，使用 cAMP GloSensor 获得的 rac-VH1/52 及其类似物 21、23、26、27、33 和 34–37 的浓度反应曲线。数据显示在稳定表达指定蛋白的 HEK293A 细胞中进行的三次（c–e）或四次（b）独立实验的平均值 ± SEM。

接下来，我们使用经典的 cAMP GloSensor 技术评估了 33 的靶标选择性。将 33 添加到 constitutively Gs 结合的受体 GPR6 和 GPR12（GPR3 的最接近的系统发育亲属）中时，在 100 μM 33 下未观察到受体特异性的 cAMP 水平变化，而在表达 GPR3 的细胞中观察到浓度依赖性的 cAMP 下降，EC50 值为 2 μM（95% CI：0.2–17 μM；图 6e）。此外，我们测试了 33 对由类似于 GPR3 且在 Gs 或 Gi/o 蛋白上耦合的激动剂刺激的 GPCRs 介导的 cAMP 变化的作用。无论预先用 100 μM 还是 10 μM 33 孵育，都没有显著改变腺苷 A2B 受体（A2BR）、大麻素受体 1（CB1R）、S1P 受体 1（S1PR1）或 LPA 受体 1（LPAR1）介导的激动剂诱导的 cAMP 变化（图 S228）。总之，这些数据表明 33 在这七个受体中对 GPR3 具有选择性。

最后，我们使用 SwissADME Swiss Drug Design 在线工具评估了 33 的理化性质（图 6）。这项分析表明，33 的分子量为 277 g/mol，计算 Log-P 为 2.9，没有违反 Lipiniski 规则，没有 PAINS 警报，高类药性（在 1–10 的量表上为 2.4/高度可合成），为未来开发更强效和更有效的 33 类似物提供了充足的空间。在未来，33号化合物因其理想的化学特性，可能成为开发先进GPR3反向激动剂的有用基础结构，这些激动剂有助于治疗严重的、依赖于GPR3的疾病，如阿尔茨海默病。其较低的分子量、平衡的理化性质以及较高的合成可行性，为进一步衍生出更先进的GPR3反向激动剂提供了便利。我们的研究结果共同证明了基于结构的配体发现方法的有效性，其中包括易于应用的构象GPCR生物传感器。利用这些工具，可以在不依赖于下游信号通路的情况下检测受体活性的变化，从而减少错误筛选结果的风险。这一优势对于研究较少、信号通路机制不明的一些GPCR（例如孤儿GPCR）尤为重要，正如VH3/115的发现所展示的那样。VH3/115可以改变GPR3的构象，但不会影响依赖于GPR3的cAMP生成。这一发现表明，可能存在某种通过非Gs蛋白和非cAMP依赖的信号通路被VH3或GPR3自身稳定的无效构象，这些可能性需要进一步研究。