真菌对三联苯（p-Terphenyl）异戊烯基转移酶用于类黄酮及其他含邻二羟基苯基部分化合物的区域选择性C-异戊烯基化

《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：A Fungal p-Terphenyl Prenyltransferase for Regioselective C-Prenylation of Flavonoids and Other Compounds Bearing ortho-Dihydroxyphenyl Moieties

　　

真菌DMATS型异戊烯基转移酶（prenyltransferases, PTs）催化多种天然产物（natural products, NPs）的异戊烯基化，特别是吲哚衍生物，但也包括植物代谢产物如类黄酮。来自构巢曲霉（Aspergillus ustus）的异戊烯基转移酶UcdE先前被推测可催化对联三苯衍生物二羟基三联苯素（dihydroxyterphenyllin）进行邻位（ortho）异戊烯基化。利用重组UcdE进行的生化研究证实了这一功能，并证明了苯基邻位二羟基化在联三苯中的重要性。对各种类黄酮、羟基萘（hydroxynaphthalenes）和其他多酚的测试进一步提供了证据，表明邻二羟基苯基部分（ortho-dihydroxyphenyl moiety）是其被UcdE接受的先决条件。结构分析显示类黄酮发生了专一的C2′位异戊烯基化，这与大多数已知异戊烯基转移酶在C-6、C-8或C-3′位的异戊烯基化位置明显不同。UcdE的显著特性凸显了其作为选择性生物催化工具在异戊烯基转移酶中前所未有的特异性，拓展了用于制药和营养应用的生物活性化合物范围。

论文解读：真菌对三联苯异戊烯基转移酶的发现及其在区域选择性C-异戊烯基化中的应用

本研究聚焦于一种源自构巢曲霉（Aspergillus ustus）的新型DMATS型异戊烯基转移酶（Dimethylallyltryptophan Synthase-type prenyltransferases, DMATS-type PTs）UcdE，旨在深入探究其独特的底物识别机制与催化区域选择性。该研究针对当前天然产物（NPs）领域中预nylated化合物产量低、化学合成区域选择性差及C-异戊烯基化产率不足等瓶颈问题，通过系统的生化表征，揭示了UcdE作为一种高效生物催化剂在选择性修饰含邻二羟基苯基化合物方面的巨大潜力，相关成果发表于《Journal of Agricultural and Food Chemistry》。

在研究技术方法层面，研究人员首先通过RNA分离、cDNA合成及PCR扩增，从构巢曲霉中克隆了ucdE基因，并将其构建至pET28a(+)载体中，转化大肠杆菌BL21(DE3)实现重组蛋白的过表达。随后，利用镍亲和层析与钴琼脂糖树脂两步纯化法获得高纯度蛋白。体外酶活性测定采用标准反应体系，结合液相色谱-质谱联用技术（LC-MS）分析产物，并通过制备型高效液相色谱（preparative HPLC）分离纯化产物以供核磁共振（NMR）波谱分析，最终利用非线性回归分析计算米氏动力学参数。

研究结果部分，序列分析与重组UcdE的生产纯化表明，UcdE由1425 bp基因编码，与已知的FtmPT3具有58%的序列一致性，纯化后的重组蛋白分子量约为54.1 kDa。在底物特异性研究中，研究人员发现UcdE选择性接受邻二羟基化的联三苯类化合物。通过对二氢基三联苯素（1）的转化，鉴定出三种产物，其中新型双异戊烯基化产物usterphenyllin C（1c）经NMR证实为C-2和C-14位取代。相比之下，非邻二羟基化的atromentin（2）和terphenyllin（3）几乎不被转化，这确立了邻二羟基苯基部分为关键识别基团。

在类黄酮的异戊烯基化研究中，UcdE表现出严格的底物偏好性。仅含单羟基或间位羟基的类黄酮（如galangin、kaempferol、morin）转化极低，而含有3′,4′-二羟基（邻二羟基）结构的类黄酮（如quercetin 7、luteolin 8、fisetin 9、3′,4′-dihydroxyflavone 10）则被有效转化。NMR结构解析证实，所有被测试的类黄酮均发生了专一的C2′位异戊烯基化，这与已知的多数催化C-6或C-8位异戊烯基化的酶显著不同。此外，UcdE还能催化尿石素C（urolithin C, 11）和2,3-二羟基萘（2,3-DHN, 12）的C-10和C-1位异戊烯基化，进一步验证了其催化邻位二羟基苯环的普适性。

动力学参数测定结果显示，UcdE对其天然底物二氢基三联苯素（1）表现出最高的催化效率（k_cat/K_M= 5598 M^–1s^–1）。尽管其对类黄酮（如quercetin 7）的催化效率（1633 M^–1s^–1）低于天然底物，但仍显示出较高的亲和力。竞争性抑制实验表明，缺乏邻二羟基结构的类似物会竞争性抑制酶活。

综上所述，研究人员通过对UcdE的生化表征得出结论：UcdE是一种具有独特区域选择性的DMATS型异戊烯基转移酶，其核心特征在于能够识别底物中的邻二羟基苯基部分，并催化该基团邻位的C-异戊烯基化。这一特性使其在生物催化领域具有重要的应用价值，特别是为选择性修饰类黄酮等植物次生代谢产物、开发具有特定生物活性的新型药物或营养品先导化合物提供了强有力的分子工具。