带Cullin-2和不带Cullin-2的VHL-PROTAC复合体的界面结构

《Journal of the American Chemical Society》：Interface Architecture of a VHL-PROTAC Complex with and without Cullin-2

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蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）是一类双特异性分子，它们将目标蛋白与 E3 连接酶连接起来，导致目标蛋白被泛素化并随后被降解。它们的有效性取决于它们形成三元复合物的能力，而这受到蛋白质-蛋白质相互作用的影响。结合表面诱导解离（SID）的天然质谱技术是一种快速评估蛋白质结构（包括化学计量比和界面强度）的敏感方法。天然质谱技术还可以捕获气相中的多种构象状态，反映了多种蛋白质组装体的内在灵活性。这种解析结构异质性和瞬态亚群的能力提供了通过晶体学、冷冻电镜或其他集合平均分析方法无法轻易获得的信息。通过将天然质谱技术与表面诱导解离结合，可以探测带有或不带有支架蛋白 Cullin-2 的 PROTAC 介导的三元复合物的拓扑特征，特别是相对界面强度和亚复合物排列。PROTAC 介导的三元复合物会產生丰富的 SID 碎片。观察到缺乏 Cullin-2 的 PROTAC 组装复合物具有更强的构象灵活性，从而形成多种可访问的亚复合物拓扑结构。尽管 PROTACs 能够促进目标蛋白与 E3 连接酶之间的强非共价相互作用，但添加 Cullin-2 会降低 E3 连接酶复合物的构象灵活性。这导致碎片化程度显著降低，并为三元复合物的层次连接性提供了关键见解。

**引言**
靶向蛋白降解是一个迅速发展的领域，它依赖于使用小分子来诱导蛋白质之间的长时间接近，从而破坏目标蛋白。最常见的实现方法是通过分子粘合剂或蛋白水解靶向嵌合体（PROTACs）将 E3 泛素连接酶招募到目标蛋白上。PROTACs 是异源双功能分子，通过一个灵活的连接子将目标蛋白与 E3 泛素连接酶连接起来。由于与 E3 连接酶的强制接近，目标蛋白会被多泛素化标记并随后被 26S 蛋白酶体降解，释放出 PROTAC 以催化进一步的降解事件。PROTACs 作为治疗手段对于以前被认为不可药物化的目标蛋白具有吸引力，可以在密切相关的蛋白质异构体之间提供选择性，并且由于催化循环机制，可以在较低浓度下使用。然而，PROTAC 的发展受到几个缺点的阻碍，尤其是其较差的物理化学性质和不可预测的结构-活性关系。后者的挑战部分源于三元复合物的可塑性以及有限的结构性信息。为了探测这些相互作用，研究人员通常使用 AlphaLISA、表面等离子体共振和生物层干涉测量等技术。虽然这些方法对于探测结合动力学和接近程度很有价值，但它们往往缺乏关于完整异组装体的信息，并且可能受到荧光团方向不正确、通量低和高资源投入的影响。X 射线晶体学和冷冻电镜等技术可以提供更详细的结构信息，但由于构象灵活性和弱瞬态静电相互作用，将这些技术应用于 PROTAC 复合物一直具有挑战性，这阻碍了复合物分子进入重复晶格模式或明确密度图的能力。Rosetta 建模表明，PROTAC 复合物展现出比晶体结构中观察到的更多样的构象特征。每种方法都提供了独特且互补的信息，全面理解三元复合物的行为通常需要整合多种正交方法。

Beveridge 等人（18）和 Gross 及其同事（19）首次将天然质谱（nMS）和天然 MS/MS 用于 PROTAC 介导的复合物的结构分析（20-22），强调了其作为高度敏感技术的优势，因为它只需要几微升的微摩尔溶液。基于纳米电喷雾电离（24）的 nMS 对于表征蛋白质复合物特别有利，因为复合物可以直接从溶液状态引入仪器，在转移到气相的过程中动态捕获非共价相互作用和整体结构（18,19,21,25-28）。通过四极杆选择和随后的碎裂（29）和/或确定碰撞截面值（30），可以阐明结构特征。在这里，我们研究了结合表面诱导解离（SID）的 nMS 来表征 PROTAC 介导的复合物。一个典型的 PROTAC，MZ1，与目标蛋白溴结构域蛋白 4（BRD4）以及最终与支架蛋白 Cullin-2（Cul2）结合的 E3 连接酶结合。E3 连接酶由 von Hippel–Lindau（VHL, V）蛋白与 elongin-B（EloB, B）和 elongin-C（EloC, C）组成稳定复合物，这两种适配蛋白充当桥梁，将 V 与支架蛋白 Cul2 连接起来，形成 VCB-Cul2 复合物（31）。在 Cul2 的另一端，NEDD8 的结合促进了 RING-box 蛋白 1（Rbx1）的招募，后者又与 E2 泛素结合酶结合（32）。在这种结构中，V 作为底物识别亚基，定位目标蛋白以便被 E2-Rbx1 泛素化。

在大多数先前的研究中，研究人员通常使用各种结构和生物物理方法来研究三元复合物，通常侧重于最小的 PROTAC 介导的复合物以探测复合物内部的蛋白质-蛋白质相互作用。最近，人们有兴趣引入额外的成分，如支架蛋白 Cul2 及其相关蛋白质。Sternicki 等人和 Whitford 等人（本文）都最近证明了 nMS 可以表征含有 Cul2 的组装体（33,34）。在这项工作中，我们关注支架蛋白 Cul2 的存在与否如何影响复合物的形成、稳定性和解离行为，以确定当 Cul2 不在系统中时是否会出现任何生物学相关的信息（例如，不同的复合物动态）。特别是，我们通过应用 SID 来探测 Cul2 含有和缺少 Cul2 的组装体中复合物结构和亚单位连接的细微变化，建立在之前的工作基础上（19,35）。我们评估了 Cul2 支架如何调节三元复合物的行为，以及其缺失是否掩盖了机制上相关的特征。

**结果与讨论**
**通过气体和表面碰撞的碎裂差异**
PROTAC MZ1 通过将 BRD4 的溴结构域 2（BRD4BD2）通过非共价相互作用网络与 VHL 连接，从而在 BRD4 和 VCB 复合物之间形成三元复合物（10,36）。当 MZ1 添加到含有 BRD4BD2 和 VCB 复合物的溶液中时，BRD4BD2 蛋白和 VCB 蛋白复合物会组装成一个可通过 nMS 观察到的三元复合物（18,19）。正如 Gross 及其同事所展示的（并且我们的工作也证实了这一点），没有 MZ1 的加入，不会形成 BRD4BD2-VCB 复合物（图 S1）。在我们的实验中，BRD4BD2-MZ1-VCB 复合物是在几乎生理条件的离子强度下制备的，这减少了整体电荷（160 mM 醋酸铵和 40 mM 三乙基铵）（图 1A，图 S2）（37）。为了探究其结构组织，我们关注较低的电荷状态，因为这些状态倾向于促进解离而不是在气相中重构蛋白质复合物，并产生更好反映溶液相拓扑/天然结构的碎片（37-39）。对于解离研究，我们分离了三元复合物的 10+ 电荷状态，因为较低的电荷状态通常产生更稳定的类天然结构和碎片（37,38）（图 S2），并对其进行受控碎裂，从而能够绘制出复合物的解离过程。高电荷状态的离子通常倾向于 unfold/restructure 并产生非天然的碎片（40），这掩盖了连接性信息。

**图 1**
图 1. 在有和没有 Cul2 的情况下，CID 和 SID 碎裂的比较。(A) 1:2:1 BRD4BD2-MZ1-VCB 的零电荷质谱。(B) 10+ BRD4BD2-MZ1-VCB 的 CID 零电荷质谱（850 eV)。(C) 10+ BRD4BD2-MZ1-VCB 的 SID 零电荷质谱（850 eV)。(D) 1:2:1:1 BRD4BD2-MZ1-VCB-Cul2-NEDD8-RBX1 的零电荷质谱。(E) 19+ BRD4BD2-MZ1-VCB-Cul2-NEDD8-RBX1 的 CID 零电荷质谱（817 eV）。(F) 19+ BRD4BD2-MZ1-VCB-Cul2-NEDD8-RBX1 的 SID 零电荷质谱（556 eV）。

**碰撞诱导解离（CID）** 涉及与惰性气体分子的多次能量碰撞，逐步沉积能量，部分展开/重构并沿着最低能量路径使蛋白质组装体碎裂。对于蛋白质复合物，这通常导致一个高电荷的延长单体被弹出，留下一个互补的 (n–1) 单体（23）。在低电荷状态下，CID 可以导致弱结合的亚单位解离，产生更接近溶液相连接性的碎片。随着前体离子获得更高的电荷，会发生 unfold/restructure 和高电荷延长单体的弹出，导致非天然碎片（40）。这种电荷依赖性行为限制了 CID 明确定义复合物亚单位拓扑的能力。

**通过 CID 的 BRD4BD2-MZ1-VCB 复合物的碎裂** 导致 MZ1 被弹出，同时带有一个电荷（图 S3）（19），留下一个互补的 BRD4BD2-VCB 复合物（图 1B），正如 Gross 及其同事之前指出的那样。在 CID 能量超过约 600 eV 时观察到 MZ1 的弹出（图 S4）。在非电荷减少条件下（200 mM 醋酸铵），12–15+ 的电荷状态会产生额外的 CID （41）碎片，除了 MZ1 的弹出（图 S5）。

**表面诱导解离（SID）** 中，离子与气体分子发生多次碰撞，将碰撞能量逐步传递到蛋白质复合物中，导致重构和碎裂。而在 SID 中，离子是在一个高能量步骤中被引导到惰性表面上。这种快速的能量转移（在实验室框架中约为 102–103 eV）通常会导致复合物分离，切割较弱的界面，并提供有价值的前体结构信息（42），例如复合物内亚单位之间的亚结构连接性和相对界面强度（43）。与其他激活方法（如紫外光解离（UVPD）不同，UVPD 通过探测完整组装体内的局部结构特征（如二级结构元素和配体结合环境）提供互补的信息（44），SID 通过揭示亚单位是如何连接和稳定的来独特地报告四级结构（46）。较弱的界面在较低能量下就会断裂，而较强的界面则需要更多的能量才能解离。通过 SID 碎裂可以推断出各种蛋白质-蛋白质相互作用。

在 85 V 的碰撞电位下（10+ 的情况为 850 eV），BRD4BD2-MZ1-VCB 的碎裂揭示了组装体内多种蛋白质-蛋白质接触的多样性（图 1C，图 S6）。在观察到的主要碎片中包括 CB（约 23 kDa）及其互补片段 BRD4BD2-MZ1-V（约 35 kDa），表明 V 和 CB 之间的界面相对较弱。在更高的 SID 能量下，BRD4BD2-V 和 CB 片段的增加表明了这一点（图 2A）。它们相对强度的上升可能反映了二级碎裂（45），这有利于 BRD4BD2-V 和 CB 作为离散亚组装体的保留，因为它们具有更强的内部界面。这些模式表明，MZ1 不仅促进了 BRD4BD2 和 V 之间的强非共价相互作用，还使 CB 之间的关联比与 V 更稳定，这是在复合物结构中的微妙但有趣的现象。这强调了一个更广泛的原则：PROTACs 可能不仅仅作为被动分子桥梁，而是作为调节蛋白质-蛋白质相互作用的架构调节器（46）。这种诱导的接触可以稳定三元复合物，增强连接酶和底物之间的协同性，并最终决定靶向降解的效率（47）。

**图 2**
(A) 10+ BRD4BD2-MZ1-VCB 的 ERMS 图。为了清晰起见，一些片段的不透明度较高。有关所有解离产品的更多数据，请参见图 S11。(B) 描述 BRD4BD2-MZ1-VCB 的 SID 解离路径的示意图。(C) 更高质量、更高电荷的 19+ BRD4BD2-MZ1-VCB-Cul2-NEDD8-RBX1 的 ERMS 图。碰撞能量已经校正了 Cul2、NEDD8 和 RBX1 的质量增加。(D) 描述通过 SID 观察到的 BRD4BD2-MZ1-VCB-Cul2-NEDD8-RBX1 的解离路径的示意图。

**独特的 SID 产物**
当 MZ1-V 被弹出时，同时伴随着一个（假设）互补的 BRD4BD2-CB 片段（约 38 kDa）（图 1C）。这一结果表明，在没有 Cul2 的情况下，CB 亚复合物可以通过非共价接触直接与 BRD4BD2 相连，这是通过晶体学未观察到的关系。BRD4BD2 末端区域的灵活性（13）可能允许在溶液中发生这种重排，即使在 V 失去后仍保持 BRD4BD2-CB 的相互作用。可能存在溶液相重排，而 BRD4BD2 和 CB 之间的相互作用得以维持。虽然在气相中的蛋白质离子有时会塌陷成非天然构象（48），但我们使用低电压梯度（49）来帮助保持结构，使其尽可能接近溶液相形式。尽管如此，nMS 本身无法完全排除气体相伪象的可能性，区分相互作用和潜在的重排仍然是这种方法的固有限制；与 Cul2 复合物的比较（下文）有助于解决这个问题。额外的正交结构探针，如蛋白质的快速光化学氧化（FPOP）（50）或相关的足迹印迹策略（51），可以在未来的研究中提供互补的验证。Cul2“锁定”多组分组装，简化了分解产物。虽然这些数据和之前的报告重点关注最小E3连接酶复合体与其靶标之间的界面强度，但V实际上是属于cullin-RING连接酶家族的一个更大多蛋白复合体的一部分。这些复合体不仅包含E3连接酶及其相应的适配器蛋白，还通过适配器蛋白与六个cullin支架之一相连，这些支架通过neddylation机制固定E2连接酶。为了更好地研究界面强度随复合体增大而变化的情况，我们将这些蛋白质与 Neddylation 形式的 Cul2 复合物（与 RBX1 结合）进行了配对（52）。我们将 BRD4BD2-MZ1-VCB 与 Neddylation 的 Cul2-RBX1 结合，并使用 nMS 和 nMS-SID 分析了由此产生的组装体。质谱图显示了两种主要物种：原始的 BRD4BD2-MZ1-VCB 三元复合体以及 Cul2 结合的 BRD4BD2-MZ1-VCB-Cul2-RBX1 组装体（图 1D）。后者的电荷减少形式分别呈现为 18+、19+ 和 20+（图 S7），其中 19+ 电荷形式最为丰富，并被选为碎片化分析对象，因为 18+ 形式的样品量不足以充分采样分解产物。为了确保含 Cul2 和不含 Cul2 的复合体之间的公平比较，我们应用了之前描述的质量校正碰撞能量（53）来补偿分子质量的差异。当进行 CID 时，连接器蛋白的弹射仍然是主要产物，这与 BRD4BD2-MZ1-VCB 经 CID 时的情况相同（图 1E，图 S8）。当 MZ1 通过 CID 从复合体中被弹射出去时，会留下一个互补的 BRD4BD2-VCB-Cul2-RBX1 子复合体（图 1E，图 S8）。当我们对含 Cul2 的三元复合体应用 SID 时，其碎片化模式明显比不含 Cul2 的三元复合体简单（图 1F，图 S9）。在 85 V 的碰撞势下（相当于 19+ 电荷形式的 555 eV），只检测到三种物种：完整的前体、缺少 MZ1 的复合体（类似 PROTAC 弹射的 CID）以及同时缺少 MZ1 和 BRD4BD2 的片段。这一系列事件表明 MZ1 是 Cul2 结合组装中最薄弱的环节，因为其缺失是碎片中最常见的。一旦 MZ1 被弹射，下一个最脆弱的连接就是 BRD4BD2 与剩余复合体之间的界面。它的缺失是唯一不断观察到的产物。

能量分辨质谱（ERMS）图谱追踪了碎片丰度随碰撞能量增加的变化，提供了一种评估蛋白质-蛋白质界面相对强度和复合体整体稳定性的方法（53）。对于 BRD4BD2-MZ1-VCB，低 SID 能量下检测到的主要产物是 BRD4BD2-VCB、BRD4BD2-MZ1-V 和 CB（如前所述，图 1C 和图 2A）。随着碰撞能量的增加，BRD4BD2-MZ1-V 及其互补片段 CB 的丰度也相应增加。在较高的 SID 能量下，BRD4BD2-V、CB 和 V 的丰度更高。一种解释是，尽管 MZ1 在 BRD4BD2 和 VCB 之间起桥梁作用，但它与 BRD4BD2 和 V 的单独结合相对较弱。这表明在三元复合体形成后，MZ1 已不再必要。一旦 BRD4BD2-V 的相互作用被建立，其稳定性就超过了 VCB 内部的任何其他非共价相互作用。这解释了 SID 后检测到的完整 VCB 浓度较低的原因。MZ1 的弹射和 CB 的丢失是同时发生的。CB 似乎既从前体的三元复合体中分离，也从主要的 MZ1 弹射片段中分离，而 BRD4BD2-V 则通过多种碎片化途径释放（图 2B）。只有在高 SID 能量下才能从三元复合体中检测到单独的蛋白质（BRD4BD2、V、C、B），这表明解离需要破坏多个稳定界面。ERMS 图谱显示，含 Cul2 和不含 Cul2 的三元复合体在碎片化模式上有明显差异，表明 Cul2 的结合改变了连接性。含 Cul2 时，只有两种碎片类型出现：MZ1 的弹射，随后是 BRD4BD2 的弹射（图 2C）。在低 SID 能量下，两种情况下 MZ1 的弹射都是最丰富的碎片。当 Cul2 结合时，MZ1-蛋白质接触比复合体内的蛋白质-蛋白质接触更不稳定。这表明 MZ1 的主要作用是启动复合体的形成，从而促进泛素化。我们推测，通过 MZ1 连接促进的蛋白质-蛋白质界面在缺乏 MZ1 的情况下仍然足够稳定，因为 SID 和 CID 可以导致 MZ1 的丢失而不会使目标蛋白质从 E3 中解离。之前的研究已经表明，SID 片段与蛋白质复合体中的界面面积相关（54）。其他研究还显示，即使目标蛋白质亲和力较弱，PROTAC 也能促成热力学稳定的复合体的形成（PROTAC 效力的协同模型，报告了 BRD4BD2 和 VHL 之间的广泛蛋白质-蛋白质相互作用，由 MZ1 介导（55）。Cul2 的存在不会显著改变前体的整体稳定性，通过测量将前体转化为片段所需的质谱校正碰撞能量来评估（图 S10）。在没有 Cul2 的情况下，需要约 540 eV 的能量来将前体的 50% 碎裂，而在 Cul2 结合时则需要约 550 eV。这种相似性表明，主要由 MZ1 弹射主导的初始衰变途径在 Cul2 的存在下基本不受影响（被破坏的界面大致相同）。然而，检查替代解离途径（图 2D）显示，一旦 MZ1 被移除，剩余的复合体在 Cul2 存在时对进一步碎片化更为抵抗。这表明，尽管 Cul2 不影响通过 MZ1 介导的 BRD4BD2-V 相互作用的稳定性，但它确实增强了 VCB 核心。在生理条件下，BRD4BD2 和 MZ1 通常不会自然地与 Cul2 相互作用。结构研究表明，Cul2 通过在 VC 接口处的特定疏水性和电静力作用与 VCB 结合（56）。这些高亲和力相互作用增强了泛素化过程的稳定性。相比之下，如 BRD4BD2-MZ1-VCB 这样的 PROTAC 介导的三元复合体在 Cul2 结合前的动态行为比天然的蛋白质-蛋白质组装（如 Cul2-VCB）更为活跃（57）。总体而言，含 Cul2 和不含 Cul2 的 ERMS 数据提供了关于三元复合体结构和稳定性的互补视角。不含 Cul2 时的 ERMS 分析突出了复合体内的内在非共价相互作用和动态行为，表明一旦 MZ1 启动了复合体的形成，BRD4BD2-V 接口成为主要的稳定作用。相反，含 Cul2 的数据强调了 cullin 支架的招募如何强化 VCB 核心。因此，这两组数据共同描绘了一个连贯的机制图景：像 MZ1 这样的 PROTAC 促进 BRD4BD2-VCB 的组装，而 Cul2 的参与则通过其与 VCB 的高亲和力相互作用固定了结构。PROTAC 诱导的非共价相互作用与 cullin 支架之间的相互作用共同决定了靶向降解的效率。

本研究揭示了在没有或含有 Cul2 标架蛋白及其相关蛋白的情况下，MZ1 PROTAC 介导的复合体如何组织和稳定蛋白质-蛋白质界面。为了解决这些问题，我们使用了质谱（nMS）和表面诱导解离（SID）来探究结构组织和界面稳定性。对于 BRD4BD2-MZ1-VCB，CID 一致地导致了 MZ1 的弹射（如先前报道的）。SID 还揭示了更广泛的解离途径，包括 CID 未观察到的独特片段。这些片段直接反映了当 Cul2 缺失时三元复合体构象灵活性的增加，从而提供了多种可访问的解离途径。碰撞能量的变化表明，虽然 MZ1 对初始三元复合体的形成至关重要，但 BRD4BD2-V 接口在组装后成为主要的稳定作用。将 Neddylation 的 Cul2 融入复合体改变了碎片化行为，减少了 SID 产物的多样性，并凸显了一种顺序解离途径：首先是 MZ1 的弹射，然后是 BRD4 的释放，同时又没有显著影响整体复合体的稳定性。强效的 Cul2-VCB 接口在所有研究的能量范围内都保持稳定，这与支撑 E3 连接酶功能的高亲和力天然接触一致。无论 Cul2 的存在与否，研究结果都表明，通常在体外无 Cul2 的条件下研究的 PROTAC 介导的组装表现出构象灵活性。与单点生化测定或静态固相结构不同，nMS 可以直接捕捉到这种异质性，揭示了其他方法可能会平均或忽略的群体。这些信息对于药物设计尤为重要，因为最大化协同作用并定向三元复合体以提供对赖氨酸残基的催化访问对于高效的泛素转移至关重要。展望未来，将 nMS 与离子迁移分离技术结合使用，为分层分析这些组装体的结构异质性提供了有前景的方法，从而提供了关于 PROTAC 如何稳定或偏向特定构象的额外见解。数据表明，MZ1 可以在不破坏剩余的连接酶-底物复合体的情况下解离，这一特性可能并不适用于所有 PROTAC，但对于催化性 PROTAC 的周转可能是有利的。总体而言，nMS-SID 结合方法为剖析 PROTAC 介导的复合体的结构、稳定性层次和动态行为提供了强大的手段，提供了可用于合理设计下一代 PROTAC 的机制见解，这些 PROTAC 具有优化的稳定性和功能特性。这些结果和这种方法也为未来研究提供了基础，探讨连接子化学、结合亲和力和 BRD4 靶向配体的变化如何影响复合体的形成、稳定性和解离途径。将 cullin 蛋白纳入 nMS 研究的便利性，以及 cullin 提供的支架作用，都支持将 nMS 包含在 PROTAC 评估工具箱中。