子宫内膜异位症对血清25-羟基维生素D水平的影响：来自孟德尔随机化研究的证据

《Medical Care》：Causal effects of endometriosis on serum 25-hydroxyvitamin D: Evidence from Mendelian randomization study

　　**摘要**
此前已有研究探讨了子宫内膜异位症与血清25-羟基维生素D之间可能存在的双向因果关系。然而，由于观察性研究的特性，研究结果可能会受到混杂因素和逆向因果关系的影响。孟德尔随机化（Mendelian Randomization, MR）通过提供未受混杂影响的因果效应估计值，规避了观察性研究的局限性。我们采用双向MR分析方法来确定血清25-羟基维生素D是否对子宫内膜异位症具有因果作用，反之亦然。此外，我们还通过异质性和敏感性分析探讨了效应估计值的异质性和多效性。同样，我们也通过反向MR分析了子宫内膜异位症与25-羟基维生素D之间的因果相关性。在正向MR分析中，我们选择了95个单核苷酸多态性（SNPs）作为工具变量（Instrumental Variables, IVs），以研究25-羟基维生素D对子宫内膜异位症的潜在因果影响；而在反向MR分析中，我们选择了9个SNPs来研究子宫内膜异位症对血清25-羟基维生素D的因果影响。研究发现，子宫内膜异位症可能导致血清25-羟基维生素D水平升高（β：0.010，95%置信区间：0.002–0.02，P=0.016）。我们的数据表明，血清25-羟基维生素D水平可能是子宫内膜异位症的结果而非其致病风险因素，其在该疾病发展中的潜在作用值得进一步研究。

**1. 引言**
子宫内膜异位症（Endometriosis, EMs）是一种以雌激素引起的慢性炎症反应为特征的临床疾病，主要影响盆腔组织，包括卵巢。[1] 这是一种常见的女性不孕症原因。[2] 全球范围内，5%至10%的育龄女性患有子宫内膜异位症。[3] 目前的药物和手术治疗方法效果有限。[4,5] 维生素D是一种脂溶性维生素，25-羟基维生素D是其主要的循环形式。[6] 它可能在生殖健康中发挥作用，包括反复流产和痛经。[7-9] 一项前瞻性队列研究表明，较高的血清25-羟基维生素D水平和较高的乳制品摄入量与较低的子宫内膜异位症风险相关。[10,11] 青少年时期食用冰淇淋和酸奶可能降低日后患子宫内膜异位症的风险。[12] 相反，一项病例对照研究则表明，牛奶摄入量与子宫内膜异位症无显著关联。[13] 如上所述，关于25-羟基维生素D与子宫内膜异位症相关性的研究结果存在矛盾。因此，需要进一步的研究。此外，观察性研究无法确定25-羟基维生素D在子宫内膜异位症发生和发展中的真正作用机制。这些研究的潜在局限性包括逆向因果关系和混杂因素，这些因素可能掩盖了潜在的因果关系。发现决定血清25-羟基维生素D水平的遗传变异体有助于更准确地评估两者之间的关系，并减少混杂带来的偏差。在过去十年中，全基因组关联研究（Genome-Wide Association Studies, GWAS）成为识别与某些疾病易感性相关的数百万个SNPs的强大工具。队列或病例对照研究设计常用于GWAS中评估复杂特征，研究结果通常发表在开放获取的数据库中，例如综合流行病学单元GWAS数据库或GWAS目录。孟德尔随机化（MR）是一种新的统计策略，它利用单核苷酸多态性（SNPs）作为工具变量来识别暴露与结果之间的潜在因果关系。[14-16] 本研究利用MR方法探讨了25-羟基维生素D与子宫内膜异位症之间的因果关系。

**2. 材料与方法**
2.1. 伦理批准
本研究分析了来自全基因组关联研究（GWAS）的公开可用的、去标识化的汇总级数据，因此无需单独的伦理批准。原始的GWAS研究已获得了各自机构审查委员会（IRBs）的伦理批准，并获得了所有参与者的知情同意。
2.2. 孟德尔随机化
MR是确定观察性数据中因果关系的有效工具。[18] 与传统观察性研究设计相比，MR可以避免混杂效应或逆向因果关系的问题，从而有助于了解和预防可改变因素对人类健康的不良影响。[17,19,20] 随着GWAS样本量的不断增加，近年来已发现了与25-羟基维生素D和子宫内膜异位症相关的遗传变异体。[21] 我们尚未发现任何使用MR来探讨25-羟基维生素D与子宫内膜异位症之间潜在因果关系的研究。在本研究中，我们进行了首次MR分析，以确定遗传上的25-羟基维生素D是否对子宫内膜异位症的风险具有因果影响；在第二项MR分析中，我们进一步研究了子宫内膜异位症是否对血清25-羟基维生素D具有同样的因果影响。
2.3. GWAS数据来源
本研究依赖GWAS数据。为了进行MR分析，我们选择了用于血清25-羟基维生素D（ebi-a-GCST90000618；n=4,96,946）和子宫内膜异位症（finn-b-N14_ENDOMETRIOSIS；n=8,288）的工具变量（IVs）。随后，我们仅选择了欧洲血统个体的25-羟基维生素D和子宫内膜异位症研究中的SNPs。我们优先选择样本量较大的数据源，并且仅包括女性个体。值得注意的是，目前尚未进行仅针对女性的GWAS研究。
2.4. 遗传变量
我们采用了一系列质量控制措施来选择合适的IVs。具体而言，在从GWAS中识别SNPs后，使用聚类函数确保它们的独立性。为了确定R2值，我们使用了连续性特征的标准公式：R2 = 2 × EAF × (1 ? EAF) × β2。为满足MR的第一个假设，我们通过F统计量的期望值来评估这95个选定的SNPs在解释25-羟基维生素D方面的总体有效性。[23,24] 同样，我们也选择了9个SNPs作为反向MR的IVs。月经周期长度、体重指数（BMI）和体重是可能与25-羟基维生素D和子宫内膜异位症相关的混杂因素。[25] 为了满足MR的第二个假设，我们使用PhenoScannerV2数据库排除了那些具有R2 > 0.80的IVs，这些IVs包含了与子宫内膜异位症相关的特征。我们还特别检查了BMI、吸烟、饮酒和日光暴露等潜在混杂因素的关联。接下来，我们通过排除回文SNPs来协调25-羟基维生素D和子宫内膜异位症的数据。回文SNP是指在双螺旋结构内其等位基因配对的SNP；等位基因频率在0.01到0.30之间的被称为中等频率等位基因。
2.5. 因果效应估计
我们创建了一个SNP列表，并使用逆方差加权（IVW）方法进行了MR分析。该方法将单个SNP视为真实的自然实验，计算Wald比率，然后通过IVW荟萃分析方法整合结果。由此方法得到的斜率参数可能表明暴露对结果的因果影响。此外，我们还计算了效应估计值的比值比（OR）和95%置信区间（CIs），以获得最精确的结果。我们还使用了多种方法进行MR分析，以增强结论的可靠性，如加权中位数（WM）、MR-Egger、简单模式和加权模式方法。我们通过“留一法”敏感性分析和MR-PRESSO分析来评估结果的稳健性。[18,28,29]Q统计量和I2值分析有助于评估IVs的多效性。[30]
2.6. 统计分析
我们使用R统计软件（版本4.2.2）中的“devtools”、“MRCIEU/TwoSampleMR”、“MR-PRESSO”和“LDlinkR”函数获得了MR估计值。P值<0.05表示暴露与结果之间存在因果关系。图1显示了双样本孟德尔随机化（2SMR）分析的流程图。

**3. 结果**
3.1. 血清25-羟基维生素D对子宫内膜异位症的影响
在首次MR分析中，我们使用了95个SNPs作为IVs，估计了25-羟基维生素D与子宫内膜异位症之间的因果关系。表S1（补充数字内容）列出了这95个SNP的相关信息。这95个SNP的累积F统计量为36.87，表明整个SNP集合满足了MR的高相关性假设。表1和图2展示了IVW（OR：1.040，95% CI：0.890–1.230，P=0.606）、MR-Egger（OR：1.190，95% CI：0.930–1.520，P=0.171）、加权中位数（OR：1.090，95% CI：0.860–1.390，P=0.457）、简单模式（OR：1.510，95% CI：0.990–2.310，P=0.058）和加权模式（OR：1.180，95% CI：0.970–1.440，P=0.105）方法的结果。IVW方法的结果并未显示25-羟基维生素D对子宫内膜异位症的因果影响。MR-Egger、加权中位数和简单模式的结果一致。
3.2. 子宫内膜异位症对血清25-羟基维生素D的影响
在第二次MR分析中，我们选择了9个SNPs进行反向MR分析，以研究子宫内膜异位症是否对25-羟基维生素D水平具有因果影响。在PhenoScanner搜索中，未发现任何与25-羟基维生素D相关的SNPs。表S2（补充数字内容）展示了与子宫内膜异位症相关的SNPs及其与25-羟基维生素D的关联信息。这9个选定SNP的累积F统计量为53.60，表明它们适合作为确定因果关系的代理指标。虽然IVW方法表明子宫内膜异位症可能对血清25-羟基维生素D具有潜在的因果作用（β：0.010，95% CI：0.002–0.020，P=0.016；表2），但更稳健的方法如MR-Egger（β：0.030，95% CI：?0.0803至0.070，P=0.093）、加权中位数（β：0.010，95% CI：?0.004至0.020，P=0.147）、简单模式（β：0.010，95% CI：?0.010至0.040，P=0.392）和加权模式（β：0.010，95% CI：?0.010至0.040，P=0.368）并未获得显著结果（表2和图4），因此这一发现应谨慎解读。如图5B的散点图和方法比较（图4）所示，显著效果主要由IVW方法得出，而MR-Egger和加权中位数的估计结果与无效应结果一致，表明这一发现可能受到潜在多效性的影响。暴露/结果 单核苷酸多态性（Nsnp） 方法 β（95%置信区间） 标准误差（SE） P值 多效性 异质性 R2 F值 MR-Egger回归 Cochran Q I2 P值 Egger截距 标准误差（SE） P值 子宫内膜异位症/血清25-羟基维生素D水平 9 IVW 0.010（0.002–0.020） 0.004 0.016 ?0.003 0.003 0.246 6.120 0.340 0.630 0.001 53.600 MR Egger 0.030（?0.0003至0.070） 0.020 0.093 加权中位数 0.010（?0.004至0.020） 0.006 0.147 简单模式 0.010（?0.010至0.040） 0.013 0.392 加权模式 0.010（?0.010至0.037） 0.010 0.368 显著效应由IVW驱动，不同方法的统计数据存在差异。CI=置信区间，I2=异质性指数，IVW=逆方差加权，MR=孟德尔随机化，Nsnp=单核苷酸多态性数量，SE=标准误差。图4：使用不同方法对子宫内膜异位症与血清25-羟基维生素D之间关联的孟德尔随机化分析。CI=置信区间，IVW=逆方差加权，MR=孟德尔随机化，SNP=单核苷酸多态性。图5：子宫内膜异位症对血清25-羟基维生素D水平的影响。(A)留一法图。(B)散点图。(C)森林图。(D)漏斗图。MR=孟德尔随机化，SE=标准误差，SNP=单核苷酸多态性。MR-Egger回归未检测到多效性效应（截距=?0.003，SE=0.003，P=0.246；图5B）。同样，Q统计量和I2值也未发现异质性（Q=6.120，I2=0.340，P=0.630）。“留一法”敏感性分析的图表表明，遗传预测的子宫内膜异位症与血清25-羟基维生素D之间的因果关联并非由任何单一SNP显著驱动（图5A）。散点图显示了使用多种MR技术和敏感性分析的子宫内膜异位症SNP与25-羟基维生素D SNP之间的关系（图5B）。森林图基于IVW方法表明，9个SNP显示遗传模拟的子宫内膜异位症与25-羟基维生素D水平之间存在因果关系（P<0.05，图5C）。总之，我们的反向2SMR分析提供了可能的证据，但证据并不稳健，表明子宫内膜异位症可能对血清25-羟基维生素D水平有潜在的因果影响。

4. 讨论
子宫内膜异位症是女性常见的临床妇科疾病。在本研究中，我们使用了比传统方法更强大的遗传工具进行了系统性的2SMR分析，以确定子宫内膜异位症与血清25-羟基维生素D之间的任何关联。此外，我们的双向MR分析未检测到25-羟基维生素D对子宫内膜异位症发展的因果影响；然而，我们发现了子宫内膜异位症可能与略微升高的25-羟基维生素D水平相关的提示性证据。

4.1. 血清25-羟基维生素D对子宫内膜异位症的因果影响
多项观察性研究表明，25-羟基维生素D与子宫内膜异位症的发展有关。根据一项前瞻性队列研究，较高的25-羟基维生素D水平与较低的子宫内膜异位症风险相关[10]。另一项前瞻性队列研究指出，青少年时期摄入乳制品（尤其是酸奶和冰淇淋）可能是降低子宫内膜异位症风险的方法[12]。此外，一项系统性文献综述发现，维生素D的饮食摄入量和血清25-羟基维生素D浓度可能会影响子宫内膜异位症的风险[31]。然而，这些观察性研究可能受到潜在限制（例如，反向因果关系和混杂因素）的影响，从而掩盖了真实的因果关系。在我们的研究中，前向MR分析的结果与早期观察性研究的结果不一致。我们未检测到血清25-羟基维生素D对子宫内膜异位症的任何因果影响。我们的MR分析有助于澄清先前观察性研究中提出的关系，并未发现支持血清25-羟基维生素D对子宫内膜异位症有因果效应的证据。观察性和MR研究结果之间的差异可以归因于后者相对于前者的内在优势，以及观察性研究中的方法学缺陷。

4.2. 子宫内膜异位症对血清25-羟基维生素D的因果影响
Somigliana等人进行的临床研究表明，子宫内膜异位症与血清25-羟基维生素D水平升高有关[32]。另一项针对子宫内膜异位症患者的临床研究发现，他们的尿液中维生素D结合蛋白（VDBP）水平较高[33]。然而，根据一项体外研究，重度子宫内膜异位症女性的血液25-羟基维生素D水平明显低于中度子宫内膜异位症患者[34]。尽管如此，子宫内膜异位症是否导致血清25-羟基维生素D水平升高仍需进一步探讨。最近，Pan D及其同事在《Reproductive Sciences》上发表的一项双向MR研究调查了血清25-羟基维生素D水平与子宫内膜异位症之间的因果关系。他们的分析表明，维生素D状态与子宫内膜异位症风险之间可能存在双向关联[35]。虽然他们的发现为维生素D代谢与子宫内膜异位症之间的相互作用提供了重要见解，但我们的研究在几个方面有所不同。首先，我们使用了包含更大样本量的血清25-羟基维生素D的GWAS数据集，这可能提高了MR分析的统计功效和稳健性。其次，虽然两项研究都采用了双向MR方法，但我们的分析进一步通过额外的敏感性分析评估了子宫内膜异位症对循环维生素D水平的潜在因果影响。因此，我们的结果为子宫内膜异位症与维生素D代谢之间的相互作用提供了补充证据。我们的反向MR研究提供了子宫内膜异位症对血清25-羟基维生素D可能有因果效应的提示性证据。如果存在因果效应，这种效应可能很小，并可能反映了疾病的炎症状态。这与临床试验一致，即人类循环子宫内膜可能是能够合成维生素D的体外部位之一[8]。子宫内膜异位症对25-羟基维生素D的潜在影响可能与炎症有关，因为子宫内膜异位症是一种炎症性疾病，巨噬细胞在其中起作用[36]。例如，活化的巨噬细胞可能产生25-羟基维生素D并进入血液循环[37]。先前的一项MR研究表明，高水平的巨噬细胞集落刺激因子（MCSF）与子宫内膜异位症的风险增加相关[38]。然而，这种机制仅是推测性的，应作为假设提出。我们的MR分析基于PhenoScannerV2数据库，因此在显著减少混杂偏差方面优于现有的观察性研究。

4.3. 异质性和多效性
此外，还进行了几项异质性和多效性分析以研究潜在的多效性。这些分析显示前向MR估计中没有显著的异质性或多效性（例如，Q=113.77，I2=0.171，P=0.081；MR-Egger截距=?0.0051，P=0.171）。对于反向MR，未检测到异质性（Q=6.120，I2=0.340，P=0.630），MR-Egger回归也未显示方向性的多效性（截距=?0.003，P=0.246）。反向MR的结果在不同方法之间存在矛盾，只有IVW方法是显著的，而更稳健的方法（MR-Egger和加权中位数）则不显著。这意味着因果效应的证据是提示性的，但并非决定性的，可能是由于多效性或其他偏差所致，需要在未来研究中进行谨慎解释和复制。

4.4. 含义
我们的双向MR分析未显示25-羟基维生素D对子宫内膜异位症的因果影响，但提供了相反方向的提示性证据。这些发现表明，血清25-羟基维生素D水平可能是子宫内膜异位症的结果，而不是因果风险因素。这些结果可能对公共卫生具有重要意义，因为它们可以作为进一步研究子宫内膜异位症和血清25-羟基维生素D的基础。此外，它们提供了关于子宫内膜异位症病因和血清25-羟基维生素D变化之间差异的新信息。

4.5. 强点和局限性
据我们所知，本研究使用更新的GWAS数据集提供了关于血清25-羟基维生素D与子宫内膜异位症关系的额外MR证据。与观察性研究相比，MR中使用的庞大GWAS摘要数据集显著减少了反向因果关系和混杂偏差的程度。然而，我们的研究也存在一些局限性。首先，我们没有提供关于25-羟基维生素D与子宫内膜异位症之间关联的生理解释。其次，我们的研究集中在欧洲血统的个体上；因此，结果可能无法准确反映不同血统个体（如亚洲人和黑人）之间25-羟基维生素D与子宫内膜异位症的关系。因此，需要进一步的研究将现有发现推广到非欧洲人群。第三，尽管子宫内膜异位症仅影响女性，但本研究中使用的血清25-羟基维生素D GWAS包括了男性和女性参与者。因此，如果有新的关于女性血清25-羟基维生素D的GWAS数据，进行类似研究将非常有趣。第四，子宫内膜异位症GWAS的相对较小的样本量（n=8288）可能导致工具偏倚较弱，尽管F统计量很强（>10）。最后，测量误差也可能影响研究结果的可靠性。因此，当更大、更全面的数据集向公众公布时，应进行更多的相关研究[39,40]。因此，这一方向的因果估计应被视为初步的，需要在未来研究中用更强的遗传工具和一致的结果进行验证。

5. 结论
我们的双向MR分析表明，25-羟基维生素D与子宫内膜异位症的发展风险没有因果关联。然而，有迹象表明子宫内膜异位症可能导致血清25-羟基维生素D水平略微升高，尽管这一发现在不同方法间并不一致，需要进一步研究。

致谢
作者感谢所有参与原始全基因组关联研究的参与者和研究人员，他们提供了并分享了汇总统计数据。我们特别感谢MRC-IEU UK生物银行提供的25-羟基维生素D数据（访问号：ebi-a-GCST90000618）和FinnGen联盟提供的子宫内膜异位症数据（版本R9，finn-b-N14_ENDOMETRIOSIS）。

作者贡献
概念设计：江宏坤、林发全
数据整理：黄晓梅、王紫拉
正式分析：江宏坤
软件操作：江宏坤、唐英华、林发全
可视化：江宏坤、唐英华、林发全
初稿撰写：江宏坤
审稿与编辑：江宏坤、林发全