通过小角中子散射技术研究带电荷图案的多肽胶束中的可编程静电效应

《Macromolecules》：Programmable Electrostatics in Charge-Patterned Polypeptoid Micelles Probed by Small-Angle Neutron Scattering

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静电相互作用是离子胶束组装和组织的关键决定因素。在这里，我们合成了具有离散链长和单电荷或三电荷残基的序列定义多肽嵌段共聚物，这些残基以不同的模式排列。在pH 9.0下对半稀释聚合物溶液进行无模型小角中子散射分析后发现，胶束间相互作用遵循屏蔽库仑势能，其强度和范围由电荷排列决定。值得注意的是，将带电残基放置在疏水/亲水块状连接处可以增强静电排斥的范围，而分裂电荷的基序产生的排斥力更强、范围更广。散射长度密度剖面直接提供了关于胶束尺寸、核心密度、冠状构象和溶剂渗透情况的实空间信息。胶束电荷与聚集体数分析进一步揭示了入侵水和反离子关联的影响。这项研究表明，序列特定的电荷排列是一种精确的分子工具，可用于调节胶束结构和静电相互作用，为在拥挤环境中的自组装程序化控制奠定了基础。

引言
生物大分子依赖于分子拥挤、水合作用和精细调节的静电相互作用来控制其结构、动态和组装。（1-3）在平均分子间距小于分子尺寸的拥挤环境中，拥挤成为塑造生物分子结构、动态和功能的主要力量。（3-8）虽然排除体积效应和熵约束可以稳定紧凑构象（9,10）、加速蛋白质折叠（11-13）并调节酶活性（14-16），但非共价相互作用（无论是吸引还是排斥）可能会破坏这些效应，从而促使新的组装模式出现（17,18）。此外，与稀薄环境相比，拥挤条件会促进更紧密的水合层（19），减少体相水的可用性，并减缓水的扩散动态（19,20）。总体而言，这些效应可以稳定紧凑的生物分子构象，改变折叠平衡（21），并抑制非天然聚集（22）。拥挤、水合作用和静电相互作用共同在所有尺度上塑造了生物组织的结构。

受这些生物原理的启发，人们在半稀释溶液中研究了合成聚合物，在这种溶液中，互穿和拥挤加剧了空间和静电约束（23-25）。虽然稀薄系统为胶束自组装提供了基础性见解，但它们仅捕捉到了自组装行为的狭窄窗口。在超过重叠浓度时，聚合物链会相互穿透（23,24），拥挤加剧，从而产生可以重塑组装路径和最终结构的集体相互作用。此外，许多实际的胶束制剂在远高于稀薄浓度的条件下也能很好地发挥作用，例如在个人护理产品、食品系统和某些药物递送制剂中。在半稀释条件下更好地理解分子间相互作用和控制聚合物组装既具有基础性兴趣也有实际需求。早期对表面活性剂、聚电解质均聚物和带电嵌段共聚物的研究已经表明，电荷密度和浓度显著影响胶束形态和颗粒间相关性（26-35）。然而，大多数合成系统缺乏分子精度，无法分离序列级对静电作用的影响，因此对半稀释条件下空间电荷排列的作用了解不足（29,32,33）。

序列定义的多肽是将侧链连接到聚甘氨酸主链的氮原子上，而不是α-碳原子上，这提供了一个多功能平台来应对这一挑战。与多肽不同，多肽没有主链氢键和立体中心，能够精确地控制每个单体的化学序列、侧链功能性和电荷排列（36-45）。这种序列可编程性使得可以详细调控疏水性、亲水性和带电残基，从而允许对链构象进行精确控制（46-50）。因此，多肽成为研究生物分子电荷编码的理想模型，同时避免了多肽固有的构象复杂性（51-55）。最近的研究表明，多肽中的电荷排列决定了链构象（49）、胶束结构（56,57）、胶束内的水分分布（58）、pH响应性（59）以及胶束的界面水动力学（60）。然而，在半稀释条件下，当胶束相互作用时，电荷数量和沿多肽链的空间分布的相互作用仍大部分未被探索。

小角中子散射（SANS）可以定量获得胶束形状因子P(Q)和结构因子S(Q)，从而探究内部胶束结构和胶束间相互作用（61-70）。然而，在传统依赖模型的方法中，由于强烈的颗粒间相互作用会扭曲散射剖面，使得固定形状模型失效（71-73）。为了解决这个问题，最近的技术发展引入了无模型策略，包括正交基组展开（74）、PhaseLift重建（75）和使用Kolmogorov–Arnold网络（KAN）的机器学习反演（76）。这些方法能够在不做出限制性假设的情况下直接重建胶束密度剖面并稳健地提取颗粒间势能。

在这项工作中，我们应用这种无模型分析框架来研究在水溶液中序列定义的多肽嵌段共聚物的组装，这些共聚物在亲水块中含有一个或三个离子单体残基，这些残基被策略性地定位。通过系统地改变离子残基的数量和空间排列（末端、中间和连接处；分裂电荷与块状电荷基序），我们发现了电荷编码如何在半稀释条件下决定胶束内结构和胶束间静电相互作用。这项工作将无模型散射分析与分子编程的聚合物设计相结合，利用电荷排列作为分子手段来编码和控制拥挤环境中的自组装，从而实现高精度地工程化可编程、分级组织的软材料。

材料与方法
序列定义的多肽聚合物的合成与表征
序列定义的多肽嵌段共聚物（图1）通过改进的固相亚单体方法在Prelude X肽合成仪上合成（方案S1）（36,41,56,58）。所得聚合物通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）和基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行了表征。

图1
(A) 由N-十二烷基甘氨酸（黑色球体）、N-2-甲氧乙基甘氨酸（红色球体）和N-2-羧乙基甘氨酸残基（蓝色球体）组成的多肽嵌段共聚物序列库，以及代表性序列定义多肽BCP（SEQ 1）的化学结构。
(B) 通过无模型SANS分析探测的假设性序列定义多肽BCP胶束（SEQ 5）的内部结构和胶束间相互作用的概念性插图。V(r)和Δρ(r)分别表示有效对势能和超额散射长度密度剖面。

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反相高效液相色谱
HPLC分析使用Waters 616泵、Waters 2707自动进样器和Waters Empower 2软件控制的996光电二极管检测器进行。分离在Waters XSelect HSS Cyano柱（3.5 μm, 75 × 3 mm）上进行，通过混合洗脱液A（0.1% TFA在水）和B（0.1% TFA在乙腈）制备梯度。梯度从40% B在30分钟内变化到70% B。流速为0.4 mL/min，检测波长为215 nm。样品通过将肽嵌段共聚物（0.5 mg/mL）溶解在60%水/40%乙腈混合溶剂中制备。

基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱
MALDI-TOF MS测量在配备smartbeam-II 1000 Hz激光器的Bruker UltrafleXtreme串联飞行时间（TOF）质谱仪上进行（Bruker Daltonics，Billerica，MA）。仪器使用Peptide Calibration Standard II（Bruker Daltonics，Billerica，MA）进行校准。所有测量中使用的基质是α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA）在甲醇中的饱和溶液。聚合物溶液样品（1 mg/mL）与饱和基质溶液按1:1体积比混合均匀。混合物（1 μL）沉积在384孔磨砂钢样品板上，并在空气中干燥后使用正反射模式进行测量。数据分析使用FlexAnalysis软件进行。

小角中子散射实验
水溶性多肽BCP溶液通过将冻干的聚合物溶解在D2O中制备，浓度为20 wt.%。溶液在70°C的水浴中加热2小时，然后冷却至室温过夜（>8小时）以确保平衡。使用NaOD（对于基于D2O的样品）将每个溶液的pH调整至9.0，确保可电离基团完全脱质子化。超小角中子散射（USANS）测量在橡树岭国家实验室的散裂中子源（SNS）进行。样品放置在路径长度为2.0 mm的石英banjo细胞中。在数据采集过程中，将细胞轻轻滚动以防止沉淀，并保持样品均匀暴露于中子束下。入射中子波长设置为3.6 ?。仪器配置采用源到样品距离为30 m和有效样品到检测器距离为2.13 m，带有一个1.2 cm的针孔光圈。该设置可以访问1 × 10–4到1 × 10–3 ?–1的散射矢量范围。每个样品的数据收集时间大约为8小时，I(Q)的不确定性基于计数统计确定。

小角中子散射（SANS）测量在橡树岭国家实验室（ORNL）的散裂中子源（SNS）的扩展Q范围小角中子散射（EQ-SANS）仪器上进行（77,78）。溶液加载到1 mm Hellma banjo细胞中，并在数据采集期间保持25°C。散射数据在动量转移范围0.007–0.2 ?–1内收集，使用样品到检测器距离为4.0 m，以帧跳过模式进行，每个样品的测量时间约为30分钟。原始散射强度根据标准EQ-SANS程序转换为绝对单位，包括对探测器灵敏度、透射和背景的校正（79,80）。

数据分析和讨论
序列定义的多肽嵌段共聚物的合成与表征
通过改进的固相亚单体合成方法合成了具有离散链长和精确单体序列的单电荷或三电荷序列定义的多肽嵌段共聚物（BCP）库（图1A）（36,41,56,58）。每个多肽BCP由总共25个单体残基组成（DP = 25）。疏水块包含五个N-十二烷基甘氨酸（NDE）残基，而亲水块共包含二十个残基，包括中性N-2-甲氧乙基甘氨酸（NME）残基和可电离的N-2-羧乙基甘氨酸（NCE）残基，这些残基在链上的数量和空间排列各不相同。对于单电荷多肽BCP（SEQ 1 – SEQ 3，图1A），亲水块中有十九个中性NME残基和一个可电离的NCE残基。亲水块内单个可电离残基的位置进行了系统变化，逐步将其移近疏水/亲水块连接处。因此制备了三种不同的序列定义多肽BCP（SEQ 1– SEQ 3），分别代表可电离残基的末端、中间和连接处位置，如图1A所示。

对于三电荷多肽BCP，亲水块中有十七个中性NME残基和三个可电离的NCE残基（SEQ 4 – SEQ 9，图1A）。这三个可电离的NCE残基以块状或分裂模式排列，并逐渐靠近疏水/亲水块连接处，类似于单电荷多肽BCP系列中的方法。每个序列的分子组成和纯度水平通过高效液相色谱（HPLC）和基质辅助激光解吸/离子化飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行了验证（图S1和S2）。

半稀释水溶性多肽嵌段共聚物溶液的无模型SANS分析
进行小角中子散射（SANS）实验以探究序列定义的多肽BCP（SEQ 1 – SEQ 9，图1）在半稀释溶液中的内部结构和胶束间相互作用。图2显示了在25°C和pH 9.0下，20 wt.% D2O中的多肽BCP（SEQ 1 – SEQ 9）水溶液的测量绝对散射强度I(Q）（黑色符号），以及从无模型分析协议获得的相应拟合曲线（红色线条）。pH调整至9.0以确保聚合物上羧酸基团的完全电离，这些肽序列的典型pKa为5–6（56,58）。对于每个序列，实验数据被分解为单颗粒形状因子P(Q）（绿色曲线）和颗粒间结构因子S(Q）（蓝色曲线）。形式因子P(Q)是使用正交基扩展方法和PhaseLift算法（74,75）以无模型方式提取的，该方法能够在不假设特定颗粒几何形状的情况下重建胶束的超额散射长度密度（SLD）分布Δρ(r）（详见下文）。Δρ(r)的分布提供了对单个胶束内部径向密度分布的直接实空间洞察，揭示了核心密度、冠状链构象、径向梯度以及溶剂的渗透情况。同时，结构因子S(Q)是使用Kolmogorov–Arnold Network（KAN）方法（76）进行分析的，该方法能够提取有效的胶束间相互作用势V(r)及其定义参数，包括相互作用幅度（A）、Debye屏蔽常数（κ）、有效电荷（Z）和硬球直径（D）（详见下文）。实验散射分布与无模型重建结果之间的吻合（见图2）突显了这种结合的无模型框架在解析序列定义的多肽组装体中的内部和胶束间结构方面的能力。

图2
（A–I）序列定义的多肽嵌段共聚物胶束（SEQ 1 – SEQ 9）（黑色符号）在半稀水溶液（20 wt.% 聚合物溶于100% D2O溶液，pH = 9.0）中的散射强度I(Q)以及分解为P(Q)（绿线）和S(Q)（蓝线）以提取相互作用参数和实空间SLD分布Δρ(r)的拟合结果。图A的插图中显示了一个USANS数据的例子，证明了系统中不存在可检测的大规模聚集或介观尺度异质性。

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SEQ 1 – SEQ 9胶束的形式因子（P(Q)表现出三种不同的模式，如图2A–I中的绿线所示。在所有P(Q)分布中，第一种模式在低Q区域（0.007 < Q < 0.02）出现一个平台。第二种模式在中间Q范围（0.02 < Q < 0.1）内随着Q的增加而出现明显的凹陷。在更高的Q值（Q > 0.1）时，所有P(Q)分布显示出更平缓的衰减。对于单电荷序列（SEQ 1 – SEQ 3），将离子单体移近疏水块和亲水块的连接处会导致低Q区域平台强度的稳定下降以及在中间Q区域更平缓的衰减，表明胶束聚集数量和大小的持续减少（图2A–C）。在双分裂电荷序列（SEQ 4 – SEQ 6，图2D–F）和三分裂电荷序列（SEQ 7 – SEQ 9，图2G–I）的P(Q)分布中也观察到类似的趋势。

SEQ 1 – SEQ 9胶束的结构因子分布（S(Q)在中间Q范围都显示出明显的峰值（红线，图2），表明在半稀溶液中胶束之间存在排斥相互作用。对于单电荷序列（SEQ 1 – SEQ 3），峰值位置随着离子单体逐渐靠近疏水块和亲水块的连接处而向更高的Q值移动，表明胶束间间距减小（图2A–C）。双分裂电荷序列（SEQ 4 – SEQ 6）和三分裂电荷序列（SEQ 7 – SEQ 9）在其各自的序列系列的S(Q)分布中也表现出类似的趋势。

为了确保没有来自超过胶束尺寸的结构的相干散射，我们进一步使用超小角度中子散射（USANS）探测了胶束溶液。如图2A插图所示，在探测的Q范围10–4 ?–1内，没有系统性地在低Q区域出现上升或超出统计波动的额外强度。这证实了不存在更大规模的聚集物，并且表明测量到的强度主要由单胶束散射在相关长度范围内决定。

多肽BCP胶束的有效胶束间相互作用势

对于离子聚合物胶束，主要的胶束间相互作用来自屏蔽的静电排斥，通常用Debye–Hückel理论推导出的硬球Yukawa（HSY）势来表示。（82,83）这种势描述了系统在短距离具有硬核排斥，在长距离具有屏蔽（Yukawa型）排斥的特性，表达式为：
$$
\mathcal{V}(r) = \begin{cases}
0 & \text{if } r < D \\
\frac{1}{k_{\text{Debye}} e^{-\kappa (r - D)} & \text{if } r \geq D
\end{cases}
$$
其中 $\beta = \frac{1}{k_{\text{Boltzmann}}$ 是玻尔兹曼常数，$D$ 是硬球直径，$\kappa = \frac{1}{\lambda_{D}}$ 是Debye屏蔽常数（$\lambda_{D}$ 是Debye长度），$A = \frac{Z^2 e^{2k_{\text{Boltzmann}}\varepsilon(1 + \kappa D^2)}{2}$ 是由有效胶束电荷数 $Z$、溶剂介电常数 $\varepsilon$ 和基本电荷 $e$ 决定的相互作用幅度。传统上，通过使用Ornstein–Zernike（OZ）积分方程（61,84）并采用诸如平均球形近似（MSA）（63）、重新缩放的MSA（RMSA）（64）、穿透背景RMSA（PB-RMSA）（70）或超网络（HNC）（66）和Percus–Yevick（PY）闭合（67）等方法来反演S(Q)以获得V(r)。这些方法都有各自的局限性：HNC系统性地低估了S(Q)，PY高估了它，RMSA和PB-RMSA在高浓度下失效，而Rogers–Young（RY）闭合（68）虽然在中等耦合情况下有效，但在计算上要求较高且对于强相互作用系统收敛性较差（69）。为了克服这些局限性，我们采用了一种基于Kolmogorov–Arnold Network（KAN）的机器学习辅助框架（76）。这种方法利用Kolmogorov–Arnold表示定理直接将散射谱映射到有效相互作用参数上。与积分方程方法不同，KAN避免了关于闭合关系或直接相关函数解析形式的假设，提供了一种稳健且通用的回归方案，用于从实验S(Q)中提取颗粒间势。

图3显示了使用基于KAN的反演从实验S(Q)重建的有效胶束间相互作用势βV(r)，并拟合到HSY形式。对于SEQ 1 – SEQ 3（单电荷）序列，将离子单体移近亲水/疏水块连接处会增加接触排斥和排斥势的范围，这与电荷接近胶束核心时更离域的静电作用一致。对于SEQ 4 – SEQ 6（三电荷，分裂）序列，其中离子残基由中性单元分隔，电荷向内移动增加了接触势的排斥范围。与相同电荷位置的块电荷序列（SEQ 7 – SEQ 9）相比，分裂电荷序列（SEQ 4 – SEQ 6）显示出更强的接触势和更长的长程排斥，表明电荷沿亲水块的离域程度更大。SEQ 7 – SEQ 9（三电荷，块状）序列，其中离子残基聚集，表现出更局部的相互作用。随着离子簇靠近块连接处，βV(r)的衰减范围变长，衰减变得更加陡峭。

图3
（A–F）序列定义的多肽BCP胶束（SEQ 1 – SEQ 9）在半稀水溶液（pH = 9.0）中的有效胶束间相互作用势βV(r)，通过基于KAN的反演对S(Q)进行HSY拟合获得。

跨系列叠加进一步强调了电荷分布，而不仅仅是电荷数量，决定了排斥强度和范围之间的平衡（图3D–F）。拟合的HSY相互作用势参数证实了这些趋势：电荷沿链向内移动会减小硬球直径并增加Debye屏蔽长度，表明静电排斥的范围更广（表1和图4）。此外，分裂电荷基序始终产生比块电荷基序更长的排斥范围。

表1. 序列定义的多肽嵌段共聚物胶束（SEQ 1 – SEQ 9）在半稀水溶液（pH = 9.0）中的胶束间相互作用势参数
| 序列 | in (A/D) | 1/(κD) | D (?) | Z |
|-------------------|--------------|-------------|--------------|------------------------------|
| 单电荷 (SEQ 1 – SEQ 3) | 1.2 | 0.4 | 2.1 | 0.2 |
| | ±0.2 | ±0.04 | ±0.4 | ±0.05 |
| | 7.4 | ±0.7 | 2.1 | ±0.2 |
| | 2.7 | ±0.3 | 0.4 | ±0.05 |
| | 6.5 | ±0.7 | 2.4 | ±0.2 |
| 三电荷，分裂 (SEQ 4 – SEQ 6) | 4.3 | 0.5 | 0.5 | ±0.7 |
| | 7.5 | 3.5 | 0.4 | ±0.6 |
| | 7.0 | 5.4 | ±0.3 | ±0.1 |
| | 5.1 | 5.0 | 1.0 | ±0.1 |
| 三电荷，块状 (SEQ 7 – SEQ 9) | 7.2 | 0.4 | 0.3 | ±0.4 |
| | 7.3 | 2.7 | 0.3 | ±0.4 |
| | 2.7 | 0.3 | 0.5 | ±0.5 |
| | 5.4 | ±0.2 | 2.2 | ±0.2 |

表1总结了SEQ 1 – SEQ 9的降低的相互作用幅度（ln (A/D)、降低的Debye屏蔽长度（1/(κD)、硬球直径（D）和有效电荷（Z）的值。ln(A/D)反映了接触势，1/(κD)表征了静电排斥的空间衰减，D反映了胶束的排除体积，Z对应于从拟合中推断出的每个胶束的未补偿电荷数。

图4
（A–D）序列定义的多肽胶束（SEQ 1 – SEQ 9）在半稀水溶液（pH = 9.0）中的有效相互作用势参数图。ln (A/D)、1/(κD)、(D) 和 Z分别对应于降低的相互作用幅度、降低的Debye屏蔽长度、硬球直径和有效电荷数。

在单电荷序列（SEQ 1 – SEQ 3）中，将离子残基移近亲水/疏水块连接处会系统性地减小D值，同时增加ln (A/D)和Z（图4）。这表明随着电荷靠近核心-冠状界面，排除的胶束体积变小，静电排斥更强烈且范围更广。实际上，SEQ 1表现出最弱的、最局部的排斥作用，而SEQ 3显示出最强且最广泛的排斥作用。

对于三电荷分裂序列（SEQ 4 – SEQ 6），其中离子残基由中性单体沿着亲水块分隔，ln (A/D)和Z的值显著高于单电荷情况，反映了每条链上存在多个电荷（图4A,D）。这些值也显著高于相应的块电荷序列（SEQ 7 – SEQ 9），表明后者中的反离子关联增加，因此接触势降低（图4A,D）。此外，对于分裂电荷序列，特别是当电荷靠近疏水块和亲水块连接处时，1/(κD)的值更高，表明排斥范围更长（图4B）。这表明电荷的离域使静电场延伸，使胶束能够在更远的距离上相互作用。

为了进一步研究这种序列依赖性的物理起源，考虑Manning反离子凝聚理论的经典框架是有指导意义的。尽管Manning理论最初是为具有明确线状电荷密度的线性聚电解质开发的，但当前系统由球形胶束组成，其带电残基位于弯曲的聚合物冠状层内。因此，不期望将Manning理论严格应用于整个胶束。然而，Manning参数提供了一个有用的局部静电测量，用于测量沿聚合物主链的电荷间距，这为观察到的趋势提供了物理上的一致性检验。

在Manning理论中，当线性电荷密度参数 $\omega = \frac{l_B \beta \xi}{l_B}$ 超过1时，就会发生反离子凝聚，其中 $l_B$ 是Bjerrum长度，$b$ 是沿链轮廓相邻带电位点之间的平均间距。对于室温下的水溶液，Bjerrum长度约为7 ?。在多肽链中，相邻残基之间的投影主链间距约为3.5–4 ?。因此，对于块电荷基序，带电残基连续出现时，有效电荷间距约为b ≈ 3.5–4 ?，从而使得 $\xi \approx 1.75–2$。相比之下，对于分裂电荷基序，带电残基由中性单体分隔，有效间距约为b ≈ 7–8 ?，相应地 $\xi \approx 0.88–1$。这种比较表明，块状基序在局部超过了Manning阈值（$\xi > 1$），这有利于反离子凝聚，并减少了在胶束水平观察到的有效电荷。另一方面，分裂基序接近或低于这个阈值，从而降低了反离子凝聚的程度，并产生了更大的有效胶束电荷Z。虽然胶束本身不是线性聚电解质，但这种局部电荷密度解释了为什么分裂电荷序列表现出更高的有效电荷和更长的静电排斥范围。

总体而言，拟合参数显示，静电相互作用受胶束上离子残基的总数和空间分布的共同影响。分裂电荷序列产生更离域、更长的排斥作用，而块电荷序列则倾向于局部、短范围的相互作用。这强调了电荷排列在调节胶束间静电作用的强度和范围方面的核心作用。

虽然S(Q)编码了颗粒间关联的信息，但形式因子P(Q)反映了单个胶束的内部结构。为了以无模型方式获得P(Q)并重建超额散射长度密度分布Δρ(r)，我们使用了正交基扩展和PhaseLift框架，这两者在数学上是等价的（74,75）。在这些方法中，Δρ(r)用线性独立的基函数表示，并受到适当的边界条件约束，相应的散射幅度F(Q)和形式因子P(Q)通过球形贝塞尔变换计算得出。这种统一的方法消除了对预设解析模型的需求，这些模型可能会影响解释并限制灵活性。相反，P(Q)和Δρ(r)（图S3–S6）直接从测量的I(Q)重建，确保了倒易空间和实空间之间的数学一致性。计算基准测试和实验验证表明，该框架能够提供稳定且准确的解决方案，即使对于扩散性或结构复杂的胶束体系也是如此。(75) 在我们的分析中，从正交基展开和PhaseLift方法获得的提取结果在定量上非常一致，进一步验证了这种无模型重建方法的稳健性。量化胶束内构象的最相关结果是重建的Δρ(r)分布图（图S3–S6），它代表了球形胶束内部密度分布的径向平均测量值。该分布图同时捕捉到了聚合物链段的分布以及水渗透到胶束内部的情况，为胶束的组织提供了全面的实空间描述。这两种等效方法之间的一致性表明，它们都可以可靠地应用于未来对复杂软物质系统的研究，为基于散射的结构分析提供了一种通用且可推广的方法。图5展示了使用正交基展开和PhaseLift框架获得的SEQ 1 – SEQ 9序列的标准化过量散射长度密度（SLD）分布图Δρ(r)/Δρ(0)。所有序列都表现出核壳型胶束结构，这从每个Δρ(r)/Δρ(0)分布图中存在两个不同的区域可以看出。在第一区域，对应于胶束核心区域，Δρ(r)/Δρ(0)随着与胶束原点的距离增加而急剧减小。在第二区域，与胶束晕圈部分相关，Δρ(r)/Δρ(0)逐渐减小，最终趋近于零（图5）。值得注意的是，Δρ(r)/Δρ(0)分布图在原点附近没有平台区域，这表明胶束核心内部存在渗透水。对于单电荷序列（SEQ 1 – SEQ 3），将离子残基重新定位到亲水/疏水交界处附近会使Δρ(r)/Δρ(0)分布图的衰减更加明显，表明胶束晕圈更加紧凑，聚合物链段在核心-晕圈界面附近的定位更加集中（图5A）。图5B和图5C分别显示了三电荷分裂序列（SEQ 4 – SEQ 6）和三电荷块序列（SEQ 7 – SEQ 9）也呈现出相同的Δρ(r)/Δρ(0)趋势。

此外，三电荷序列在Δρ(r)/Δρ(0)的径向衰减上比单电荷序列更为明显，其中离子残基位于链上的等效位置（即末端、中间或交界处）（图5D–F）。这表明三电荷序列形成了更加紧凑的胶束构象，径向扩展较小。如图5D的插图所示，SEQ 4和SEQ 7在Δρ(r)/Δρ(0)分布图上显示出统计上显著的差异。三电荷分裂序列（SEQ 4）的电荷位于链的末端，其在30? < r < 75 ?的径向范围内显示出更宽且更强烈的Δρ(r)/Δρ(0)分布。这表明电荷效应更为分散，胶束晕圈也比三电荷块序列（SEQ 7）更为扩展（图5D插图）。有趣的是，当带电单体位于链的交界和中间位置时，三电荷分裂序列与三电荷块序列之间的Δρ(r)/Δρ(0)分布图差异大大减小（SEQ 5与SEQ 8相比，图5E）或几乎消失（SEQ 6与SEQ 9相比，图5F）。总体而言，重建的分布图显示Δρ(r)/Δρ(0)反映了胶束内部的聚合物分布以及渗透水的分布。SEQ 1 – SEQ 9之间的系统差异表明，离子残基的数量及其空间排列控制了半稀释溶液中的胶束密度组织。从图S6中显示的重建的修正过量SLD分布Δρ(r) (nm)1/2（nm = 胶束数密度）可以看出，表征胶束密度加权空间范围的回转半径Rg定义为Rg = ∫∞0r2Δρ(r)4πr2dr / ∫∞0Δρ(r)4πr2dr。此外，可以引入一个有效胶束半径R，定义为R = 4πΔρ(0) / ∫∞0r2Δρ(r)4πr2dr。如果假设核心不含水，R可以用来衡量每个胶束中的表面活性剂含量（见下面的公式5），而Rg则表征了散射密度的空间分布和范围。结合起来，R和Rg提供了胶束大小和内部组织的互补的实空间描述符。对于硬球，比率5Rg2/3R2 = 1。对于一般单调递减的Δρ(r)分布，比率5Rg2/3R2 > 1反映了有效均匀半径之外的更广泛的对比度空间分布，这是胶束内聚合物含量紧密堆积程度的指标。在胶束的背景下，比率偏离1（5Rg2/3R2 > 1）表明结构更为分散，径向扩展更大。表2和图6中的Rg、R和5Rg2/3R2的值证实了Δρ(r)/Δρ(0)分布图中观察到的胶束结构趋势。

表2. 从各自修正的SLD分布Δρ(r) (nm)1/2（图S6）以及公式2、3和5获得的序列定义的多肽块共聚物胶束（SEQ 1 – SEQ 9）的结构参数
序列 R (?) Rg (?) Nagg Z/(Naggnc)
单电荷序列（SEQ 1 – SEQ 3；nc = 1） 125.0 ± 0.2 48.0 ± 0.5 2.48 ± 0.0 12.7 ± 0.4 1.6 ± 0.2 23.2 ± 0.2 2.6 ± 1.0 2.37 ± 0.0 10.1 ± 0.3 2.0 ± 0.2 21.3 ± 0.2 32.1 ± 0.2 37 ± 0.3 22.6 ± 0.0 7.8 ± 0.2 3.1 ± 0.3
三电荷分裂序列（SEQ 4 – SEQ 6；nc = 3） 424.1 ± 0.2 45.9 ± 0.6 2.46 ± 0.0 11.9 ± 0.4 1.0 ± 0.1 520.9 ± 0.2 34 ± 2 21.7 ± 0.3 61.9 ± 0.2 3.9 ± 0.4
三电荷块序列（SEQ 7 – SEQ 9；nc = 3） 722.6 ± 0.2 40.8 ± 0.8 2.33 ± 0.0 9.8 ± 0.3 0.8 ± 0.1 20.6 ± 0.2 31.7 ± 0.0 7.4 ± 0.2 11.1 ± 0.1 17.5 ± 0.2 26 ± 0.2 31.9 ± 0.2 4.4 ± 0.2 3.9 ± 0.4

表3. 无模型分析框架的概述
方法 实验输入 中间量 提取输出 衍生参数
正交基展开 I(Q) F(Q), P(Q) Δρ Rg, R, Nagg
PhaseLift I(Q) Δρ(r) Δρ(r) 优化后的Δρ 结构一致性检查
KAN 直接相关函数 V(r) κ, D, Z, A

图6. （A–E）从各自修正的SLD分布Δρ(r) (nm)1/2（图S6）以及公式2、3和5获得的序列定义的多肽胶束（SEQ 1 – SEQ 9）的结构参数图。
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胶束聚集数（Nagg）定义为Nagg = ΣvmΔρm / Vm，其中Vm是单个胶束内聚合物链占据的体积，vm是聚合物链的分子体积，Δρm是聚合物与 bulk water 之间的散射长度密度差。如果我们假设胶束中心没有渗透水，那么Δρ(0) = Δρm。在这种渐近情况下，可以使用公式5从胶束的修正过量SLD分布（图S6）获得Nagg。

比较有效电荷Z（表1）与Naggnc是有启发性的，其中Nagg是胶束聚集数，nc是聚合物链上的结构电荷数（SEQ 1 – SEQ 3时nc = 1；SEQ 4 – SEQ 9时nc = 3）（表2）。原则上，在假设胶束核心没有渗透水的情况下，预期Z ≤ Naggnc，这反映了反离子关联程度的不同。然而，比较显示这种关系并不总是成立，如表2所示。鉴于公式4和5，这一结果突出了胶束核心内渗透水的影响，它改变了过量散射长度密度分布，导致Nagg的低估，从而改变了Z和Naggnc之间的关系。尽管当前的SANS分析无法区分反离子关联和渗透水对Δρ(r)的影响，但比率Z/(Naggnc）（表2）是一个有用的综合指标，可以反映反离子关联和渗透水的共同影响。需要强调的是，这里Z/(Naggnc)比率并不被解释为胶束核心内溶剂分数的直接定量测量。聚集数Nagg是在假设核心干燥的渐近条件下估计的，这提供了每个胶束中聚合物含量的近似测量值。如果胶束核心存在渗透水，重建的Δρ(r)分布将低估真实的聚合物体积，从而导致Nagg的系统性低估。然而，这种偏差仅影响Nagg的绝对大小，而不影响序列之间的相对比较，因为所有样本都是使用相同的对比条件和重建协议进行分析的。因此，Z/(Naggnc)应当被解释为反离子关联和渗透水共同影响的相对指标，而不是核心水合的直接定量测定。注意，Z/(Naggnc)比率大于1表明胶束核心内渗透水的程度更大，而比率小于1并不一定表示没有渗透水。根据表2和图6中的Z/(Naggnc)值，所有胶束的核心都含有显著量的渗透水，且对于单电荷和三电荷分裂或块序列，随着离子残基向内部移动，渗透水的程度增加（图6E）。三电荷分裂序列（SEQ 4 – SEQ 6）在胶束核心中的渗透水比三电荷块序列（SEQ 7 – SEQ 9）更多。

方法论假设和无模型框架的范围
尽管被描述为无模型，但当前的分析依赖于明确定义的数学约束，而不是预定义的结构假设。正交基展开假设过量散射长度密度分布Δρ(r)可以表示为满足物理边界条件的完整正交基函数的线性组合，包括有限的回转半径和在大r处的平滑衰减。没有强制规定任何几何形状（例如，核壳或模糊球体）。PhaseLift重建将反问题重新表述为一个在一个提升的矩阵空间X = ΔρΔρT中的问题，将非凸相位恢复问题转化为凸优化问题。这在统计各向同性和有限支持的假设下保证了收敛到全局最小值。基于KAN的反演仅假设散射可观测量与有效相互作用参数之间存在连续映射。与Ornstein–Zernike积分方程方法不同，它不假设直接相关函数的闭合关系或解析形式。这些约束与传统的基于模型的拟合方法有根本区别，后者预先假设了明确的结构形式。在这里，结构信息直接从实验数据中得出，仅受数学规则性和物理边界条件的限制。表3总结了从实验测量的I(Q)到实空间结构和相互作用参数的数据流，无需依赖于参数化的结构模型。

结论
在这项工作中，我们使用无模型的小角中子散射（SANS）分析框架研究了序列定义的离子多肽块共聚物的胶束内部和胶束间结构。通过结合正交基展开和PhaseLift重建进行单粒子形状因子分析，以及Kolmogorov–Arnold网络（KAN）进行结构因子分析，我们建立了一种无需依赖预设模型的全面方法来表征胶束组织。重要的是要强调，提取参数的稳健性并不来源于对特定几何模型的拟合，而是来源于反演框架在倒易空间和实空间中的内在数学一致性。对结构因子S(Q)的分析表明，胶束间相互作用受到筛选后的库仑势的支配，其强度和范围由亲水块上离子残基的数量和空间分布决定。将离子残基放置在亲水/疏水块交界附近会增加静电排斥的范围，而分裂电荷基序产生的排斥作用比块电荷基序更强且范围更广，当电荷残基位于链的等效位置（即末端、中间或交界处）时尤为明显，这突出了电荷离域在调节胶束间相互作用中的关键作用。重建的过量散射长度密度分布Δρ(r)提供了胶束内部结构的直接实空间测量值。提取的胶束半径（R）、回转半径（Rg）和聚集数（Nagg）显示了离子单体位置的系统趋势。有效电荷（Z）与Nagg之间的比较突出了胶束核心内渗透水的影响，Z/(Naggnc)比率作为反离子关联和水分渗透的集体描述符。虽然所有序列定义的多肽BCPs都形成了核壳型胶束，但当带电残基位于链的等效位置（即末端、中间或交界处）时，单电荷胶束的尺寸更大，径向链扩展也更大。此外，当离子残基靠近疏水/亲水块交界处时，胶束尺寸减小，胶束晕圈变得更紧凑，同时水渗透到胶束核心的程度增加。这些在半稀溶液中的趋势与稀薄条件下观察到的结果一致（56,58）。此外，具有分离电荷结构的分子比具有块状电荷结构的分子具有更强的亲水能力，这突显了电荷离域对胶束内部结构的重要影响。总体而言，这项研究表明，通过精确控制序列可以借助电荷调控机制来调节胶束的大小、密度分布以及胶束间的相互作用。将先进的无模型、数据驱动的反演方法与SANS（扫描式原子力显微镜）技术相结合，为研究具有复杂内部结构的软物质系统提供了一个多功能的研究框架。这些见解为利用序列可控的聚合物来调控水环境中的静电驱动自组装过程提供了设计原理。