《Journal of Agricultural and Food Chemistry》：Proteomics and Alkaloid Signature of Narrow Leaf Lupin Leaves Reveal Key Enzymes in Quinolizidine Alkaloid Biosynthesis and Transportation
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喹诺里西啶生物碱（QAs）是窄叶羽扇豆中的有毒次生代谢产物，可防御植食动物，但限制了其食品和饲料用途。研究人员开发了一种单样本多组学工作流程，通过尿素/硫脲/CHAPS（UTC）提取结合丙酮沉淀，实现从单个叶片中同步提取和定量分析QAs与蛋白质，并利用LC-M
喹诺里西啶生物碱（QAs）是窄叶羽扇豆中的有毒次生代谢产物，可防御植食动物，但限制了其食品和饲料用途。研究人员开发了一种单样本多组学工作流程，通过尿素/硫脲/CHAPS（UTC）提取结合丙酮沉淀，实现从单个叶片中同步提取和定量分析QAs与蛋白质，并利用LC-MS/MS验证了QA定量方法。对八个羽扇豆种质（四个苦型，四个甜型）进行数据非依赖性采集蛋白质组学分析，鉴定出4437个蛋白质，其中183个在苦型和甜型组间差异显著。苦型种质在赖氨酸生物合成和应激反应通路中富集，而甜型种质则在苯丙烷类及其他防御相关过程中富集。共表达网络分析将蛋白质模块与总QA及单个QA水平相关联，捕捉了已知的QA相关蛋白质，并揭示了候选酶和转运蛋白。该工作流程增进了对QA调控的分子理解，并为支持低生物碱品种的食品和饲料应用育种提供了候选蛋白质标记和靶点。
研究背景与问题
窄叶羽扇豆（Lupinus angustifolius，NLL）是一种新兴的蛋白质作物，具有高蛋白、高膳食纤维、低血糖指数等营养特性，并显示出调节血糖、控制血脂、抗氧化和抗炎等健康益处。随着消费者对植物蛋白需求的增长，羽扇豆在功能性食品和素食饮食中展现出广阔前景。然而，其广泛应用受到喹诺里西啶生物碱积累的限制。QAs是一类有毒的次生代谢产物，作为天然昆虫驱避剂，但必须将其在种子中的浓度降至200 mg/kg以下以满足食品安全标准，这使得生物碱管理成为育种的核心目标。QAs主要在叶片等地上组织合成，后通过韧皮部转运至种子。其生物合成始于赖氨酸在赖氨酸脱羧酶（La-LDC）作用下脱羧生成尸胺，随后经铜胺氧化酶（CuAO）催化氧化脱氨，产生关键QA前体。这些中间体再经环化、酯化、氧化等修饰步骤，形成结构多样的QAs，如羽扇豆碱、鹰爪豆碱和羟基羽扇豆碱等。尽管转录组学研究已鉴定出一些参与QA生物合成或转运的候选基因，但缺乏蛋白质水平的证据，且尚未有研究将叶片蛋白质丰度变化与QA水平直接关联。此外，羽扇豆叶片富含酚类和多糖，会干扰LC-MS/MS分析，而高丰度蛋白如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（RuBisCO）可能掩盖低丰度目标蛋白，这为蛋白质组学研究带来了技术挑战。因此，开发一种能够从同一样本中同步分析蛋白质和生物碱的方法，对于在蛋白质水平深入理解QA的调控机制、识别关键酶和转运蛋白，进而支持低生物碱品种的选育具有重要意义。
关键技术方法概述
本研究建立并应用了一套多组学工作流程。在样本方面，研究人员选取了八个NLL基因型（四个甜型：Coyote、Marri、PBA Jurien、Tanjil；四个苦型：P26902、P26423、P27895、P22831），在开花期采集叶片样本。在方法学上，核心是同步提取流程：采用尿素/硫脲/CHAPS（UTC）缓冲液结合丙酮沉淀，从同一叶片样本中同时提取QAs和蛋白质。对于生物碱分析，采用液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的多反应监测（MRM）模式进行定量，并对方法进行了全面验证。对于蛋白质组学分析，采用数据非依赖性采集（DIA）质谱技术，结合DIA-NN软件进行蛋白质鉴定和定量。数据分析包括：使用DESeq2算法进行差异丰度分析，比较苦型和甜型种质；使用加权基因共表达网络分析（WGCNA）建立蛋白质丰度与总/单个QA水平之间的关联模块；并进行了基因本体（GO）富集分析以阐释生物学功能。
研究结果
1. 提取方法的优化
研究人员比较了尿素和UTC两种蛋白质提取方法，以及丙酮、三氯乙酸/丙酮、甲醇/氯仿/去离子水三种蛋白质沉淀方法。结果发现，UTC提取法在蛋白质得率（平均19.6 mg/g vs 13.7 mg/g）和鉴定数量（1170 vs 1070个蛋白质）上均优于单一尿素法，且能富集到更多与生物碱代谢和转运相关的蛋白质。在沉淀方法中，丙酮沉淀在减少基质干扰、增强低丰度蛋白检测方面表现最佳。最终确定的UTC/丙酮工作流程在提取羽扇豆碱和窄叶羽扇豆碱方面，效率比传统的盐酸提取法高2-5倍，且重现性更好。
2. 生物碱提取方法的验证
建立的LC-MS/MS方法对多数QAs的基质抑制效应在0-30%之间（窄叶羽扇豆碱除外，约70%）。方法灵敏度高，各生物碱的检测限（LOD）和定量限（LOQ）均低于文献报道值，且低于叶片中QA的自然水平。加标回收实验显示平均回收率在85%至112%之间，变异系数（CV）低于10%，证明该方法准确、可靠、灵敏度高，适用于羽扇豆叶片中QA的定量分析。
3. NLL种质中的生物碱水平
应用优化方法对八个种质进行分析，结果明确区分了甜型和苦型。甜型种质总QA平均浓度低于27 mg/kg，其中窄叶羽扇豆碱是主要成分（57–62%）。苦型种质总QA浓度高达22,000 mg/kg，其中羽扇豆碱（5–51%）和羟基羽扇豆碱（11–73%）占主导。这表明甜型和苦型品种在下游生物合成途径上存在分歧。
4. 参与QA代谢和转运的蛋白质
4.1. 苦型和甜型NLL种质中的QA代谢途径
DIA蛋白质组学在所有叶片样本中鉴定到4437个蛋白质。其中，183个蛋白质在苦型和甜型种质间差异显著（114个在苦型中上调，69个下调）。GO富集分析显示，在苦型种质中上调的蛋白质显著富集于赖氨酸生物合成途径，这与其为QA骨架前体尸胺的合成提供底物相符。同时，支链氨基酸生物合成、甲硫氨酸生物合成、蛋白质折叠/重折叠及热响应等通路也被富集，表明高QA品系存在代谢压力和蛋白毒性应激。此外，防御反应通路蛋白的富集与生物碱的生态防御功能一致。而在甜型种质中上调的蛋白质则富集于苯丙烷类生物合成等不依赖生物碱的防御通路。这表明苦型种质将更多代谢通量导向赖氨酸衍生途径以支持QA生物合成，而甜型种质则可能激活替代防御系统。分析还确认了6个先前被暗示与QA生物合成相关的蛋白质。
4.2. WGCNA分析揭示QA生物合成和转运的新候选蛋白
WGCNA分析鉴定出多个与QA丰度显著相关的蛋白质模块。共发现18个显著的模块-性状关联。其中，250个蛋白质与总QA含量显著相关，而与单个生物碱相关的蛋白质数量更多，例如羟基羽扇豆碱关联了480个蛋白质，显示出其调控网络更为复杂。功能富集分析显示，与QA相关的模块还显著富集了光合作用相关通路，如叶绿素代谢、碳固定和ATP生物合成，表明QA的生物合成与初级代谢和能量生产紧密耦合。分析还发现了一系列转运蛋白与QA丰度相关，其中一些ABC转运蛋白样蛋白与特定的生物碱（如羟基羽扇豆碱、羽扇豆碱或鹰爪豆碱）水平相关，提示可能存在选择性的转运系统调控不同生物碱的分布。
总结与结论
本研究建立并验证了一种从单个羽扇豆叶片样本中同步分析蛋白质和生物碱的多组学提取方法，实现了代谢物组成和蛋白质组变异的精确分析。差异蛋白质丰度分析揭示了与生物碱生物合成相关的生物学过程，包括先前已知的赖氨酸生物合成途径，以及与防御反应相关的其他过程。值得注意的是，低生物碱种质显示出苯丙烷类代谢和防御相关机制的富集。WGCNA识别出了与高、低生物碱谱显著相关的蛋白质模块，既证实了先前报道的QA相关蛋白质，也发现了参与生物碱生物合成和分布的新候选酶和转运蛋白。数种ABC转运蛋白与特定生物碱谱相关联，表明选择性转运机制可能影响单个生物碱的积累。综上所述，这些发现提供了对窄叶羽扇豆中生物碱组成的分子调控的整体认识，强调了生物合成和转运的共同作用，并确定了支持低生物碱品种选育的潜在蛋白质标记。未来的工作应扩展此框架，整合多个组织和发育阶段的蛋白质组学和生物碱测量，从而直接将蛋白质丰度与生物碱积累联系起来，并阐明候选转运蛋白在种子中生物碱沉积的作用。
研究结论（译文）
我们的多组学提取方法经过优化和验证，可用于从单个羽扇豆叶片样本中同步分析蛋白质和生物碱，从而能够精确分析代谢物组成和蛋白质组变异。差异蛋白质丰度分析揭示了与生物碱生物合成相关的生物学过程，包括先前涉及的途径如赖氨酸生物合成，以及与防御反应相关的其他过程。值得注意的是，低生物碱种质显示出苯丙烷类代谢和防御相关机制的富集。WGCNA识别出了与高、低生物碱谱显著相关的蛋白质模块，证实了先前报道的QA相关蛋白质，并揭示了可能参与生物碱生物合成和分布的新候选酶和转运蛋白。几种ABC转运蛋白与特定的生物碱谱相关，表明选择性转运机制可能有助于单个生物碱的积累。总而言之，这些发现提供了对窄叶羽扇豆中生物碱组成分子调控的综合观点，强调了生物合成和转运的共同作用，并确定了支持低生物碱品种选育的潜在蛋白质标记。未来的工作应扩展此框架，以整合多个组织和发育阶段的蛋白质组学和生物碱测量，从而直接将蛋白质丰度与生物碱积累联系起来，并阐明候选转运蛋白在种子中生物碱沉积的作用。
