NordiQC中IHC p53检测的性能：需要重新校准IHC检测方法

《Applied Immunohistochemistry & Molecular Morphology》：IHC p53 Performance in NordiQC: Recalibration of IHC Assays is Needed

　　摘要
**通俗语言总结：** TP53基因是人类癌症中最常发生突变的基因，大约50%的恶性肿瘤中都存在该基因的突变。当优化得当时，p53免疫组化（IHC）可以作为一种可靠的替代方法来检测TP53突变。然而，许多实验室在识别p53 IHC反应模式时遇到困难，尤其是除了过表达之外的其他模式，如缺失、胞质型和野生型模式。随着这些额外模式的临床重要性的认识提高，NordiQC在2021年更新了其评估标准，增加了对野生型和缺失模式的检测，从而增加了p53 IHC的复杂性，并揭示了实验室间存在的普遍问题。在这项研究中，我们分析了2007年至2024年间6次连续的NordiQC外部质量评估数据，共涵盖了1,796个提交的p53 IHC检测结果。我们的研究结果表明，虽然大多数实验室能够可靠地检测到高水平的抗原表达（即过表达），但许多检测方案无法充分显示低水平的p53表达，这限制了IHC检测的有效性。即用型产品（尤其是按照制造商推荐方法使用时）的表现也不尽如人意。这些试剂盒仅经过校准以检测过表达情况，导致对于其他突变相关模式的检测结果出现假阴性或过于微弱的情况。我们的数据代表了迄今为止对p53 IHC检测性能最全面的评估。研究结果强调了迫切需要重新校准p53 IHC检测方案，特别是要提高分析灵敏度，并确保内部和外部质量控制的一致性。使IHC检测方案能够识别所有类型的TP53突变（包括缺失型和野生型突变），将显著提高p53 IHC的诊断准确性。

**常见问题解答：**
TP53蛋白由TP53基因编码，在调节细胞生长和分裂中起核心作用。当检测到DNA损伤时，p53要么暂停细胞周期以允许修复，要么在无法修复时诱导细胞凋亡，从而防止潜在肿瘤的形成。TP53基因是人类癌症中最常发生突变的基因，约50%的癌症病例中存在该基因的突变。在正常、未突变的细胞中，p53的水平通过快速的MDM2介导的降解受到严格调控，导致蛋白质水平较低，因而免疫组化检测难度较大。正常细胞中的典型p53反应模式为野生型模式，表现为细胞核内反应强度不一，从阴性到强阳性都有。相比之下，最常见的TP53突变（错义突变）通常会产生结构改变、功能丧失的p53蛋白，这种蛋白能够逃避降解，导致细胞内异常积累，通过IHC表现为强烈的弥漫性核反应（即过表达模式）。然而，并非所有的TP53基因突变都会导致过表达，实际上观察到了多种不同的p53反应模式。例如，失功能突变往往会产生缩短的mRNA，这些mRNA会迅速降解，从而导致无法检测到p53蛋白，从而使得IHC检测结果无效。背景细胞（如基质细胞、淋巴细胞和内皮细胞）中的野生型反应是重要的内在对照。影响p53核定位域或核输出信号的突变可能导致胞质型反应模式，即p53在细胞质中积累而非细胞核中。这种情况在妇科癌症中较为罕见。历史上，p53 IHC检测采用二元分类方法，将反应结果简单地分为“阳性”或“阴性”，但这未能准确反映TP53突变的生物学多样性。具有完全丧失p53蛋白表达的肿瘤曾被误分类为“阴性”，与真正未突变的病例归为一类，尽管它们具有截然不同的遗传学特征和临床表现。因此，准确识别特定的p53 IHC反应模式对于避免这种误分类至关重要。

**NordiQC质量评估：** Nordic免疫组化质量控制（NordiQC）是一个独立的学术性外部质量评估项目，涵盖60多个国家的700多家实验室。NordiQC向参与实验室提供未染色的组织切片，实验室使用常规方案进行染色。专家团队对这些切片进行集中评审，并发布详细的评估报告，其中包含性能指标、常见问题和最佳实践建议。NordiQC已对p53检测进行了6次评估，自调整评估标准以来，检测通过率显著下降，尤其是在增加了对野生型和缺失模式的检测之后。本研究分析了2007年至2022年的1,796个p53 IHC检测结果，发现许多实验室在检测低水平p53表达方面存在困难，影响了检测结果的准确性。即用型试剂盒往往无法准确检测非过表达模式。

**研究方法：**
早期的NordiQC评估主要关注p53过表达及合适的对照组织的验证（2007年、2013年），而最近的评估（2021年、2022年、2023年、2024年）则扩展了对过表达、缺失型和野生型模式的检测。实验发现，许多实验室在检测低水平p53表达方面存在问题。即用型试剂盒常常无法准确检测这些模式。

**统计分析：** 2007年至2024年间共进行了6次NordiQC p53 IHC评估，参与实验室数量从2007年的93家增加到2024年的397家，总共评估了1,796个p53 IHC检测结果。多年来，达到合格（理想或良好）结果的实验室比例有所波动：2007年为68%，2013年为79%，2021年下降到46%，2023年和2024年恢复到65%。尽管近年来通过率略有提高，但p53 IHC检测仍具有挑战性，仍有35%的实验室使用的检测方案不符合诊断要求。

**结论：** 单克隆抗体DO-7和BP53-11在所有主要IHC系统（Dako/Agilent、Ventana/Roche、Leica Biosystems）中均表现出最佳性能。有效的热诱导表位回收（HIER）技术、精确的初级抗体滴度校准以及三层检测系统的使用对于获得最佳结果至关重要。2024年，77%的实验室选择了即用型抗体产品，而2007年这一比例仅为6%。然而，对比即用型抗体和浓缩抗体发现，浓缩抗体产品的通过率更高。统计分析显示，按照供应商推荐设置使用即用型抗体时，通过率显著高于浓缩抗体（χ2检验 = 24.5，df = 2，P < 0.001）。自2021年以来，NordiQC的评估结果一致显示，结果不充分的最常见原因是染色反应过弱或出现假阴性。所有实验室在p53过表达的样本中都观察到了高水平的抗原表达。然而，在低水平表达抗原的细胞（如间质细胞、淋巴细胞和内皮细胞）以及扁桃体中的生发中心和第二层B淋巴细胞中检测p53则更具挑战性。在不具有TP53突变的肿瘤细胞中准确识别野生型p53模式，以及在具有TP53突变的肿瘤细胞中识别缺失模式，需要一个经过仔细校准的实验方案（图2）。例如，在2024年，只有15%的结果不充分是由于假阴性或染色反应过弱之外的原因造成的，例如与信噪比较低或背景染色过强相关的技术问题，而真正的假阳性反应占所有结果不充分的5%。

**图2：使用相同的一抗的两种不同方案对5个样本进行p53染色反应：一种是实验室修改和优化的方案（A、C、E、G、I），另一种是供应商推荐的方案（B、D、F、H、J）。两种方案都使用mAb克隆DO-7作为Ready-To-Use（RTU）试剂，适用于Benchmark Ultra（Ventana/Roche）系统，并使用OptiView作为检测系统。**
**优化方案（修改设置）：在CC1条件下进行HIER处理64分钟，一抗孵育32分钟。**
**供应商推荐的方案：在CC1条件下进行HIER处理32分钟，一抗孵育16分钟。**
- **（A–D）** 控制组织中的p53染色反应。
- **（A、B）** 扁桃体中的p53染色反应。优化方案（A）在大多数生发中心B细胞中产生弱到中等的核染色反应，而第二层B细胞中只有不到50%显示p53反应。
- **供应商推荐的方案（B）** 敏感性显著降低，只有不到50%的生发中心B细胞显示核p53反应。
- **（E、F）** 具有p53过表达的子宫内膜浆液性癌中的p53染色反应。优化方案（E）在所有肿瘤细胞中产生强烈且均匀的核染色反应。供应商推荐的方案（F）产生的染色模式虽然相似，但较弱，仍能确认p53过表达。
- **（G、H）** 具有野生型p53模式的低级别子宫内膜癌中的p53染色反应。优化方案（G）在所有肿瘤细胞中产生弱到中等的核染色反应。供应商推荐的方案（H）反应显著减弱，可能导致将样本误认为是p53缺失模式，特别是在存在TP53突变的情况下。
- **（I、J）** p53表达缺失的子宫内膜浆液性癌中的p53染色反应。优化方案（I）正确地显示肿瘤细胞中无核染色，而间质细胞显示弱到中等的染色，作为内部阳性组织对照。供应商推荐的方案（J）缺乏间质细胞反应，使得无法确定p53状态。**

导致反应不充分的主要因素被确定为使用了敏感性较低的检测系统、无效的HIER试剂以及不适当的一抗浓度。这些问题通过针对各实验室的反馈得到了解决。

**讨论：**
多年来，我们对TP53分子变化与p53免疫组化（IHC）反应模式之间关联的理解不断加深，这对p53 IHC提出了新的挑战。最新的NordiQC评估结果表明，虽然所有参与实验室都能检测到p53过表达，但常无法识别其他反应模式。随着临床对p53检测要求的改变，NordiQC的评估标准在2021年进行了更新，增加了对野生型和缺失模式的检测，导致通过率大幅下降。其中一个主要问题是RTU抗体在应用VRPS（Verifiable Reference Protocols）时的表现不佳。这似乎是因为市场上的几乎所有RTU产品都仅针对过表达模式进行了校准，因为它们是在其他反应模式被发现之前开发的。虽然这些产品在检测过表达方面有效，但它们并不符合当前的诊断需求，因此迫切需要重新校准。这一问题因所有相关RTU抗体都是根据IVDR（In Vitro Diagnostic Regulation）使用VRPS进行验证而变得更加严重。这意味着如果严格遵循IVDR规定，p53 IHC的性能将会明显下降。临床上，这可能导致TP53突变肿瘤的诊断不足或分类错误，尤其是那些显示无反应或细胞质染色模式的肿瘤。结果可能是患者无法获得适当的治疗，从而直接影响治疗决策和效果。

据我们所知，这是迄今为止规模最大的比较多个实验室p53 IHC质量的研究。以往的研究都没有在这种广泛的技术条件下对p53 IHC检测进行质量保证。通过包含多种方法和实验室设置，我们的研究提供了对检测性能的全面评估，并突出了影响p53 IHC质量和诊断可靠性的关键因素。虽然外部质量保证只能提供个别实验室表现的快照，并存在预期波动，但同时评估多个实验室可以帮助我们识别系统性问题。当许多参与实验室遇到相同的问题时，这反映了全球p53 IHC的现状，而不仅仅是某个实验室的错误。并非所有实验室都会同时更换新的抗体或犯同样的技术错误。本研究中分析的大量方案和结果数据证实了2021年首次发现的系统性问题。幸运的是，那些修改了实验方案的实验室已经取得了进步，但大多数 commercially available RTU IHC系统的重新校准和验证仍然是解决p53 IHC持续挑战的必要步骤。为了支持实验室进行这一过程，NordiQC在其网站上发布了在评估中表现最佳的方案。这些方案可以在www.nordiqc.org的“推荐方案”页面找到，旨在为实验室提供本地验证和优化p53 IHC检测的可靠起点。此外，所有未通过p53评估的参与者都会收到NordiQC提供的具体且定制的优化建议。这些建议基于NordiQC的数据分析，并针对参与者提交和应用的特定实验方案进行定制。然而，本研究的结果必须在一定范围内进行解读。我们的组织微阵列（TMA）样本选择较为有限，包含的肿瘤和正常组织类型也较为有限。包含更多类型癌症组织的更广泛研究将更有益。将我们的结果与其他外部质量评估程序的结果进行比较，我们发现了类似的现象。2021至2022年美国病理学家协会对p53的调查显示，只有5个TMA样本在117个参与实验室中获得了≥80%的一致性。结果不准确的主要原因是染色反应过弱，导致将过表达模式误认为是野生型模式或缺失模式。2023年11月加拿大病理质量保证项目（Run 206）对子宫内膜癌进行的测试显示，大约三分之一的实验室无法充分检测到缺失模式，因为染色反应太弱，无法在背景中显示出野生型模式的内部控制。尽管如此，所有实验室都通过了基于其内部评估标准的熟练度测试。

验证p53 IHC检测成功的一个关键要素是其内在的组织质量控制，这有助于评估检测的分析敏感性。这一观点基于一个已知的事实：间质细胞、内皮细胞和淋巴细胞（这些细胞在大多数组织样本中普遍存在）始终表现出野生型p53反应模式。非肿瘤组织中存在这种野生型模式为检测提供了可靠的参考，表明反应足够充分，具有相关的分析敏感性，对于识别因TP53突变导致p53丢失的肿瘤至关重要。除了认识到内部控制的价值外，我们的结果还强调了选择适当外部控制的重要性，最好是玻片上的对照样本。由于主要问题是假阴性结果和分析敏感性下降，仅使用具有过表达模式的肿瘤组织无法提供关于检测敏感性和重现性的相关信息。因此，建议使用低水平表达p53的外部组织对照，如扁桃体和阑尾/结肠。总之，优化p53 IHC检测以适应不同的TP53突变对于提高诊断准确性至关重要。NordiQC的结果表明，全球范围内存在系统性问题，这些问题正在系统性地影响p53 IHC检测的诊断性能。迫切需要重新校准和验证IHC p53检测，特别是针对广泛使用的商业RTU系统。