功能性磁共振成像揭示大鼠腰椎脊髓中的痛觉信号处理网络

《PAIN Reports》：Functional magnetic resonance imaging insights into nociceptive signal processing network in rat lumbar spinal cord

　　**摘要（简要）**

**引言和目标：** 高分辨率功能性磁共振成像（fMRI）能够映射脊髓内电路的功能组织结构。本研究旨在通过任务态和静息态fMRI技术，识别麻醉状态下大鼠脊髓灰质中的伤害性热处理区域，并描绘其功能组织。

**方法：** 在9.4T磁共振仪中，对左侧后爪受到有害热刺激（47.5°C）时L3-L5脊髓节段的高分辨率fMRI BOLD数据进行采集。

**结果：** 在L3脊髓节段的背角深层和中间区以及L4脊髓节段同侧背角深层，检测到由有害热刺激引发的BOLD信号增强。静息态功能连接（rsFC）分析显示，每个脊髓节段内背角-背角和腹角-腹角之间的rsFC强度最高。不同节段之间的角间未见显著rsFC。

**结论：** 我们的结果表明，L3和L4脊髓节段参与了伤害性热信息的处理，并且两侧的背角和腹角在静息状态下存在强烈的交互作用。我们假设L3前段的中间区作为脊髓内伤害性处理的信息调节中心。高场强fMRI技术清晰地描绘了大鼠脊髓内参与伤害性热处理的电路结构。

**简单语言摘要：** 本研究利用高分辨率fMRI技术探讨大鼠如何处理腰椎脊髓中的疼痛性热刺激。研究人员重点观察L3-L5脊髓节段，发现有害热刺激增加了脊髓特定区域（尤其是背角和中间区）的BOLD信号。静息态分析显示同一节段内背角和腹角之间存在强烈连接，但不同节段之间则没有这种连接。这些发现表明，L3和L4脊髓节段在疼痛处理中起关键作用，其中L3前段的中间区可能对此过程具有调节作用。

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**常见问题解答：**
1. **什么是功能性磁共振成像（fMRI）？** fMRI是一种利用磁共振成像技术研究大脑和脊髓功能的方法，可以揭示大脑和脊髓的结构、信息处理、整合及调节机制。我们之前已发表多篇关于fMRI在啮齿动物、非人类灵长类动物及人类中应用的研究，这些研究不仅展示了fMRI在研究脊髓功能结构方面的强大能力，还揭示了不同物种间功能组织模式的差异。
2. **为什么使用高分辨率fMRI？** 因为高分辨率fMRI能够提供更精细的结构信息，有助于更准确地检测脊髓内的功能变化。
3. **为什么选择大鼠作为实验对象？** 大鼠的脊髓结构与人类相似，且易于操作，适合进行相关研究。
4. **fMRI在疼痛研究中的应用前景如何？** fMRI为疼痛机制的研究提供了新见解，有助于开发有效的疼痛管理策略（如脊髓刺激），并对损伤后的变化有重要意义。
5. **本研究的主要发现是什么？** 本研究识别了大鼠脊髓中参与伤害性热处理的区域，并描绘了这些区域的功能连接。分析中包含了来自9只大鼠和26次实验的数据。激活区域在群体激活图上被标记为ROI 1至ROI 3。ROI 4由一个白色方框标出，代表一个白质ROI。灰质与白质的边界由黄色线条标出。白色虚线表示表层（层I-II）、深层（层III-IV）和中间层（层VI）之间的大致边界。(B) 提取了ROI 1和白质ROI 4在切片2中的平均BOLD信号变化时间过程。热刺激以15秒开启、30秒关闭的周期呈现。表1 - 根据刺激范式，激活区域对应的平均信号变化百分比。感兴趣区域 ROI 1 (L3) ROI 2 (L3) ROI 3 (L4) ROI 4 (WM) %信号变化 5.28 ± 2.63 4.15 ± 2.10 0.63 ± 0.86 0 ± 0.78 ROI是感兴趣的区域。BOLD时间过程显示出标准的心血流动力学响应函数。ROI 1的信号变化在刺激开始后大约15秒达到峰值。ROI 2的时间过程在12.8秒达到峰值，而ROI 3在15秒达到峰值。相比之下，从WM（ROI 4）提取的时间过程在基线附近没有显著的信号波动。3.3. 不同动物之间可重复的静息态相关模式 我们使用放置在L4段背侧或腹侧GM角中心的种子，检查了5只代表性大鼠的体素级静息态相关图。应用r > 0.55的显示阈值，我们观察到LD-RD和LV-RV之间一致且可重复的强rsFC。在一些大鼠中，例如大鼠3，也检测到RD-RV之间或RD与中间区域之间的强相关性（图3）。图3：在切片4（L4）中，使用r > 0.55的阈值，5只代表性动物的种子级相关图的示例。种子体素用黑色星号标记。3.4. 脊髓节段内和节段间灰质角之间的功能连接 在切片2（L3）、切片3（L3/L4）或切片4（L4）内，LV-RV之间的rsFC强度（分别为r = 0.50、0.53、0.52）显著强于LD-RV（r = 0.36、0.36、0.33）和LV-RD（r = 0.33、0.33、0.20）（图4）。对于L3段，LD-RD（r = 0.46）的相关性强于LV-RD（r = 0.33）（P < 0.05）。对于L4段，观察到LD-RD（r = 0.44）与RD-LV（r = 0.20）或RD-RV（r = 0.21）之间的相关性显著更强（P < 0.01）。然而，在L3/L4处，没有GM角与LD-RD（r = 0.46）显示出显著的相关性。在切片2-3上平均的RD-LV/RD-RV的rsFC强度（分别为r = 0.33和0.41）显著高于切片4的rsFC强度（r = 0.20和0.21；P < 0.05）。作为对照，背侧或腹侧角与WM ROI之间的相关性明显较弱（图4中的最后两列灰色阴影）。图4：3个切片（L3–L4）上脊髓角之间相关系数的箱形图。（A–C）中心线代表数据的中位数；须状线代表数据第三四分位数与第一四分位数之间1.5倍范围内的值。平均值用“+”标出。点代表异常值。*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001，****P < 0.0001（Mann-Whitney–Wilcoxon检验，Bonferroni校正）；量化数据来自9只大鼠和40次实验。LD代表左背侧角；LV代表左腹侧角；RD代表右背侧角；RV代表右腹侧角；WM代表白质。我们还在L3-L4段相邻切片上量化了相应GM角之间的相关系数，如图5A所示。相邻切片上GM角之间的平均r值约为0.001（图5B），没有检测到显著差异。图5：相邻切片上脊髓灰质角之间节段间功能连接性的群体分析。（A）节段间成对比较的示意图。（B）切片2和切片3之间的角与切片3和切片4之间的角的r值的箱形图。3.5. 节段内灰质角之间功能连接的可重复性 比较了所有9只大鼠的奇数次和偶数次实验中rsFC的R值，如图6（每个子图的左侧面板）所示。所有6对GM角之间的显著相关性都被观察到。其中，LD-RD（r = 0.83，P < 0.0001）和LV-RV（r = 0.71，P = 0.0007）在L3到L4脊髓之间的可重复性最高。此外，LD-LV（r = 0.61，P = 0.0042）、LD-RV（r = 0.60，P = 0.0053）、LV-RD（r = 0.67，P = 0.0011）和RD-RV（r = 0.60，P = 0.0001）的可重复性之间没有显著差异。在所有6对ROI中都观察到了可重复的角-角rsFC，尽管其强度有所不同。Bland-Altman图（每个子图的右侧面板）展示了奇数次和偶数次实验之间的一致性。我们发现LD-RD和LV-RV对在奇数次和偶数次实验之间的R值差异相对较小。图6：奇数次和偶数次实验之间角-角相关系数的箱形图。散点图显示了奇数次实验的r值与偶数次实验（左侧面板）和Bland-Altman图显示了奇数次和偶数次实验之间的R值差异与偶数次和奇数次实验的平均r值（右侧面板）：（A）LD-LV，（B）LD-RD，（C）LD-RV，（D）LV-RV，（E）RV-RD，（F）RV-RD。每个点代表来自相邻奇数次和偶数次实验的切片2至4的平均r值。在散点图中，实线代表最佳拟合线。在Bland-Altman图中，实线代表奇数组和偶数组之间的平均差异，虚线显示95%的同意限。3.6. 热刺激后的功能连接变化 我们还比较了大约30分钟热刺激前后的切片内角-角rsFCs，并在切片2（L3）和切片3（L3/L4）没有观察到显著差异（图7A和B）。然而，在切片4（L4），热刺激导致LD和RV之间的相关性显著下降，r值从0.39降至0.20（图7C）。图7：比较了左后肢热刺激前后脊髓灰质角之间平均r值的箱形图。A）切片2、（B）切片3和（C）切片4中热刺激前后的角间r值。*P < 0.05（Mann-Whitney–Wilcoxon检验，Bonferroni校正）。3.7. 痛觉热处理区域之间的静息态功能连接 为了确定参与痛觉热处理的背角区域是否表现出更强的rsFC，我们量化了表现出热刺激BOLD激活的脊髓区域之间的相关强度。图8A显示了3个热响应ROI（ROI 1–3，如图2所示）之间的r值的箱形图。ROI 1和ROI 2之间的静息态功能连接强度（r = 0.68）显著高于切片2中的LD-RD（r = 0.47）（图8A和B）。然而，ROI 1-ROI 3与ROI 2-ROI 3之间的相关值接近0（图8A），并且与切片2和切片4之间的RDs之间的节段间相关强度没有显著差异（图8C）。图8：功能上根据解剖学定义的ROI之间的功能连接比较。（A）热响应ROI 1至3之间的r值的箱形图。（B）切片2和切片3之间的角与切片3和切片4之间的角之间的r值。4.1. 腰部脊髓内的痛觉热处理网络 在腰部L4脊髓中，观察到相同侧背角（LD）的局部fMRI激活，其中后爪受到了47.5°C的有害热刺激。这一观察结果与先前在大鼠腰部脊髓、非人类灵长类动物（NHP）颈部脊髓和人类颈部脊髓中的报告一致。它进一步证实了与单侧有害热刺激同侧的背角是来自后肢的痛觉输入的主要处理站。在这项研究中，后爪的热刺激（47.5°C）主要在L4相同侧背角的深层以及L3段的双侧深层和中间区域引发了fMRI激活（图2）。这种整体激活模式与在非人类灵长类动物颈部脊髓和人类脊髓研究中的报告不同，在那些研究中，有害热引发的fMRI反应主要位于颈部脊髓扩大的表层。一个可能的解释是，深层主要处理大鼠腰部扩大的痛觉热信息。已知表层和深层都参与痛觉输入的处理，长时间的（15秒）有害热刺激可能激活了主要终止于大鼠腰部背角深层的传入神经元。此外，主要从背侧神经节根传递本体感觉信息到V层和VI层的Aα纤维也可能被47.5°C的热激活。传递来自下体的痛觉热输入到大脑的投射神经元分散在III-VI层。因此，Aδ和Aα纤维以及投射神经元都可能有助于检测到的深层痛觉热刺激引发的BOLD激活。与先前的研究一致，我们在刺激大鼠后爪时观察到了L4脊髓的fMRI激活。重要的是，我们观察到L3水平（切片2）的双侧背角深层和中间层也出现了热激活。已知L2/L3脊髓节段中存在高级整合处理回路。在L3脊髓中检测到的广泛双侧激活可能反映了其功能，并支持L3段可能作为控制后肢运动的腰部脊髓节段功能的前端调节中心的观点。未来需要对这些功能不同的脊髓节段进行解剖追踪和电生理学研究，以全面理解它们在痛觉处理和调节中的作用。4.2. 腰部脊髓内灰质角的内在功能连接网络 静息态fMRI数据分析使我们能够描述腰部脊髓内的内在功能连接模式。脊髓GM角之间的rsFC强度似乎在脊髓区域（颈部 vs 腰部）和物种之间是可比的。关于人类颈部脊髓的研究报告称，9.4T下GM角之间的切片内rsFC范围为0.18至0.44，在7T下为0.2至0.67。在大鼠脊髓中，它在颈部区域的范围为0.35至0.53，在本研究中为0.20至0.53。在人类腰部脊髓中，它在3T下的范围为0.22至0.64。在本研究中，我们检测到大鼠腰部脊髓中LD-RD和LV-RV之间强烈的内在rsFC，与我们组之前在大鼠颈部脊髓研究中的发现一致。这些较强的内在连接可能归因于它们在协调啮齿动物双侧肢体行为中的作用。相比之下，在人类颈部脊髓中，同一侧的背侧感觉角和腹侧运动角之间的连接更强。与NHP和人类相比，啮齿动物使用后肢的方式不同。这些角间连接强度的差异可能反映了啮齿动物和人类之间的功能和行为差异。人类肢体的行为可能更多地涉及同一侧的感觉和运动整合，而啮齿动物的肢体则更多地涉及双侧整合。颈部节段之间的内在rsFC强度略有变化，通常从C2到C8逐渐减小。然而，LD-RD和LV-RV之间的强连接模式保持不变。这一特征也在腰部脊髓中观察到。在这项研究中，我们观察到L4段的红髓（RD-LV）和RV之间的静息状态功能连接（rsFC）比更靠头端的段（L3）有所下降。关于灰质角（GMHs）之间的节段间连接性，我们没有发现显著的相关性，这与人类和大鼠颈椎的观察结果一致。然而，在非人灵长类动物中，已经观察到了强烈的节段间和角间连接性。我们假设这些物种间连接模式的不同反映了它们与行为密切相关的潜在功能组织。有趣的是，在我们的研究中，我们还观察到在处理热刺激后L4段GM连接之间的r值也有所下降。在非人灵长类动物的颈椎中，已经观察到rsFC网络的破坏和减弱。需要进一步研究热痛觉输入处理后GM区域之间连接减弱的原因。

在腰椎灰质角中，我们报告了大鼠腰椎脊髓中LD-RD和LV-RV连接之间的rsFC具有最高的重复性，而背侧-腹侧（LD-LV、RD-RV、LD-RV和RD-LV）比较之间的rsFC重复性则较弱。在7T的人类颈椎中也观察到了类似的模式。据报道，LV-RV和LD-RD连接之间的切片内rsFC重复性为0.71至0.83，而背侧-腹侧连接的重复性则为0.60至0.67（P < 0.05）。我们的研究还报告了所有GM角之间rsFC的显著高重复性，其中LV-RV连接的重复性低于LD-RD。这一发现与吴的研究结果相反，尽管使用了类似的成像采集和预处理协议。我们不认为这种差异是由于图像质量造成的，因为颈椎和腰椎fMRI图像的总信噪比（tSNR）和空间信噪比（SNR）没有显著差异。其他因素，如颈椎和腰椎脊髓之间的生物学差异，可能导致了这种变化。例如，据报道腰椎 cord中的运动神经元网络显示出更长的簇距离和更高的网络度，这可能意味着腹侧角之间的信号同步程度不同，从而降低了腰椎 cord中腹侧-腹侧rsFC的重复性。

在基于感兴趣区域（ROI）的rsFC分析中，ROI的选择对后续分析和解释至关重要。通常有两种方法来识别种子节点——使用解剖信息或功能信息。使用功能定义的ROI进行rsFC分析假设参与同一任务的脊髓区域可能表现出更强的同步rsfMRI信号波动。例如，我们之前对猴颈椎的研究表明，功能相关的区域表现出更强的rsFC。支持这一观点的是，我们发现3个痛觉处理区域（ROI 1-3）之间的静息状态相关性强度高于大鼠腰椎脊髓中解剖学定义的背侧角之间的相关性。具体来说，位于L3段灰质深层和中间层的ROI 1和ROI 2代表了响应热刺激而激活的区域。这两个区域在L3段内的rsFC显著高于LD-RD连接。这一发现与之前关于人类和非人灵长类动物（NHP）皮层区域以及NHP颈椎脊髓的研究结果一致。这进一步证明了参与相同功能的脊髓区域（如我们的热处理案例）表现出比解剖学定义的脊髓角更强的内在rsFC。此外，我们发现ROI 1与ROI 3、ROI 2与ROI 3之间的rsFC以及节段间GM角之间的rsFC相对较弱，r值接近0。在吴的大鼠颈椎研究中也观察到了移动一个切片后rsFC降低的现象。我们推测这可能是因为腰椎脊髓的一个亚段代表一个功能单位，因为超过一个切片覆盖了这个区域。

我们承认这项研究的样本量相对较小。与腰椎脊髓fMRI相关的两个主要技术挑战可能影响了我们的发现。第一个挑战是由胸部运动引起的运动伪影，这种现象在靠近肺部的脊髓段更为明显。尽管应用了运动校正，但这些伪影仍可能降低了这些段的tSNR，从而可能影响rsFC的估计以及由热刺激引起的BOLD信号变化的检测。第二个挑战涉及在成像脊髓小横截面积时出现的部分体积效应，这也可能降低SNR。在0.25 × 0.25 mm2的平面分辨率下，每个背侧角大约由5个体素采样。尽管存在这些限制，rsFC和热刺激诱发的BOLD信号变化仍然被稳健地检测到。我们将这种敏感性归因于高磁场强度（9.4 T）和使用了定制的表面线圈。

在这项研究中，我们使用9.4T的BOLD fMRI鉴定了两个痛觉处理区域：L3和L4的同侧背侧角以及L3的深层和中间区域。这些对热刺激有反应的区域表现出比解剖学定义的脊髓角更强的rsFC。与大鼠和灵长类动物颈椎的研究结果一致，我们观察到了双侧背侧和腹侧角之间的强静息状态功能连接，但没有观察到显著的节段间静息状态连接。

作者声明他们没有可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。