神经元代谢在生酮饮食改善硼替佐米诱导的疼痛性周围神经病变小鼠模型中的作用

《PAIN Reports》：Neuronal metabolism role in ketogenic diet improvements in bortezomib-induced painful peripheral neuropathy mouse model

　　**摘要**
**简要说明**
**引言：** 生酮饮食（KD）对多种神经系统疾病有益，包括不同类型的外周神经病变。硼替佐米（BTZ）是治疗多发性骨髓瘤的一线化疗药物，具有神经毒性，常导致化疗引起的周围神经病变（BIPN）。

**目的：** 本研究旨在探讨KD是否能够预防由硼替佐米引起的周围神经病变导致的小纤维神经病变和行为过敏。

**方法：** 雄性C57BL/6小鼠被分别喂食标准饲料或KD，持续10天。在KD实施的最初5天内，小鼠每天接受腹腔注射BTZ或安慰剂。第6天开始进行BTZ洗脱期，同时继续原有饮食。通过测量小鼠后爪对机械（von Frey）和冷（丙酮）刺激的反应，评估KD和BTZ治疗对行为敏感性的影响。收集足垫以分析表皮内神经纤维密度（IENFD），并采集腰背根神经节（lumbar DRG）进行体外神经突生长和细胞能量代谢分析。

**结果：** 与喂食标准饲料的BTZ处理小鼠相比，喂食KD的小鼠表现出较低的机械敏感性、正常的冷敏感性、保持的IENFD以及较低的细胞外酸化率。体外实验表明，预先用酮类物质处理的神经元能够抵抗BTZ引起的神经突退化。

**结论：** 研究结果表明，KD可以预防BIPN引起的IENFD下降、行为过敏和生物能量代谢变化，为KD作为BIPN的潜在治疗方法提供了证据。生酮饮食通过改变感觉神经元的生物能量代谢，可以缓解硼替佐米引起的疼痛性周围神经病变症状。

**通俗语言总结：** 本研究探讨了生酮饮食是否有助于预防由硼替佐米（一种用于治疗多发性骨髓瘤的化疗药物）引起的神经损伤和感觉问题。实验中，雄性小鼠在服用硼替佐米的同时，一部分被喂食标准饲料，另一部分被喂食KD。结果显示，喂食KD的小鼠对触觉和寒冷的敏感性较低，神经纤维密度保持正常，细胞能量功能更好。此外，实验还发现酮类物质能够在实验室环境中保护神经细胞免受损伤。这些发现表明，KD可能是一种有前景的治疗手段，有助于对抗硼替佐米引起的神经损伤。

**常见问题解答：**
1. **引言**
硼替佐米主要用于治疗多发性骨髓瘤的一线化疗药物。约30%至70%的接受该药物的患者会出现硼替佐米引起的周围神经病变（BIPN）。BIPN的症状包括疼痛、麻木、刺痛感和“袜套手套分布”样的温度敏感度改变。评估显示，BIPN患者的表皮内神经纤维密度（IENFD）降低，符合小纤维神经病变的特征。目前尚无有效的治疗方法，但常使用度洛西汀、加巴喷丁、三环类抗抑郁药和外用乳膏来缓解症状。BIPN可能导致剂量减少或停止治疗，从而影响患者的生活质量和生存率。虽然BIPN症状可能随时间缓解，但也可能长期存在且难以逆转。
硼替佐米具有细胞毒性，会增加腰背根神经节（DRG）神经元中的糖酵解过程，这两者都参与了BIPN的病理机制。维持神经细胞的代谢和能量平衡至关重要，失调会对细胞功能产生不良影响。研究表明，异常的糖酵解过程与疼痛有关，而糖酵解抑制可以缓解疼痛。目前关于酮类物质对周围神经病变中轴突退化和IENFD密度的影响的研究较少。
2. **材料和方法**
- **动物和饮食**：所有实验均经堪萨斯大学医学中心动物护理和使用委员会批准。使用Charles River Laboratories购买的8周龄C57BL/6雄性小鼠，饲养在14:10的光照周期环境中。小鼠可自由饮水，并分别喂食标准饲料或KD。
- **药物给药**：BTZ溶于0.5% DMSO中，随后稀释于0.9%生理盐水中，通过腹腔注射给药。
- **血液检测**：使用手持监测仪和β-羟基丁酸试纸测量血液酮水平。
- **机械敏感性测试**：使用尼龙单丝施加不同强度的弯曲力，评估小鼠后爪的反应。
- **冷敏感性测试**：用丙酮刺激后爪，记录反应次数。
- **表皮内神经纤维密度分析**：收集足垫，在Zamboni固定液中固定后，用苏糖糖溶液处理并切片检查。
- **神经突生长分析**：根据Malin等人方法，培养神经元并观察其生长情况。
- **细胞能量代谢分析**：使用Seahorse XFe96分析仪测定细胞外酸化率和线粒体氧消耗率。

**3. 结果**
喂食KD的硼替佐米处理小鼠表现出较低的机械敏感性、正常的冷敏感性、保持的IENFD以及较低的细胞外酸化率。小鼠对硼替佐米和生酮饮食的反应

在第一天，分别为各组提供了生酮饮食（图1A）。接受载体处理的生酮饮食小鼠在整个实验过程中没有显著的体重下降（图1B）。与接受载体处理的常规饮食小鼠相比，接受硼替佐米处理的生酮饮食小鼠在第3至5天的体重有显著差异，并且在第4和5天也与载体处理的生酮饮食小鼠有显著差异（图1B，双因素方差分析，重复测量，时间：P < 0.0001，组×时间：P < 0.0001）。然而，所有小鼠的体重仍在其年龄、性别和品系的健康范围内。在第10天采集了血液样本以确认生酮饮食小鼠已进入酮症状态。生酮饮食小鼠的血液酮体水平显著升高（图1C，双因素方差分析，饮食：P < 0.0001）。

图1：时间线及实验设计（A）、随时间变化的体重（*P < 0.05 硼替佐米-生酮饮食 vs 载体-常规饮食；#P < 0.05 硼替佐米-生酮饮食 vs 载体-生酮饮食）（B）以及血液酮体水平（C），n = 11至12。BTZ：硼替佐米；IENFD：表皮内神经纤维密度。

3.2. 生酮饮食减轻硼替佐米引起的外周神经病变症状

基线感觉行为测试（机械敏感性和寒冷敏感性）在第一天进行（图1A）。硼替佐米治疗和生酮饮食从第二天开始。图2A展示了使用von Frey尼龙单丝进行的机械敏感性测试。接受硼替佐米处理的常规饮食小鼠在第三天出现了机械性痛觉过敏，这种症状在整个实验期间持续存在（图2B；双因素方差分析，重复测量，组：P < 0.0001，组×时间：P < 0.0001，时间：P < 0.0001）。而生酮饮食则防止了硼替佐米处理小鼠出现机械性痛觉过敏，保持了与载体处理的常规饮食对照组相似的机械阈值。图2C显示了从基线开始的变化，进一步突出了各组之间的机械敏感性阈值差异（双因素方差分析，重复测量；组：P = 0.0005）。

图2：机械敏感性和寒冷敏感性的感觉行为测试示意图。图表显示了机械敏感性测试方案（A）。机械敏感性引起的爪子 withdrawal 阈值（*P < 0.05 硼替佐米-常规饮食 vs 载体-常规饮食；#P < 0.05 硼替佐米-生酮饮食 vs 载体-生酮饮食）（B）以及从基线开始的变化（C）。图表还展示了寒冷敏感性测试方案（D）以及痛觉行为频率（*P < 0.05 vs 载体-常规饮食；#P < 0.05 vs 载体-生酮饮食）（E）以及寒冷敏感性的变化（F），n = 11–12。BTZ：硼替佐米；PWT：爪子 withdrawal 阈值。

评估寒冷敏感性显示，接受载体处理的常规饮食组与接受载体处理的生酮饮食组之间没有差异（图2D、E，双因素方差分析，重复测量，组：P < 0.0001，组×时间：P < 0.0001，时间：P < 0.0001）。与载体处理组相比，接受硼替佐米处理的组在第3和第6天痛觉行为（咬、舔和偏好）的频率显著增加（图2E，双因素方差分析，重复测量，组：P < 0.0001，组×时间：P < 0.0001，时间：P < 0.0001）。在第9天，接受硼替佐米处理的常规饮食小鼠的痛觉行为频率增加，但仍与载体处理组有显著差异（图2E）。在冲洗期，接受硼替佐米处理的生酮饮食组的反应减少，且与载体处理的常规饮食组无差异，但与接受载体处理的生酮饮食组有差异（图2E）。图2F显示了从基线开始的变化，表明接受硼替佐米处理的常规饮食小鼠的行为与其基线行为有显著变化（双因素方差分析，重复测量，组：P < 0.0001，组×时间：P < 0.0001，时间：P = 0.0082）。然而，到第9天时，接受硼替佐米处理的生酮饮食小鼠的行为变化恢复正常。

3.3. 生酮饮食防止硼替佐米引起的外周神经病变

由于硼替佐米会导致患者和啮齿动物的神经纤维丢失，我们测试了生酮饮食是否会影响硼替佐米引起的表皮内神经纤维密度（IENFD）的减少（图3A）。与所有组相比，接受硼替佐米处理的常规饮食动物的IENFD显著降低（图3B，双因素方差分析，饮食：P < 0.0001，药物×饮食交互作用：P < 0.0115）。与两个常规饮食组相比，接受载体处理的生酮饮食动物的DRG（背根神经节）的总面积与细胞体比率显著增加（图3C、D，双因素方差分析，饮食：P < 0.0008）。与载体处理的常规饮食动物相比，接受硼替佐米处理的生酮饮食动物的总面积与细胞体比率也显著增加。然而，仅比较总面积时，各组之间没有显著差异（图3D，双因素方差分析，P < 0.05）。

图3：(A)显示了所有小鼠组的IENFD代表性图像。刻度尺 = 10 μm。(B)展示了IENFD结果的量化（n = 9–10）。(C和D)展示了从DRG收获和培养中测量的神经突生长（n = 5–6只小鼠，3–6次复制）。(E–G)表示IENFD、感觉行为、血液酮体水平和DRG神经突生长之间的相关性。BTZ：硼替佐米；DRG：背根神经节；IENFD：表皮内神经纤维密度。

我们进行了IENFD水平与机械敏感性（图3E）以及IENFD与寒冷敏感性（图3F）之间的相关性分析。结果表明IENFD与机械敏感性（r = 0.4544，P < 0.0037）和寒冷敏感性（r = ?0.5819，P < 0.0001）之间存在显著相关性，这表明IENFD减少与更严重的行为变化相关。最后，我们测试了体内血液酮体水平与体外DRG神经突生长之间的关系（图3G）。结果显示，体内循环酮体水平与体外DRG神经突生长之间存在显著相关性（r = 0.5987，P < 0.0025）。这表明即使是在体外培养的情况下，酮体水平也能影响DRG轴突的特性，表明DRG神经元对升高的酮体水平表现出代谢记忆。

3.4. 生酮饮食抵消硼替佐米引起的代谢变化

先前的研究表明，硼替佐米会增加神经元中的糖酵解。我们测量了体内给药和饮食后DRG神经元的乙酸化能力（ECAR）和氧气消耗率（OCR）。结果显示，所有组的基线ECAR没有显著差异（图4A，双因素方差分析，重复测量，组：P = 0.0085，组×时间：P < 0.0001，时间：P < 0.0001）。然而，与所有其他组相比，接受硼替佐米处理的常规饮食小鼠的DRG神经元最大糖酵解能力和备用糖酵解能力显著增加（图4B，双因素方差分析，饮食：P = 0.0005，药物：P = 0.0194）。在OCR测量期间，基线线粒体呼吸没有显著差异（图4C，双因素方差分析，重复测量，P < 0.05），但在FCCP注射后，接受硼替佐米处理的常规饮食小鼠与载体处理的常规饮食小鼠之间有显著差异（图4C，双因素方差分析，重复测量，时间：P < 0.0001）。在特定的线粒体呼吸测量中，各组之间没有显著差异（图4D，双因素方差分析，P < 0.05）。

图4：对体外培养一晚的DRG神经元进行的代谢分析结果，n = 4只小鼠，4至8次复制。总体上，细胞外酸化率（*P < 0.05 硼替佐米-常规饮食 vs 载体-常规饮食；#P < 0.05 硼替佐米-生酮饮食）（A）以及特定的糖酵解测量（B）也被展示出来（C）。还测量了氧气消耗率（*P < 0.05 硼替佐米-常规饮食 vs 载体-常规饮食）（C），并展示了特定的线粒体呼吸测量（D）。ATP：三磷酸腺苷；BTZ：硼替佐米；DRG：背根神经节。

3.5. 酮体防止硼替佐米引起的神经突退化

我们进行了短期实验，以确定外源性提供的酮体是否可以防止体外硼替佐米引起的神经突退化（图5A、B）。结果显示，接受硼替佐米处理的DRG神经元的总面积与细胞体比率显著降低（图5C，单因素方差分析，组：P < 0.0001）。此外，当比较总面积时，酮体处理组的值显著高于所有其他组，包括对照组细胞（图5D，单因素方差分析，组：P < 0.0001）。最后，接受硼替佐米-酮体处理的组比接受硼替佐米处理的组更高，但仍然显著低于对照组和酮体处理组（图5D；单因素方差分析，组：P < 0.0001）。

图5：体外研究的时间线示意图（A），n = 4只小鼠，3次复制。刻度尺 = 500 μm。(B)展示了腰段DRG神经突的代表性照片。(C和D)显示了总面积与细胞体比率（C）和总面积（D）的结果。BTZ：硼替佐米；DRG：背根神经节。

4. 讨论

化疗引起的外周神经病变（CIPN）是使用化疗药物治疗癌症患者时的一个重要障碍，需要新的治疗方法来减轻化疗药物引起的神经病变副作用。硼替佐米是一个典型的例子，因为使用硼替佐米治疗多发性骨髓瘤时受BIPN的影响非常大。在这里，我们证明了生酮饮食和酮体可以在短期内快速发展的BIPN过程中预防BIPN症状、表皮内神经纤维密度（IENF）的损失和神经突退化。我们还确认了硼替佐米会增加糖酵解，这可能与BIPN中观察到的痛觉和疼痛症状的发展有关。我们的数据表明，生酮饮食的摄入可以防止这种糖酵解的增加，表明这种能量代谢变化在神经病变的神经激活中起作用。另一项在大鼠紫杉醇诱导的外周神经病变模型中进行的研究表明，对于脂质代谢至关重要的PPARγ参与了酮体益处的机制。他们的研究还指出，生酮饮食减少了TLR4-NFκB途径中的促炎细胞因子表达，并显著增强了不同表达基因中的氧化磷酸化途径。这项研究支持了我们的观点，即代谢在生酮饮食对神经元的好处中起关键作用，这些结果进一步证明了生酮饮食对多种神经病变条件的改善作用。

4.1. 动物对生酮饮食耐受良好并诱导酮症

生酮饮食是可持续和可维持的，但其物流负担和口感可能对某些个体来说是个负担。我们的分析表明，小鼠能够耐受生酮饮食，因为接受硼替佐米处理的生酮饮食小鼠的体重显著低于接受载体处理的生酮饮食小鼠；所有小鼠在整个研究期间都保持在健康体重范围内。两组生酮饮食小鼠的血液酮体水平均显著升高，表明它们已进入酮症状态。

4.2. 生酮饮食防止硼替佐米引起的机械敏感性和寒冷敏感性

已知硼替佐米治疗会在动物中引起痛觉，并在人类中导致痛苦的BIPN。先前的研究表明，接受硼替佐米处理的动物通常不会发展出热敏感性，而是会出现寒冷敏感性。因此我们也测量了寒冷敏感性。在这里，硼替佐米在常规饮食动物中引起了机械敏感性过敏，这种过敏在整个研究期间持续存在；然而，它没有影响生酮饮食小鼠。有趣的是，硼替佐米在常规饮食和生酮饮食动物中都以不同程度引起了寒冷敏感性。在冲洗期，生酮饮食动物的寒冷敏感性有所恢复，而常规饮食小鼠的敏感性则持续上升。鉴于不同类型的神经纤维和机制的作用，生酮饮食可能预防了机械性痛觉过敏，但仅缓解了寒冷敏感性。这些神经元表型之间的差异需要进一步探讨。

4.3. 硼替佐米导致神经纤维丢失，但生酮饮食可以防止这种丢失

先前的研究表明，硼替佐米会降低IENFD水平。我们实验室之前的研究表明，生酮饮食可以防止DPN（糖尿病性周围神经病变）小鼠模型中的IENFD减少。在这里，我们的结果显示，硼替佐米在短时间内会引起显著的神经纤维丢失，这与我们之前关于1型糖尿病、2型糖尿病和高脂肪饮食引起的IENFD减少的研究结果一致。重要的是，通过摄入生酮饮食可以预防硼替佐米引起的神经纤维丢失。此外，从生酮饮食小鼠中提取的神经突在体外培养时具有更高的生长能力。尽管机制尚不清楚，但这强烈表明生酮饮食可以通过改善代谢记忆产生持久效果，未来需要研究代谢记忆的机制及其持续时间。这对于将生酮饮食临床应用于CIPN（化疗引起的周围神经病变）至关重要。生酮饮食可以抑制硼替佐米（Bortezomib）对背根神经节（dorsal root ganglia, DRG）神经元代谢变化的影响。在这项针对C57BL/6小鼠的研究中，发现硼替佐米的给药会增加DRG神经元中的ECAR（能量消耗率）。这些结果与另一项使用硼替佐米诱发ICR小鼠疼痛的研究一致，那项研究首次报告了糖酵解过程的变化。我们的研究结果强烈支持了这一发现，表明与所有其他组相比，硼替佐米显著增加了DRG神经元的最大糖酵解能力和备用糖酵解能力。这表明硼替佐米可能使神经元的能量代谢状态向糖酵解方向转变，这可能是硼替佐米给药后小鼠出现疼痛感觉的原因之一。另有证据表明，无序的糖酵解会导致神经元功能异常，并引发“糖酵解性疼痛”，而抑制过度的糖酵解可以减轻各种疼痛症状。我们的研究还发现，生酮饮食能够阻止硼替佐米引起的糖酵解增加，这说明生酮饮食的一个作用可能是通过调节生物能量代谢来防止糖酵解的加剧。这与酮体可以直接被神经元线粒体利用的观点一致，从而绕过了糖酵解过程中丙酮酸生成腺苷酸环化酶的步骤。尽管我们的研究未观察到酮体或硼替佐米对氧化还原电位（OCR）的影响，但酮体对糖酵解的抑制可能具有积极作用，因为已证实乙酰乙酸能够抑制葡萄糖的摄取和后续的糖酵解反应。此外，培养基中添加的谷氨酰胺可以被线粒体代谢利用，这可能会掩盖OCR的差异。未来的研究应该探讨谷氨酰胺对神经元生物能量的影响。同时，我们的培养物并非纯神经元，未来的研究还应考虑非神经元细胞的作用。我们还需意识到，体内酮体水平的升高可能会在体外培养的细胞中引发代谢适应，从而影响实验结果。

4.5. 酮体可促进神经元生长并防止硼替佐米引起的神经突起退化
已知硼替佐米在体外会导致神经突起退化，但关于如何防止这种情况的研究很少。我们实验室之前的研究表明，酮体可以在体外促进神经突起的生长。在本研究中，于硼替佐米给药前两天加入酮体显著减少了神经突起的损失，这支持了酮体在体内对神经突起保护的机制，并表明酮体可能通过改变神经元的生物能量代谢来发挥保护作用。

5. 研究局限性
我们仅关注了较短的时间过程来观察感觉行为、神经突起生长（IENFD）和细胞生物能量的变化。这种研究方法无法反映患者在实际接受硼替佐米治疗期间的持续时长。未来的研究应延长时间跨度，以更全面地观察疼痛感觉和细胞生物能量的变化，并评估重复给药或外源性酮体的影响。此外，给予啮齿动物的生酮饮食可能会导致蛋白质缺乏，从而引发与蛋白质缺乏相关的信号通路激活，这些作用可能与酮体的直接效应无关。进一步的研究可以探讨酮体的代谢过程及其受抑制后的影响。另外，我们的实验仅针对雄性小鼠进行，虽然目前没有证据表明人类或啮齿动物在性别上对硼替佐米的反应存在差异，但针对雌性小鼠的额外研究也是必要的。最近的研究发现，酮体在减肥效果上存在性别差异，这些差异可能与性激素、神经递质、遗传因素和肠道微生物群等因素有关。为了避免潜在的禁忌症，患者在开始生酮饮食前應咨询医生，以确保得到适当的教育和指导。

6. 结论
我们的研究表明，硼替佐米会导致远端轴突的快速退化，而生酮饮食可以防止这种退化，同时还能减轻机械性痛觉过敏（mechanical allodynia）和神经元向糖酵解状态的转变。此外，酮体还可以在体外阻止硼替佐米引起的神经突起退化。这项研究强调了生酮饮食在Bipolar Insulin Resistance Neuropathy (BIPN) 模型中的益处，并揭示了可能在神经病变中发挥作用的生物能量代谢变化。未来的研究可以探讨生酮饮食对BIPN的干预效果，或者研究更早期的预防措施。最后，还应进一步探讨药物和饮食对DRG神经元代谢变化的详细机制。