激活C-伤害感受器的最佳电正弦频率刺激

《PAIN Reports》：Optimum electrical sinusoidal frequency stimulation to activate C-nociceptors

　　**摘要**
**通俗语言总结**

**引言**：研究表明，电脉冲正弦波刺激能够可靠地激活C纤维。本研究探讨了引起C型痛觉感受器反应的最佳正弦波频率。

**目的**：确定激活猪体内单个C型痛觉感受器的最佳正弦波频率，并诱发人类的疼痛反应及轴突反射。

**方法**：在猪的隐静脉中，记录了60根C纤维在频率为3至100 Hz、幅度递增的经皮正弦波电刺激下的反应。在22名人类受试者中，施加了30个频率为3至20 Hz、幅度在0.0125至0.4 mA之间的正弦波脉冲，每4秒监测一次疼痛感知（采用数字评分量表0–10）和轴突反射（使用全场激光灌注成像技术）。

**结果**：与频率高于10 Hz的情况相比，频率低于8 Hz时更容易激活C型痛觉感受器（其中36根为“多模式”[对机械和热敏感]、15根为“极高阈值”类型，9根为“沉默”[对机械不敏感]）。在人类中，疼痛反应和轴突反射也具有频率依赖性。在4 Hz频率下，疼痛感知评估最为敏感。在0.2 mA的刺激幅度下，疼痛评分最高。仅有在4 Hz和8 Hz频率下，且在0.05和0.1 mA的低幅度下，才观察到显著的轴突反射反应。

**结论**：频率在3至8 Hz之间的正弦波比频率高于10 Hz的刺激更适于激活C型痛觉感受器，有望有助于对志愿者和慢性疼痛患者的C型痛觉感受器进行功能评估。

**通俗语言总结**
本研究旨在寻找激活C型痛觉感受器的最佳正弦波频率。C型痛觉感受器是参与疼痛感知的神经纤维。研究人员在猪和人类身上测试了不同的频率。在猪身上，C型痛觉感受器对频率低于8 Hz的刺激反应更为明显；在人类中，疼痛和皮肤反应同样依赖于频率，其中3至6 Hz频率下的疼痛反应最显著。这些发现表明，频率在3至8 Hz之间最适于激活C型痛觉感受器，有助于评估志愿者和慢性疼痛患者的疼痛反应。

**常见问题解答**
1. **引言**：传统上，矩形波刺激用于控制人类的经皮电刺激以激活皮肤神经纤维。初级传入神经纤维的激活程度取决于轴突的髓鞘化程度。大口径神经元（A型纤维）的电激活阈值很低，而非髓鞘化的神经元（C型纤维）的阈值较高。高电激活阈值可能是C型痛觉感受器刺激的限制因素，尤其是在疼痛患者的评估中。此外，电矩形脉冲刺激A型纤维还会减少C型纤维信号在脊髓中的处理（“门控”作用）。将电刺激方式改为正弦波可以提高经皮神经元激活的效果。将电极类型从标准贴片电极改为小直径针状电极也被证明能更有效地激活痛觉纤维。经皮电刺激的脉冲持续时间和频率也会影响神经元激活强度。改变电刺激波形并结合针状电极配置，可以针对性地激活非髓鞘化的C型痛觉感受器，并有助于评估神经病变疼痛或慢性瘙痒患者中的C型痛觉感受器功能。

2. **方法**
- **动物实验**：使用12只12±4周大的德国长白猪（平均体重20–25公斤），进行麻醉并监测其心肺功能和体温，然后通过机械通气维持生命体征。清洁消毒后，在隐静脉中部切开皮肤，暴露出6厘米长的神经段进行记录。该实验获得了德国巴登-符腾堡州卡尔斯鲁厄地区的伦理委员会的批准（批准编号G-78/18），并在海德堡大学曼海姆医学院进行。
- **人类实验**：采用相同的心理物理方法和全场激光灌注成像技术（FLPI），在人类身上识别引发疼痛和轴突反射的最佳正弦波频率。
- **电极类型和刺激参数**：使用L形钝针状铂铱电极（直径0.4毫米，间距2毫米）进行经皮刺激；电刺激频率范围为3至100 Hz，脉冲持续时间为4秒（3 Hz）、3秒（4 Hz）、2秒（6 Hz）或1秒（10–100 Hz），幅度以0.01 mA为单位递增，直至记录到至少2次动作电位作为激活阈值。

3. **结论**：频率在3至8 Hz之间的正弦波比频率高于10 Hz的刺激更能有效激活C型痛觉感受器，有利于对其功能和慢性疼痛患者进行评估。在每个序列的基线扫描中确定了一个血液流量的截止值，以区分由电正弦波刺激引起的短暂血流增加。基线条件下的平均血液流量值加上2倍的标准差被定义为截止阈值，并在预期进行正弦波刺激的皮肤部位计算得出。每次刺激后，计算超出这一基线阈值的连续像素数量，这些像素被归类为轴突反射 flare 发生的区域，具体依据是在矩形 cardboard 校准区域内识别的像素数量。在40秒的扫描过程中记录的10张图像中，计算了轴突反射 flare的平均大小。为了避免电刺激后可能由于电极放置或从皮肤移除而产生的机械压力导致的皮肤血流伪影，每次 FLPI 序列的轴突反射 flare 分析都在刺激结束后8秒进行。在 FLPI 监测过程中，我们还记录了受试者对正弦波刺激的疼痛强度。与第一次会话的评估类似，志愿者被要求在10秒的正弦波刺激期间估计疼痛的强度（NRS评分范围为0到10）。

2.3 统计分析
数据使用 STATISTICA 7.1 软件包（StatSoft Inc，俄克拉荷马州塔尔萨）进行统计分析，包括 Shapiro-Wilk 检验以评估数据正态性，并进行方差分析，其中考虑了“频率”、“振幅”和“神经纤维类型”这三个因素。P值<0.05被认为是显著的。图形表示使用 GraphPad Prism 版本 10.4.3（GraphPad，马萨诸塞州波士顿）。CMH-、VHT- 和 CMi- 伤害感受器的单根神经纤维动作电位使用 DAPSYS 8.0 软件（DAPSYS；Brian Turnquist，明尼苏达州圣保罗市）进行分析，并确定了每个频率下至少需要多少振幅的正弦波电流才能引发2个动作电位。识别的振幅值还被归一化为所有频率下的平均刺激振幅。数据以平均值 ± 标准误差（mean ± SEM）的方式呈现。在人类实验中的数据（心理物理学和 FLPI 评估）通过方差分析和 Bonferroni 后续检验在“频率”和“振幅”因素上进行分析。Spearman 秩相关分析用于确定疼痛 NRS 与 FLPI 轴突反射 flare 之间的刺激振幅依赖性相关性。数据以平均值 ± 标准误差（mean ± SD）的方式呈现。

3. 结果
3.1 猪的单根神经纤维记录
共记录了36个“多模式”CMH-、15个VHT-和9个“静默”CMi-伤害感受器，分析了在3-4-6-8-10-20-50-100 Hz各测试频率下至少引发2个动作电位所需的正弦波电流幅度阈值。我们观察到这三种纤维类型的正弦波激活阈值存在显著差异（ANOVA F [2, 34] = 5.89, P < 0.0001），顺序为 CMH < VHT < CMi 伤害感受器（图3A）。激活阈值随频率的增加而增加，尤其是在10 Hz以上的正弦波频率下（图2A）。一般来说，3 Hz时C-伤害感受器的激活所需正弦波幅度最低，而在100 Hz时最高（ANOVA F [7, 252] = 12.4, P < 0.0001）。然而，“纤维类型”和“正弦波频率”这两个因素之间没有交互作用（2因素方差分析 F [14, 238] = 0.5, P > 0.9）。

图3：猪体内单根神经纤维记录。在不同频率（3至100 Hz）下施加正弦波刺激，以诱导至少2个动作电位，从而确定C-机械热敏感“多模式”（CMH，n = 36）、高阈值（VHT，n = 15）和C-机械不敏感“静默”（CMi，n = 9）伤害感受器的阈值幅度（mA）。频率低于6 Hz时，C-伤害感受器似乎需要较低的电流强度即可被激活。“多模式”CMH 伤害感受器的正弦波激活阈值低于VHT和“静默”CMi伤害感受器。应用的平均刺激振幅下的Delta激活阈值幅度（B）。虚线以下的值表示低于平均值的幅度，反之亦然。在20至100 Hz的正弦波频率下刺激C-伤害感受器需要显著更高的振幅。数据以平均值 ± 标准误差（mean ± SEM）呈现，星号表示P < 0.05（方差分析）。

为了更好地比较每种伤害感受器类型的正弦波激活频率依赖性，通过从给定频率下的刺激振幅中减去所有频率上的平均值来归一化正弦波激活阈值数据。因此，负值表示与总体平均振幅相比激活阈值较低（图3B）。我们观察到单根神经纤维激活所需的正弦波振幅存在显著的频率依赖性（ANOVA F [7, 245] = 11.742, P < 0.0001）。这种依赖性与记录的伤害感受器类型无关（ANOVA F [2, 33] = 0.0031, P > 0.9），且“纤维类型”和“正弦波频率”这两个因素之间也没有交互作用（2因素方差分析 F [14, 231] = 0.477, P > 0.9）。在8 Hz以下的正弦波频率下，激发猪伤害感受器所需的电流幅度低于平均激发电流，并且与20至100 Hz刺激下记录的阈值相比显著较低（图3B）。

3.2 受试者的疼痛和轴突反射红斑
进行了两次独立的会话来评估人类对正弦波频率-振幅依赖性伤害感受器激活的反应。

3.2.1 第一次会话
3.2.1.1 心理物理学
在我们的正弦波频率-振幅刺激心理物理学评估中，我们应用了持续10秒、振幅从0.0125 mA到0.4 mA的正弦波刺激，并以随机选择的频率3-4-6-8-10-20 Hz进行施加。无论频率如何，大约80%的受试者感觉不到0.0125 mA的刺激强度，约20%的受试者感觉不到0.025 mA的强度，而0.5 mA的振幅几乎所有受试者都感到轻微的疼痛（图4）。进一步增加正弦波振幅显著增强了疼痛感（ANOVA, F [5, 105] = 81.3, P < 0.0001）。

图4：在正弦波频率-振幅依赖性刺激期间个体NRS记录。22名受试者在3至20 Hz频率下接受0.0125至0.4 mA振幅的30次经皮电脉冲刺激时的疼痛NRS评分（数值评分范围，0-10）。水平线表示所有受试者的平均NRS值。虚线以下的值（NRS 0）表示未感觉到刺激。大多数受试者认为0.05 mA的刺激略带疼痛（NRS > 0），并且刺激振幅的增加加剧了疼痛感。疼痛强度显著依赖于正弦波脉冲的频率（ANOVA, F [5, 105] = 10.1, P < 0.0001），“正弦波频率”和“刺激振幅”这两个因素之间存在强烈的交互作用（2因素方差分析 F [25, 525] = 2.02, P < 0.003）。值得注意的是，在超过6 Hz的频率下，当脉冲达到0.1至0.4 mA的阈值刺激幅度时，疼痛评分较低（图5A）。例如，与3 Hz、4 Hz或6 Hz相比，20 Hz的正弦波脉冲引起的疼痛NRS显著较低（NRS 4.3 ± 0.5 vs NRS 4.7 ± 0.4，Bonferroni 后续检验 P < 0.05，图4A）。即使在将疼痛评分归一化到NRS平均值后，较高正弦波频率下的疼痛评分也较低（图5B）。在0.1至0.4 mA的正弦波振幅下，3至6 Hz频率下的疼痛评分明显高于平均值，而在8至20 Hz频率下的疼痛评分低于平均值。

图5：正弦波频率-振幅依赖性疼痛的心理物理学。不同频率（3至20 Hz）和振幅（0.0125至0.4 mA）下施加的30次正弦波刺激的疼痛NRS（A）和Delta平均NRS（B）的幅度。疼痛强度显著依赖于施加的正弦波频率和振幅（2因素方差分析交互作用 P < 0.003）（A），特别是在20 Hz时与3至6 Hz相比（星号标记，Bonferroni 后续检验 P < 0.05）。将疼痛NRS归一化到Delta平均NRS（虚线）（B）后，发现20 Hz频率下的阈值刺激引起的疼痛评分显著更高。

3.2.2 第二次会话
3.2.2.1 全场激光灌注成像
与第一次会话类似，我们以3至20 Hz的频率施加了持续10秒的正弦波脉冲。对于每个频率，从最低（0.0125 mA）到最高（0.2 mA）逐渐增加振幅的刺激，以确定引发轴突反射flare所需的最小刺激幅度。在少数受试者中，0.2 mA的振幅未能引发明显的flare反应（n = 9），因此最终使用了0.4 mA。增加正弦波振幅在任何刺激频率下都能增强flare的发展（ANOVA F [4, 424] = 141.8, P < 0.0001）。在0.1 mA及以上的正弦波振幅下观察到超过1 cm2的血管扩张面积（图6A）。flare反应至少持续3分钟，在0.2 mA时覆盖面积为2.7 ± 0.3 cm2（n = 13），在0.4 mA时覆盖面积为3.8 ± 0.2 cm2（n = 9）。我们观察到高频率的正弦波刺激导致的flare反应比低频率的刺激更小（图6B），并且确定了“正弦波频率”和“刺激振幅”这两个因素之间的显著交互作用（2因素方差分析 F [20, 404] = 1.63, P < 0.05）。特别是在0.2 mA的振幅下，20 Hz时的flare反应（1.7 ± 0.2 cm2）比3 Hz时的反应更小（Bonferroni 后续检验，P < 0.03）。此外，在20 Hz刺激下的血管扩张比3 Hz刺激下的要小（3.2 ± 0.6 cm2 vs 5.2 ± 0.7 cm2，n = 9），但这一差异不显著（ANOVA F [5, 53] = 0.82, P > 0.5）。

图6：全场激光灌注成像显示的轴突反射flare区域。使用全场激光灌注成像在40秒内记录的轴突反射 flare区域的平均值，响应于10秒的正弦波刺激周期。3至20 Hz频率下的正弦波刺激引发了刺激幅度依赖性的血管扩张（方差分析，P < 0.0001）（A）以及“正弦波频率”和“刺激振幅”之间的显著交互作用（2因素方差分析，P < 0.05）（B）。20 Hz频率的电刺激引发的flare反应尤其较小，与3 Hz刺激相比（Bonferroni 后续检验，P < 0.03）（B）。请注意，仅在n = 9名受试者中施加了0.4 mA的正弦波振幅。数据以平均值 ± 标准误差（mean ± SEM）呈现。

3.2.3 心理物理学与全场激光灌注成像轴突反射 flare 的相关性
在第二次会话中，我们还评估了对正弦波刺激的疼痛反应，并将NRS值与FLPI评估的轴突反射面积进行了相关性分析（图7）。与上述结果一致，增加刺激幅度增强了疼痛感（见第一次会话），同时也增加了相应的flare反应。每种刺激频率下的疼痛和flare之间都存在显著相关性，其中8 Hz和10 Hz时的相关性最强（Spearman 秩相关 r = 0.72, P < 0.05），而在4 Hz刺激下的相关性较弱（r = 0.58, P < 0.05）。

图7：疼痛NRS与FLPI轴突反射面积的相关性。在3至20 Hz频率下，使用0.0125至0.4 mA的刺激幅度引起的电气正弦波疼痛NRS（最大10）和相应的FLPI轴突反射面积（cm2）之间的相关系数（r = 0.58至0.72，P < 0.05）。请注意，仅在n = 9名受试者中施加了0.4 mA的正弦波振幅。数值评分范围中低于0的值表示受试者未感觉到刺激，NRS值为0表示感觉到刺激但不觉得疼痛。FLPI，全场激光灌注图像；NRS，数值评分范围。

4.讨论：在本研究中，我们确定了猪体内C-伤害感受器电激活的最佳正弦频率。此外，我们还旨在确定最适合激活人类C-伤害感受器的正弦刺激参数，并记录了疼痛和轴突反射反应。这一知识可以应用于临床，以便更有效地评估疼痛患者的伤害感受器。

4.1 猪的单一神经纤维记录：在记录C-伤害感受器时，我们发现“多模式”（HT-）纤维的电正弦激活阈值低于“非常高阈值”（VHT-）和“沉默”C-纤维。这一发现与我们之前在猪的经皮和人类皮肤内电正弦刺激（4Hz）观察到的结果一致。显然，刺激C-伤害感受器所需的电脉冲阈值幅度取决于其距离神经纤维末端或轴突的距离。因此，可以推测HT-纤维比VHT-或“沉默”伤害感受器位于更浅的位置，因此应更容易被经皮电刺激激活（特别是考虑到电流向深层组织的扩散是呈指数衰减的）。然而，只要没有特定的标记物来区分C-伤害感受器的亚型以验证它们在表皮分支中的深度差异，这个问题就无法得到解决。C-伤害感受器的激活程度取决于施加的正弦频率，较高频率需要更大的幅度来触发动作电位。这种激活阈值的增加与所记录的C-伤害感受器类型无关。相比之下，通过经皮施加的电矩形脉冲刺激时，猪的C-伤害感受器类型之间显示出不同的频率响应模式，这可用于区分C-纤维。这种频率依赖性的兴奋特性很可能与C-伤害感受器上表达的电压门控钠通道亚型的独特激活/失活动力学有关。目前尚不清楚这种机制是否也适用于我们的电正弦刺激。随着正弦刺激频率的增加（幅度不变），每个周期的波形更接近矩形脉冲。因此，分析动作电位在正弦周期的哪个阶段发生（这决定了电荷积累和动作电位生成的时间）将非常有趣，以确定这一过程是否也取决于正弦频率。频率在3到8Hz之间时，电荷积累时间约为60到160毫秒。在此时间窗口内，被动和主动成分可能促进C-纤维的激活。被动成分由C-纤维膜的时间常数驱动，大约为100毫秒，在机械敏感和机械不敏感的人类伤害感受器之间没有差异。主动成分可能涉及电压依赖性钠通道NaV1的表达，该通道在慢速去极化过程中（<100毫秒）产生坡度电流。另一个可能的机制是正弦波刺激的超极化部分，它通过超极化激活的环核苷酸门控通道产生内向电流。这些通道在节律性振荡活动中（例如在丘脑中，约0.5到4Hz）提供起搏去极化，可能被正弦波的超极化周期激活，从而促进随后的去极化阶段。然而，由于我们在记录过程中没有使用药物干预，因此无法阐明优化正弦频率刺激的潜在机制。

4.2 人类的心理物理学和轴突反射反应评估：我们没有观察到不同刺激频率之间的疼痛阈值明显差异，因为受试者对0.05 mA的幅度仅有轻微疼痛感，而0.1 mA的幅度在所有测试频率下都明显超过疼痛阈值。然而，在较高幅度下，超过8 Hz的正弦频率（尤其是20 Hz）被认为比3到6 Hz的低频率引起的疼痛感更小。人们可能会认为这是由于C-伤害感受器对高频放电的响应能力较低，特别是对于“沉默”C-纤维，它们在长时间（5 Hz）刺激下具有特征性的传导阻滞，但这显然无法通过心理物理学方法验证。我们的轴突反射反应测量客观地评估了“沉默”C-伤害感受器的激活情况。我们之前已经证明，在4 Hz（50个周期）和0.2 mA幅度下，电正弦刺激会导致显著的皮肤血流和红斑反应，但通过FLPI记录（能够高时间分辨率地即时评估血管扩张），我们发现0.1 mA幅度下仅30个周期后就出现了轴突反射反应。将刺激幅度增加到0.2 mA后，扩张区域增大，并且这种血管扩张持续了几分钟，表明激活的伤害感受器末端释放了降钙素基因相关肽。在这一幅度下，20 Hz刺激引起的反应明显小于3 Hz的较低正弦频率，这可能反映了较高频率下“沉默”C-伤害感受器的招募减少，这一现象也在猪的单一神经纤维记录中观察到。相关性分析表明，FLPI反应与每个正弦频率对应的疼痛评分之间存在强烈关联。这一结果一方面表明，任何正弦频率下的伤害感受器激活效率增加对“沉默”伤害感受器的反应同样有效；另一方面，表明“多模式”伤害感受器可能在疼痛反应中起主导作用。这些发现也与我们的神经生理学记录一致，我们发现C-伤害感受器的最佳正弦刺激频率为3到8 Hz，与纤维类型无关。

4.3 临床意义：最近的研究中，使用小型双极电极对慢性疼痛和瘙痒患者施加了4 Hz的电正弦刺激。在这些局部刺激下，0.2到0.4 mA的幅度在大约50%的患者中引起了显著的疼痛或瘙痒感。我们的研究证实，健康人类皮肤中C-伤害感受器的最佳正弦激活频率为3到8 Hz。这一频率范围也与早期使用5 Hz经皮正弦波刺激评估周围神经病变中C-纤维功能的尝试相符。在他们的研究中，5 Hz下的电流检测阈值达到几毫安，并与热阈值相关，但使用大面积接触电极（2平方厘米）阻止了选择性C-纤维的刺激。值得注意的是，我们最近报告称，即使热痛敏感性与局部辣椒素处理后被消除，仍然可以诱发电正弦刺激引起的疼痛，这表明即使热传导部位被阻断，电正弦刺激加上电极配置仍然能有效激活伤害感受器轴突。因此，优化的正弦电刺激可以作为一种额外的工具，用于评估慢性疼痛患者的C-纤维轴突的兴奋性。

披露：作者没有需要声明的利益冲突。