ATRX、DAXX、PDX1、ARX和生长抑素受体在胰腺神经内分泌肿瘤中的表达：一项临床病理学研究

《Frontiers in Endocrinology》：Expression of ATRX, DAXX, PDX1, ARX, and somatostatin receptors in pancreatic neuroendocrine tumors: a clinicopathological study

　　摘要背景：近期研究确定了ATRX/DAXX和PDX1/ARX作为定义新型胰腺神经内分泌肿瘤（PanNET）亚型的生物标志物，而生长抑素受体（SSTRs）的临床意义仍不完全清楚。方法：我们回顾性分析了58个经手术切除的原发性PanNET样本，并对ATRX、DAXX、ARX/PDX1和SSTR2a/5进行了免疫组化评估。主要目的是评估生物标志物表达与临床病理参数之间的关联。次要分析探讨了其与无复发生存（RFS）、癌症特异性生存（CSS）和总生存（OS）的关系。计算了定量表达评分，进行了接收者操作特征（ROC）曲线分析，并使用Kaplan–Meier分析评估了生存结果。结果：与非功能性PanNET病例相比，功能性PanNET病例中DAXX或ATRX表达的丢失更为常见（86.3% vs 13.7%）（p = 0.02）。SSTR5阳性的肿瘤与更长的中位OS（73个月 vs 7个月，p < 0.001）和RFS（36个月 vs 6个月，p = 0.005）相关。然而，Kaplan–Meier分析并未确认OS的差异（log-rank p = 0.078）。在≥2厘米的PanNET中，肿瘤大小为2.45厘米的临界值对ATRX/DAXX突变的敏感性为96.9%，特异性为75%（AUC 0.922，p = 0.007），在36名患者中。结论：ATRX/DAXX的丢失在非功能性PanNET中更为普遍（p = 0.02）。尽管SSTR5阳性的肿瘤与更长的中位OS相关，但这一差异未通过Kaplan–Meier分析得到证实。此外，肿瘤大小对≥2厘米的PanNET中ATRX/DAXX的丢失具有预测价值，强调了肿瘤形态与分子改变之间的关系，但这一发现仍属于假设性结论，需要进一步验证。

1 引言
神经内分泌肿瘤（NENs）是高度异质性的肿瘤，可发生在身体的多个部位，包括肺和胃肠道胰腺（GEP）部位。最新的2022年世界卫生组织（WHO）分类旨在通过将它们分为两类NENs来标准化其分类：分化良好的神经内分泌肿瘤或NETs和分化不良的肿瘤或神经内分泌癌（NECs）（1）。几十年来，胰腺NETs（PanNETs）的发病率增加了五倍，使其成为仅次于胰腺腺癌的第二大常见NENs类型（2–6）。PanNETs的表现范围从惰性病程到侵袭性行为不等，这从局部疾病（5年生存率93%）和晚期疾病（27%）之间的显著差异中可以看出（7, 8）。然而，与其他类型的NENs不同，PanNETs由于具有恶性潜力、更高分级或在诊断时已处于晚期（约65%），预后较差（2, 3, 9）。因此，有必要基于预后生物标志物识别PanNETs的新分子亚型，因为临床实践中使用临床病理标志物的效果有限。例如，肿瘤内异质性、采样问题以及解释错误可能影响有丝分裂指数和Ki-67的测量，特别是在活检样本中（10, 11）。此外，WHO 1级PanNETs患者也可能发生远处转移（12, 13），并且TNM（肿瘤、淋巴结、转移）分期并不总是具有预测性（14–16）。此外，广泛的数据库研究和荟萃分析尚未确认肿瘤大小作为独立的预后因素，尽管它被认为是术前的重要标志物（10, 17, 18）。
大多数NENs的一个关键特征是生长抑素（SST）受体（SSTRs）的过度表达，特别是SSTR2和SSTR5。通过利用SSTR表达，可以利用成像技术来评估原发肿瘤的位置以及转移的存在和范围（11）。此外，检测这些受体有助于识别潜在的治疗靶点，如生长抑素类似物（SSAs）或肽受体放射性核素疗法（PRRT）。免疫组化（IHC）分析是一种成本效益高且可靠的方法，用于检测NENs中的SSTR2和SSTR5。尽管SSTR2和SSTR5阳性可能与GEP-NENs的生存期延长相关，但很少有研究使用IHC精确定位和量化PanNETs中的SSTR2和5表达细胞。此外，SSTR亚型的差异表达模式及其与PanNETs临床病理特征的关联以及SSTR表达的整体病理意义仍不清楚（19, 20）。
近期研究强调了PanNETs不良预后与替代端粒延长（ALT）激活之间的显著相关性，这种激活由Death domain-associated protein（DAXX）或Alpha-thalassemia X-linked intellectual disability chromatin remodeler（ATRX）基因突变驱动（12, 21–24）。这些互斥突变导致表观遗传进展，增加术后复发的风险，并可能与ALT相关（22, 25）。ATRX和DAXX的突变会导致其蛋白质在细胞核中的表达丧失，这可以通过IHC进行评估（26）。PanNETs具有与胰腺导管腺癌不同的遗传特征，其中MEN1是最常见的突变，其次是ATRX或DAXX突变（约占40%的病例），以及mTOR通路的改变。虽然大多数PanNETs是散发性的，但有一部分发生在遗传综合征中，如多发性内分泌肿瘤1型（MEN 1）、Von Hippel-Lindau（VHL）和神经纤维瘤病1型（NF1）（27）。遗传性PanNETs患者从常规基因检测中受益，通常表现出更惰性的病程，影响预后和管理。然而，最近的研究还发现大约17%的PanNET患者在MUTYH、CHEK2、BRCA2、MEN1和VHL等基因中存在种系突变（28）。
尽管对于小于2厘米的肿瘤“观察等待”策略较为常见，但有15%的PanNETs存在淋巴结转移（12, 29, 30），这在关于基于肿瘤大小的监测与手术决策时是一个问题（25）。在这场持续的辩论中，评估ATRX/DAXX状态在管理小型PanNETs时具有临床价值，尤其是在具有MEN1等遗传综合征的患者中，因为其已证明的预后意义。ARX（aristaless-related homeobox gene）和PDX1（pancreatic and duodenal homeobox 1）转录因子调节α（α）和β（β）细胞的分化，并与ATRX/DAXX/MEN1（ADM）状态相关。根据这些模式，PanNETs可以分为α-like（MEN1突变，预后良好）、β-like（ADM野生型（WT），较不侵袭性）和中间型（DAXX/ATRX突变，与ALT激活相关）组（31）。免疫组化上，强ARX表达特征化α-like和中间型肿瘤，而PDX1阳性定义β-like肿瘤。因此，ARX/PDX1 IHC支持在PanNETs中识别细胞谱系（26, 32, 33）。
根据一项荟萃分析（34），ATRX/DAXX可以作为确定疾病临床进程和生存终点的指标，尽管将ARX/PDX1表达与生存联系起来或关联SSTR亚型表达仍存在争议（35）。虽然这些标志物的IHC可以成本效益高地补充已建立的预后生物标志物，但它们在罗马尼亚PanNET患者中的适用性仍是一个未解决的问题。因此，我们研究的主要目的是对诊断时的蛋白质表达进行全面分析，通过免疫标记ARX/PDX1和ATRX/DAXX以及SSTR2a和5，并结合标准临床病理因素。此外，我们的次要目标是评估ARX/PDX1、ATRX/DAXX和SSTR2a/5对PanNET患者临床结果的预后意义。

2 材料和方法
本研究是在手稿准备期间根据REMARK（36）和STROBE（37）指南进行的观察性研究。病例选择设计见表1。
表1 患者、治疗和变量研究及标志物备注
分类二元标志物
M1 ATRX = 0阴性，1阳性
M2 DAXX = 0阴性，1阳性
M3 ARX = 0阴性，1阳性
M4 PDX1 = 0阴性，1阳性
M5 SSTR2a = 0阴性，1阳性
M6 SSTR5 = 0阴性，1阳性
其他变量
V1=年龄，V2=性别，V3=分级，V4=Ki67指数，V5=大小，V6=分泌；V7=原发肿瘤，V8=其他非内分泌肿瘤
V9=pT分类，V10=pN（淋巴结侵犯），V11=神经周侵犯，V12=淋巴血管侵犯，V13=坏死
V14=转移，V15=远处同步转移，V16=远处异时转移，V17=肿瘤位置，V18=肿瘤分泌，V19=肿瘤遗传学，V20=转移数量，V21=局部复发，V22=切除状态，V23=总生存，V24=无复发生存，V25=癌症特异性生存，V26=SSA治疗，V27=手术前肿瘤大小（<2厘米；≥2厘米），V28=ATRX表达评分，V29=DAXX表达评分，V30=ARX表达评分，V31=PDX1表达评分，V32=SSTR2a表达评分，V33=SSTR5表达评分。
患者备注
符合条件的评估93
疾病：PanNETs，G1、G2分级
患者来源：2005-2023年，“Elias”和中央军事“Dr. Carol Davila”大学医院以及“Fundeni”临床研究所
样本来源：存档的标本可用
排除
仅有限针穿刺活检（FNAB）可用17
未在至少3个月内两次临床随访之间就诊的患者
纳入
15
缺失关键临床或病理数据的比例较高58
年龄≥18岁
分化良好，G1-G2分级NETs
之前未接受SSA治疗
有结局事件58
总生存（OS）：任何原因导致的死亡（58名患者，8次事件）
无复发生存（RFS）：局部或系统复发或任何原因导致的死亡（58名患者，28次事件）
癌症特异性生存（CSS）：因PanNET导致的死亡（58名患者，4次事件）

生存结果的统计分析
患者
事件
变量
分析
A1：单变量
58
8（OS）；28（RFS）；4（CSS）
M，V1-V27
A2：多变量
58
8（OS）；28（RFS）；4（CSS）
M，V1-V27
研究的流程图

2.1 患者
共有58名患者在2005年1月至2023年12月期间从“Elias”急诊医院、中央军事急诊医院“Dr. Carol Davila”和“Fundeni”临床研究所的档案中招募。纳入标准包括：（1）根据WHO 2010分类，从胰腺中获得的分化良好、G1-G2分级的NETs的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）块；（2）有足够材料进行辅助研究；（3）有监测和生存数据；（4）年龄18岁或以上；（5）书面同意将样本用于研究目的。排除标准包括（1）胰腺神经内分泌癌，（2）仅有有限针穿刺活检（FNAB）标本，（3）缺失关键临床或病理数据的比例较高，以及（4）在3个月内失去随访的患者。审查每个病例后，创建了一个包含58例Pan-NETs的数据库，其中包含匹配的人口统计和相关临床数据、可用的FFPE块、影像学评估和/或疾病复发或转移的病理确认、随访数据、无复发生存（RFS）、癌症特异性（CSS）和总生存（OS）。实际考虑因素，包括肿瘤样本的可用性和成本限制决定了样本大小。对于有多个肿瘤的病例，测量了最大的肿瘤；也分析了级别最高的肿瘤。
本研究获得了Elias大学急诊医院（批准编号123022024–1，2024年2月23日）、中央军事急诊医院“Dr. Carol Davila”（批准编号680，2024年2月29日）和Fundeni临床研究所（批准编号66033，2023年12月15日的伦理委员会的批准）。所有参与本研究的人都签署了《赫尔辛基宣言》的知情同意书。

2.2 免疫组化
存档样本储存时间长达18年。所有FFPE块均用于免疫组化研究，采用生物素-链霉亲和素方法（38）。FFPE组织切片在室温下存储，直到进一步分析。IHC用于根据WHO 2022年的定义确认肿瘤的神经内分泌性质。为此目的使用了两种或更多以下免疫组化标志物的组合：chromogranin A、神经元特异性烯醇化酶（NSE）、synaptophysin（SYN）。在从石蜡包埋组织切下的4 μm厚的切片上，按照测试制造商的协议评估以下抗体：抗chromogranin A（clone LK2H10）、抗synaptophysin（EP158）、Ki-67（SP6）、抗神经元特异性烯醇化酶（NSE）（多克隆）、抗SSTR2（PA3-109）、抗SSTR5（PA-41496）、抗ATRX（D1N2E）、抗DAXX（CL3580）、抗ARX（NBP2-80506）、抗PDX1（EP139）、抗SSTR2（PA3-109）和抗SSTR5（PA1-41496）。一位病理学家在不知道任何患者数据的情况下评估了免疫组化染色结果。

2.3 结果
主要结果是每个标志物ATRX、DAXX、ARX、PDX1和SSTR2a以及所有这些标志物组合ATRX/DAXX、ARX/PDX1之间的一致性。本研究使用IHC（免疫组化）结合标准的临床病理学因素来评估原发性PanNETs（胰腺神经内分泌肿瘤）的侵袭性。次要研究结果关注ARX/PDX1、ATRX/DAXX以及SSTR2a和SSTR5基因与PanNET患者临床预后之间的相关性。临床结果通过无复发生存期（RFS）、无癌症生存期（CSS）和总生存期（OS）来进行评估。总生存期从手术日期到因任何原因死亡的时间（忽略局部复发、远处转移和第二原发性癌症）以月为单位计算。无复发生存期从手术日期到局部或系统复发或因任何原因死亡的时间计算，同样忽略第二原发性癌症。无癌症生存期从手术日期到因PanNET死亡的时间计算。对于非NEN-P原因导致的死亡病例，观察结果被删失；局部复发、远处转移和第二原发性癌症也被忽略。在分析结束时的最后一次评估中，未出现感兴趣事件的患者也被删失。

2.4 定义
Ki-67 IHC在“热点”区域进行。至少检查500个肿瘤细胞核或2000个细胞以确定平均Ki-67百分比。记录2平方毫米区域内的平均有丝分裂计数。有丝分裂计数和Ki-67标记之间的较高值用于WHO分级。所有病例均根据最近的WHO 2022分类标准进行分级。
ATRX、DAXX、ARX和PDX1的免疫组化表达使用以下评分标准：0=阴性核染色（0-5%的细胞被染色）；1+=弱阳性核染色（5-10%的细胞被染色）；2+=中等阳性核染色（10-50%的细胞被染色）；3+=强阳性核染色（超过50%的细胞被染色）。通过分析500–1000个细胞来确定阳性细胞的百分比，该百分比代表阳性细胞数量与总分析细胞数量的比例。胰腺正常组织中的周围小岛细胞作为阳性内对照（淋巴细胞和内皮细胞）。胞质染色被认为是非特异性的，因此被忽略。在后续的统计分析中，染色不均匀的病例被计为丢失或阴性染色。对于被解释为1+、2+或3+的病例，ATRX和DAXX的免疫标记结果被视为阳性（12, 22），而核表达≤5%的肿瘤组织被分类为阴性（如前所述）。在评估ARX和PDX1时，只有被分类为2和3的病例被视为阳性，而0或1的分数被视为阴性（12, 39, 40）。
在评估SSTR2和SSTR5的免疫阳性时，我们使用了Keaemmerer等人提出的评分系统（41）。SSTR2a和SSTR5的表达基于表现出阳性的肿瘤细胞的比例和染色强度进行评分。阳性肿瘤细胞的百分比评分如下：0表示没有阳性细胞；1表示最多10%的细胞阳性；2表示10–50%的细胞阳性；3表示51–80%的细胞阳性。染色强度按以下等级评分：0（无染色），1（轻微反应），2（中等反应），3（强烈反应）。免疫反应评分（IRS）是通过将百分比分数乘以染色强度计算得出的，分数范围在0到12之间。
IRS分数的分布如下：0–1的分数被归类为阴性，最终得分为0；2–3的分数表示弱阳性表达，得分为1；4–8的分数表示轻度阳性表达，得分为2；9–12的分数表示强阳性表达，得分为3。在最终评估中，0或1的分数被解释为阴性表达，而2或3的分数表示阳性表达，反映了不同的免疫反应水平。使用IRS分数（结合染色强度和百分比分数）来评估SSTR2a和SSTR5的定量蛋白表达（范围0–12）。ATRX、DAXX、ARX和PDX1的评分是半定量的（使用0到3+的分数，如前所述）。
为了确定最佳临界值，进行了蛋白质表达的定量分析，并使用Youden指数来最大化敏感性和特异性。
肿瘤大小（T）、淋巴结转移的存在（N）和远处转移的发生（M）根据AJCC版本9.2的TNM分类进行评估。

3 统计分析
所有统计分析均使用SPSS（版本20）进行，p值<0.05被认为具有统计学意义。患者的临床和定性数据的描述性统计以数字表示。使用卡方（χ2）分析或Fisher精确检验来比较不同组别和分类数据中的临床病理学变量。根据正态性，使用非参数的Mann Whitney U检验来比较连续变量（Kolmogorov Smirnov检验）。
我们进行了ROC曲线分析，以定量评估研究生物标志物的表达水平。根据临床病理参数确定每个标志物的最佳临界值及其相应的敏感性和特异性，以评估和提高其诊断性能。为了增强ROC分析的稳健性，进行了功效分析以确保结果的统计可靠性（42）。
生存曲线使用Kaplan–Meier方法生成，生存差异使用对数秩统计确定。采用Cox回归分析来评估临床和病理特征的预后意义，包括单变量和多变量分析（使用enter方法）。未进行多重比较的调整。

3 结果
3.1 患者特征
共识别出58例符合纳入标准的PanNETs。患者的特征和肿瘤特征总结在表2中。整个队列的中位随访时间为16.5个月（范围3–259个月）。患者的中位年龄为59岁（34名女性和24名男性）。肿瘤主要发生在体尾部区域（n=45，77.6%）。54例患者患有散发性PanNETs，而4例与MEN 1综合征有关。在研究队列中，22例患者的肿瘤小于2厘米并接受了手术治疗，而大多数患者（36例，63.8%）的肿瘤大于或等于2厘米。

表2 患者或肿瘤特征
总人数，n=58
诊断时的年龄，中位数（范围）（岁）59（19, 82）
性别，n (%) 女性34（58.6%） 男性24（41.4%）
肿瘤大小的中位数（范围），厘米 2.5（0.3, 9）
肿瘤位置，n (%) 头颈部和钩状部13（22.4%） 体尾部45（77.6%）
肿瘤分泌类型，n (%) 功能性11（19%） 非功能性47（81%）
肿瘤遗传类型，n (%) 散发性54（93.1%） 家族性4（6.9%）
2022 WHO分类，n (%) G1 35（60.3%） G2 23（39.7%） G3 0（0%）
淋巴血管侵袭，n (%) 无41（70.7%） 有17（29.3%）
神经周围侵袭，n (%) 无52（89.7%） 有6（10.3%）
肿瘤分期，n (%) T1 25（43.1%） T2 15（25.9%） T3 15（25.9%） T4 3（5.2%）
淋巴结状态（N），n (%) N0 46（79.3%） N1 12（20.7%）
异时性转移，n (%) 有15（25.9%） 无43（74.1%）
同步性转移，n (%) 有8（13.8%） 无50（86.2%）
转移数目，n (%) 0 38（65.5%） 1 3（5.2%） 2 5（8.6%） ≥3 12（20.7%）
肿瘤大小，n (%) <2cm 22（36.2%） ≥ 2cm 36（63.8%）
手术情况，n (%) R0 51（87.9%） R1 7（12.1%）
最后一次随访时的状态，n (%) 生存 50（86.2%） 死亡 8（13.8%）
中位随访期（范围），个月 16.5（3, 259）
原发性胰腺神经内分泌肿瘤的临床病理学特征。

结果以n (%) 或中位数（最小–最大值）的形式报告。

3.2 肿瘤特征
肿瘤的中位大小为2.5厘米（范围0.3–9厘米）。根据2022 WHO分类标准，有35例G1 PanNETs和23例G2 PanNETs。25例被分类为pT1，15例为pT2，15例为pT3，3例为pT4。12例（20.7%）观察到淋巴结转移，8例（13.8%）存在同步性远处转移，15例（25.9%）存在异时性远处转移。

3.3 生物标志物状态
在我们的PanNETs队列中（图1），SSTR2a的整体阳性率为53.4%（31例），SSTR5为8.6%（5例）。排除没有同步转移的PanNETs后，SSTR2a或SSTR5表达陰性的肿瘤与异时性转移的关联比两者都阳性的肿瘤更频繁（75%对比25%，χ2=6.2，p = 0.038）。

图1 通过免疫标记评估的PanNETs示例，显示了ATRX、DAXX、ARX、PDX1、SSTR2a和SSTR5的表达情况。代表性的免疫组化染色图像：(a) 苏木精和伊红染色（100倍），(b) SYN阳性表达（100倍），(c) CgA阳性表达（200倍），(d) DAXX阳性表达（100倍），(e) ARX阳性表达（400倍），(f) ARX阳性表达（200倍），(g) PDX1阳性表达（200倍），(h) SSTR2阳性表达（400倍），(i) SSTR5阳性表达（400倍）（显示核表达保留），(j) ARX阴性表达（200倍）；(k) DAXX阴性表达（200倍）；(l) ARX阴性表达（200倍）；(m) PDX1阴性表达（200倍）；(n) SSTR2a阴性表达（200倍）；(o) SSTR5阴性表达（200倍）；ATRX，α-地中海贫血X连锁智力障碍染色质重塑蛋白；CgA，嗜铬粒蛋白A；DAXX，死亡结构相关蛋白；SYN，突触蛋白；ARX，aristaless相关同源盒基因；PDX1，胰腺和十二指肠同源盒1；SSTR，生长抑素受体。

ATRX、DAXX、ARX和PDX1的表达分别单独和联合进行评估，同时缺失的情况被视为一个独特的分子亚组。我们发现11个样本（19%）中ATRX有核表达；DAXX在10个样本（17.2%）中观察到。47个样本（81%）中观察到ATRX缺失，而DAXX在48个样本（82.8%）中缺失。在8个样本（13.8%）中观察到ARX的核表达，在22个样本（37.9%）中观察到PDX1的核表达。在非功能性（NF）PanNETs亚组中，我们在46例中的6例（13%）中发现了ARX+肿瘤，在46例中的15例（32.6%）中发现了PDX1+肿瘤。在转移性PanNETs亚组中，ARX-肿瘤占18例（90%），而PDX1-肿瘤占14例（70%）。

3.4 单一生物标志物
我们使用经典标志物和新提出的标志物分析了PanNETs队列。
与G2 PanNETs相比，G1 PanNETs在诊断时的淋巴血管侵袭显著较少（25%对比75%；χ2 = 7.899，p = 0.008）。此外，G1肿瘤的同步性转移比例也低于G2 PanNETs（25%对比75%，χ2=4.845，p = 0.048）。肿瘤进一步根据转移数目进行分类，提供了全面报告。G1肿瘤在无转移的病例中最常见，占82.85%，而有一个转移的肿瘤占5.71%，有两个转移的肿瘤占2.85%，有三个以上转移的肿瘤占8.57%（p = 0.003，χ2=13.766）。最后，97.14%的G1肿瘤和73.91%的G2肿瘤实现了R0切除（χ2 = 7.057，p = 0.013）。此外，95.45%的肿瘤尺寸<2厘米，而30.55%的肿瘤在诊断时表现出N0状态（χ2=5.630，p = 0.021）。在同一队列中，≥2厘米的肿瘤比<2厘米的肿瘤更常见同步性转移（100%对比0%；χ2=5.671，p = 0.019）。<2厘米的肿瘤在手术时更常实现R0切除边缘，而≥2厘米的肿瘤实现R0切除边缘的比例较低（100%对比80.55%，χ2=4.865，p-value =0.037）。此外，SSTR2a阳性的肿瘤在没有淋巴血管侵袭的PanNETs中比SSTR2a阴性的肿瘤更常见（85.19%对比58.06%，χ2=5.123，p = 0.041）（补充表1）。此外，每个新提出的标志物都单独评估了其与PanNETs的相关性，考虑了各种临床病理变量以及日常临床实践中使用的既定金标准预后标志物（表3）。

表3 临床病理特征
ATRX阴性 = 47例（81%）
ATRX阳性 = 11例（19%）P值
DAXX阴性 = 48例（82.8%）
DAXX阳性 = 10例（17.2%）P值
ARX阴性 = 50例（86.2%）
ARX阳性 = 8例（13.8%）P值
PDX1阴性 = 36例（62.1%）
PDX1阳性 = 22例（37.9%）P值
诊断时年龄（范围），年 = 61（22,82）48（19,73）0.180
61（22,82）51.5（19,72）0.354
56（19,82）66（46,72）0.055
61.5（22,82）49.5（19,78）0.496

性别，n (%)
女性 = 27例（57.45%）7例（63.64%）1.000
男性 = 20例（42.55%）4例（36.36%）21例（43.75%）3例（30%）20例（40%）4例（50%）17例（47.22%）7例（31.82%）0.248

肿瘤大小（范围），cm = 2.5（0.3,9）2.4（0.8,6.2）0.913
2.7（0.3,9）2.25（0.8, 2.6）0.187
2.5（0.3,9）2.45（1.2,7.3）0.304
2.8（0.3, 7.3）2.45（0.4, 9）0.422

肿瘤位置，n (%)
头部、颈部和钩状突 = 8例（17.02%）5例（45.45%）0.042
9（18.75%）4例（40%）0.208
11（22%）2例（25%）1.000
6（16.67%）7（31.82%）0.179
体尾 = 39例（82.98%）6例（54.55%）39例（81.25%）6例（60%）39例（78%）6例（75%）30例（83.33%）15（68.18%）

肿瘤分泌，n (%)
功能性 = 6例（12.8%）5例（45.5%）0.013
7例（14.58%）4例（40%）0.839
9（18%）2例（25%）0.639
4例（11.11%）7例（31.82%）0.083
非功能性 = 41例（87.2%）6例（54.5%）41例（85.42%）6例（60%）41例（82%）6例（75%）32例（88.89%）15（68.18%）

肿瘤遗传学，n (%)
散发性 = 45例（95.74%）9例（81.82%）0.159
46例（95.83%）8例（80%）0.134
46例（92%）8例（100%）1.000
34例（94.44%）20例（90.91%）0.630
家族性 = 2例（4.26%）2例（18.18%）2例（4.17%）2例（20%）4例（8%）0（0%）2例（5.56%）2例（9.09%）

WHO分类，n (%)
G1 = 29例（61.70%）6例（54.55%）0.662
G2 = 18例（38.30%）5例（45.45%）18例（37.5%）5例（50%）19例（38%）4例（50%）14例（38.89%）9例（40.91%）

淋巴血管侵犯，n (%)
缺失 = 33例（70.21%）8例（72.73%）1.000
32例（66.66%）9例（90%）0.253
33例（74%）4例（50%）0.216
25例（69.44%）16例（72.73%）0.790
存在 = 14例（29.79%）3例（27.27%）16例（33.33%）1例（10%）13例（26%）4例（50%）11例（30.56%）6例（27.27%）

神经周围侵犯，n (%)
缺失 = 43例（91.49%）9例（81.82%）0.318
43例（89.58%）9例（90%）1.000
45例（90%）7例（87.5%）1.000
33例（91.67%）19例（86.36%）0.664
存在 = 4例（8.51%）2例（18.18%）5例（10.42%）1例（10%）5例（10%）1例（12.5%）3例（8.33%）3例（13.64%）

肿瘤分期（pT），n (%)
T1 = 20例（42.55%）5例（45.45%）0.861
T2-T3-T4 = 27例（57.45%）6例（54.55%）27例（56.25%）6例（60%）28例（56%）5例（62.5%）21例（58.33%）
12例（54.55%）

淋巴结状态（pN），n (%)
N0 = 36例（76.60%）10例（90.91%）0.429
38例（79.17%）8例（80%）1.000
40例（80%）6例（75%）0.665
28例（77.78%）18例（81.82%）1.000
N1 = 11例（23.40%）1例（9.09%）10例（20.83%）2例（20%）10例（20%）2例（25%）8例（22.22%）
4例（18.18%）

异时性转移，n (%)
存在 = 12例（25.53%）3例（27.27%）1.000
12例（25%）3例（30%）0.708
13例（26%）2例（25%）1.000
10例（27.78%）5例（22.73%）0.670
缺失 = 35例（74.47%）8例（72.73%）36例（75%）7例（70%）37例（74%）6例（75%）
26例（72.22%）

同时性转移，n (%)
存在 = 8例（17.02%）0例（0%）0.331
8例（16.67%）0（0%）0.328
8例（16%）0（0%）0.583
35例（13.89%）3例（13.64%）1.000
缺失 = 39例（82.98%）11例（100%）40例（83.33%）10例（100%）42例（84%）
8例（100%）31例（86.11%）19例（86.36%）

肿瘤大小，n (%)
<2cm = 17例（36.17%）2例（18.18%）0.310
16例（33.33%）3例（30%）1.000
20例（40%）2例（25%）0.697
13例（36.11%）9例（40.91%）0.715
≥ 2cm = 30例（63.83%）9例（81.82%）32例（66.67%）7例（70%）30例（60%）6例（75%）23例（63.89%）

手术，n (%)
R0 = 40例（85.11%）11例（100%）0.327
41例（85.42%）10例（100%）0.336
43例（86%）8例（100%）0.577
32例（88.89%）19例（86.36%）1.000
R1 = 7例（14.89%）0例（0%）7例（14.58%）0例（0%）7例（14%）0例（0%）4例（11.11%）3例（13.64%）

局部复发，n (%)
缺失 = 44例（93.62%）9例（81.82%）0.237
44例（91.67%）9（90%）1.000
46例（92%）7例（87.5%）0.538
33例（91.67%）20例（90.91%）1.000
存在 = 3例（6.38%）2例（18.18%）4例（8.33%）1例（10%）4例（8%）1例（12.5%）3例（8.33%）

复发，n (%)
缺失 = 24例（51.06%）6例（54.55%）0.835
23例（47.92%）7例（70%）0.204
26例（52%）4例（50%）1.000
17例（47.22%）13例（59.09%）0.380
存在 = 23例（48.94%）5例（45.45%）25例（52.08%）3例（30%）24例（48%）4例（50%）19例（52.78%）

总生存期（OS），（范围），月 = 16（3,84）19（3,259）0.351
16.5（3,259）15（3,216）0.621
19（3,259）36（3,84）0.120
21（3,259）4.5（3,73）0.039
无复发生存期（RFS），（范围），月 = 9（3,73）19（3,156）0.211
17.5（3,120）14（3,156）0.306
6（3,156）19.5（3,56）0.162
13（3,156）4.5（3,73）0.082

在58例原发性胰腺神经内分泌肿瘤中，ATRX、DAXX、ARX和PDX1表达的临床和病理学比较。结果根据需要以n (%)或中位数（最小-最大值）报告。p值使用皮尔逊卡方检验或费希尔精确检验来确定分类变量，曼-惠特尼U检验来确定连续变量。统计上显著的差异以粗体显示。

在NF-PanNETs肿瘤组中观察到ATRX表达的丢失更为常见（47例中的41例，87.2%），而在F-PanNETs组中较少见（47例中的6例，12.8%）（χ2=6.198，p = 0.013）。此外，ATRX阳性肿瘤更常出现在体尾区域（47例中的39例，82.98%），而头部、颈部和钩状突区域较少见（47例中的8例，17.02%）（χ2=4.144，p = 0.042）。

3.5 组合生物标志物

我们分析了队列中的一组标志物组合（表4）。根据ARX和PDX1表达，将我们的研究队列分为四组免疫表型组：ARX+PDX1-（4例，6.9%），ARX-/PDX1+（18例，31%），ARX+PDX1+（“双阳性”或DP）（4例，6.9%），以及ARX阴性/PDX1阴性（“双阴性”或DN）（32例，55.2%）。遵循Cejas和Hackeng的方法（12, 40），ARX阳性/PDX1阴性和DN组被合并为单一组（ARX++DN），共36例（62.1%）。同样，ARX阴性/PDX1阳性和双阳性病例被合并为PDX1++DP组，总计22例（37.9%）。

表4 临床病理特征
ATRX和DAXX阳性 = 7例（12.1%）
ATRX或DAXX丢失 = 51例（87.9%）P值
ARX++DN = 36例（62.1%）
PDX1++DP = 22例（37.9%）P值
诊断时年龄（范围），年 = 48（19,72）61（22,82）0.248
61.5（22,82）49.5（19,78）0.496

性别，n (%)
女性 = 4例（57.14%）30例（58.82%）1.000
男性 = 3例（42.86%）21例（41.13%）17例（47.22%）7例（31.82%）

肿瘤大小（范围），cm = 2.2（0.8,2.6）2.6（0.3,9）0.211
2.8（0.3, 7.3）2.45（0.4,9）0.422

肿瘤位置，n (%)
头部、颈部和钩状突 = 3例（42.86%）10例（19.61%）0.180
6（16.67%）7（31.82%）0.179
体尾 = 4例（57.14%）41例（80.39%）30例（83.33%）15例（68.18%）

肿瘤分泌，n (%)
功能性 = 4例（57.1%）7例（13.7%）0.024（11.11%）7（31.82%）0.083
非功能性 = 3例（42.9%）44例（86.3%）32例（8我们的研究结果与其他研究（49项）一致，显示在我们研究的队列中SSTR2a的阳性率较高（53.4%）。现有文献报道称SSTR2和SSTR5与改善的生存结果有关（20, 50, 51）。然而，SSTR5的预后价值仍不清楚，有些研究并未发现SSTR5表达与生存终点之间存在关联（52, 53）。考虑到SSTR2a的积极预后作用，我们在排除了具有同步转移的PanNETs后分析了其表达情况。与同时表达这两种标记物的患者相比，异时转移患者的SSTR2a或SSTR5表达为阴性的比例更高（p = 0.038）。在没有淋巴血管侵犯的肿瘤中，SSTR2a的表达也更为常见（p = 0.041），这与它与较温和的肿瘤行为相关联（19）。与其他研究（46项）一致，SSTR5阳性的肿瘤表现出更长的中位生存时间（OS，73个月对比7个月，p < 0.01）和无复发生存时间（RFS，36个月对比6个月，p = 0.005）。然而，在考虑了删失情况后的生存分析中，这些发现并未得到证实，OS没有统计学上的显著差异（p = 0.078），这可能是由于样本量有限以及分析方法的不同所致。同样，在仅对未接受SSA治疗的患者的亚组进行分析，以及对没有同步转移的NF-PanNETs的分析中，也得到了一致的结果，没有发现显著的生存差异。Cox回归模型进一步支持了这些发现，这些模型未显示出所研究的生物标志物与生存结果之间存在独立关联。总体而言，我们的结果表明，SSTR的表达，特别是SSTR5，并不是该队列中一个可靠的独立预后因素。相反，其临床相关性可能更多地与其在治疗分层中的作用有关，而非肿瘤的固有生物学特性。需要在更大、更独立的队列中进行进一步研究，以更好地明确SSTR表达的预后与预测作用。此外，我们没有发现SSTR2a或SSTR5的表达与肿瘤位置、功能状态或TNM分期之间存在关联，这与之前的研究（48, 54）一致。这种差异可能源于我们队列的构成特点，即第1-3期肿瘤的数量多于第4期肿瘤，非分泌型PanNETs的数量多于分泌型PanNETs。尽管不同研究之间SSTR表达与生存间的关联存在差异，但SSTR2和SSTR5的阳性通常预示着更好的预后（19, 53, 54）。这可能也与SSA的治疗或生长抑素信号传导的促凋亡效应有关。与这一假设相符，在我们的队列中，接受SSA治疗的患者（这些患者SSTR表达为阳性）具有更长的中位生存时间和无复发生存时间。在PanNETs中建立可靠的基因型-表型关联有助于在临床实践中常规使用免疫组织化学（IHC）检测。IHC检测DAXX的敏感性为85%，特异性为95%，尽管其表现因突变位点而异（21）。早期研究将ATRX/DAXX的缺失与改善的生存结果联系起来，但后续数据却将这一发现（通常表明ALT激活）与缩短的无复发生存时间相关联（22, 55）。研究之间的差异表明，ATRX的缺失可能与较短的生存时间相关；然而，与其他免疫反应性缺失相比，它可能仍是一个不太可靠的预后标志物（56）。报道的ATRX/DAXX突变频率在12%到40%之间（34），但我们观察到87.9%的病例中蛋白质表达缺失，这与Park等人的报告（79%）相当（29）。这种差异可能是由于IHC评估方法的差异所致。与文献中的发现一致（12），在44个NF-PanNETs和7个F-PanNETs中观察到了ATRX/DAXX的缺失（p = 0.02）。此外，ATRX阴性的肿瘤更常见于胰腺的体部或尾部，而不是头部、颈部或钩突（p = 0.042）。研究之间的差异也可能源于队列构成的不同：Jiao等人和Raj等人发现ATRX/DAXX突变在转移性患者中是良好的预后标志物（57, 58），而Chou等人（59）在一个仅有13%转移病例的队列中得出了相反的结果。最近的一项荟萃分析显示，ATRX/DAXX发生改变的病例具有更长的生存趋势（p = 0.96）（34）。在我们的队列中，尽管有13.8%的病例具有同步转移，但在排除了这一变量后，生存时间没有显著差异。越来越多的证据表明，DAXX和ATRX突变出现在初始微腺瘤进展为超过3厘米的大型肿瘤的过程中，这与我们的发现一致（22, 60）。我们的ROC分析评估了肿瘤大小与ATRX/DAXX蛋白表达缺失之间的关系，在36个肿瘤直径≥2厘米的PanNET病例子集中进行了研究。研究发现，肿瘤直径2.45厘米是一个临界值，其与诊断时ATRX/DAXX蛋白表达缺失相关，敏感性为96.9%，特异性为75%（AUC 0.922，p = 0.007），显示出良好的区分能力。然而，由于样本量相对较小（n = 36），这一发现应视为假设性的，需要在更大、前瞻性的多机构队列中得到验证才能应用于临床。此外，最近的研究表明，在转移性病变中DAXX和ATRX缺失的 prevalence 较高（约62%），而在原发性肿瘤中约为25%（48, 54）。这种差异表明这些蛋白的缺失与肿瘤进展强烈相关，强调了阐明驱动这一现象的分子机制的重要性（12）。这些发现表明，ATRX/DAXX的缺失可能与更侵袭性的疾病相关，并与晚期肿瘤相关（12, 22, 23, 61, 62），因此在肿瘤进展的情况下需要重新进行活检。使用细胞学样本可以可靠地评估ARX表达，观察者间的变异性较低，尽管PDX1的假阳性结果可能由于污染或取样问题而发生（39）。在我们的研究中，ARX+、PDX1+、DP和DN肿瘤的比例分别为13.8%、37.9%、6.9%和55.2%，与Cejas等人的报告（40%的43%、19%、28%和10%）有显著差异。虽然在国际队列中ARX表达与不良预后特征相关，但它与无复发生存时间无关（12）。与我们队列中疾病较为惰性的特点相比，ARX+肿瘤的比例较低（40, 63%报告的比例为50-60%）。ARX+肿瘤的比例较低可能是由于选择偏差。ARX++DN肿瘤的中位生存时间比其他亚组更长（21个月[范围：3-259]对比4.5个月[范围：3-73]，p = 0.039）[65]。转移性（包括同步和异时）ARX++DN肿瘤的中位生存时间为33个月[范围：3-259]，而PDX1++DN肿瘤为13.5个月[范围：3-29]（p = 0.006），这也表明疾病的进程较为惰性。在NF-PanNETs中，ARX++DN特征与局部复发和远处转移的高发率相关，特别是在MEN1患者中（12, 40）。我们研究中缺乏显著性可能是由于MEN1病例数量较少，这可能阻碍了与肿瘤大小、分期和淋巴结受累之间的显著关联的发现。总之，我们建立了一个罗马尼亚的PanNET病例队列，通过免疫组织化学分析来描述它们的临床病理和分子特征。我们的发现与现有文献一致，表明SSTR5的阳性表达与更长的中位生存时间和无复发生存时间相关。此外，我们的研究还发现，在直径≥2厘米的PanNETs亚组中，肿瘤大小（特别是≥2.45厘米的临界值）可能与ATRX/DAXX蛋白表达的缺失有关。这些发现支持了越来越多的证据，表明ATRX/DAXX和SSTR5的状态是PanNETs生物学行为和临床管理的关键因素。相比之下，ARX/PDX1的结果并不确定，可能是由于ARX阳性病例数量较少。这些发现突显了PanNETs的异质性，需要进一步研究，特别是在转移性进展方面。本研究存在几个局限性。首先，回顾性设计和疾病生物行为的异质性可能引入了潜在偏差。在我们的队列治疗期间（超过20年），患者结果可能受到外科切除和系统治疗显著进步的影响。分析还可能受到应用于连续数据的分类变量边界的影响。相对较小的队列规模和较短的随访时间（中位数：16.5个月）可能影响了结果的稳定性、可靠性和普遍性，包括来自生存分析和ROC分析的结果。此外，未进行多重检验的校正可能会增加I型错误的风险。此外，在如剜除术等外科干预的情况下，可能导致淋巴结转移被低估。在未来的分析中，我们计划扩大队列规模，并检查肿瘤样本与FNAB样本之间的相关性，以改进风险分层。通过使用IHC检测ATRX/DAXX，可以区分NETs和NECs，并确定转移性NETs的原发部位。此外，通过整合ALT状态（通过FISH）与ATRX/DAXX表达，可以进一步提高预后评估。这些未来的结果可以代表罗马尼亚人群的特点，为未来的大型前瞻性研究提供基础，以确认这些生物标志物的有效性和普遍性。总之，评估ATRX、DAXX、ARX、PDX1和SSTR2a/5蛋白的表达具有成本效益且迅速，为决策过程提供了积极影响的机会。通过免疫组织化学评估上述生物标志物，根据分子特征将PanNENs细分为不同的亚型，可以提高预后准确性并优化患者管理。