《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》：A 3D bioengineered human liver for the study of acute and chronic drug-induced hepatotoxicity and fibrosis
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肝脏经常暴露于破坏其功能的急性和慢性损伤中，导致炎症、纤维化和严重病症如肝硬化和肝细胞癌。由肝星状细胞活化驱动的纤维化是慢性肝损伤的关键特征。传统二维（2D）肝脏模型在维持肝功能和准确复制纤维化等慢性疾病方面面临局限性。针对这些需求，3D模型已成为研究肝脏疾病
肝脏经常暴露于破坏其功能的急性和慢性损伤中，导致炎症、纤维化和严重病症如肝硬化和肝细胞癌。由肝星状细胞活化驱动的纤维化是慢性肝损伤的关键特征。传统二维（2D）肝脏模型在维持肝功能和准确复制纤维化等慢性疾病方面面临局限性。针对这些需求，3D模型已成为研究肝脏疾病和药物测试的更具生理相关性的平台。然而，大多数现有3D模型仍缺乏慢性损伤特征或免疫元件。在本研究中，研究人员开发了一种3D人肝模型以研究急性和慢性药物诱导的肝损伤。该模型由封装在甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和甲基丙烯酸酯羧甲基纤维素基质中的人肝细胞（HepaRG）和肝星状细胞（LX-2）组成。在30天的培养期内，3D肝构建体维持了生理相关的功能，包括白蛋白分泌和细胞色素P450活性，而这些功能在传统2D模型中会迅速丧失。该模型能够通过给予脂多糖（LPS）和对乙酰氨基酚，可靠地模拟低水平长期和高剂量短期损伤。慢性肝损伤的特征是进行性纤维化、COL1A1表达升高和持续性高氨血症。相比之下，急性模型显示出显著但短暂的损伤。此外，地塞米松治疗成功逆转了纤维化标志物并恢复了肝细胞功能，表明该模型具有评估潜在治疗的预测能力。纳入人单核细胞（THP-1）允许研究人员调查免疫反应和巨噬细胞活化，这是肝脏疾病发病机制的关键贡献者。总之，这种3D肝模型为研究急性和慢性损伤下的复杂多细胞相互作用提供了一个生理相关且通用的平台。它在药物安全性筛选、疾病建模和个性化治疗方面具有广泛意义。三方共培养设计扩展了模型阐明免疫驱动的肝脏病理的能力。
这篇发表于《Frontiers in Bioengineering and Biotechnology》的研究论文，针对当前肝脏疾病模型在模拟慢性病理和免疫反应方面的不足，开发了一种新型的三维（3D）生物工程人肝模型，旨在更精准地研究急性和慢性药物诱导的肝损伤（DILI）及其引发的肝纤维化。
研究背景指出，肝脏疾病是全球重大健康问题，传统二维（2D）体外模型难以维持肝脏特异性功能，也无法准确重现慢性肝损伤伴随的纤维化进程。尽管现有3D模型有所改进，但多数仍缺乏慢性损伤特征和关键的免疫细胞组分。为了克服这些限制，研究人员构建了由甲基丙烯酰化明胶（GelMA）和甲基丙烯酸酯羧甲基纤维素（CMCMA）水凝胶封装人肝细胞（HepaRG）与肝星状细胞（LX-2）组成的3D模型，并在部分实验中引入单核细胞（THP-1）形成三方共培养体系。
关键技术方法包括：利用光交联水凝胶技术制备环形3D肝组织；通过转录组测序（RNA-Seq）结合基因集富集分析（GSEA）评估基因表达动态；采用实时荧光定量PCR（qPCR）验证关键基因；利用免疫荧光染色观察蛋白表达与细胞形态；通过活死细胞染色（Live/Dead assay）、MTS法检测细胞活力与代谢活性；以及使用酶联免疫吸附试验（ELISA）和发光法测定细胞因子与酶活性。
研究结果部分详细阐述了模型的构建与验证：
健康肝脏模型：研究人员发现，在为期30天的血清-free培养中，该3D模型能够维持稳定的细胞活力和代谢活性。基因集富集分析显示肝细胞分化相关通路持续增强，而细胞死亡通路受到抑制。关键肝细胞功能基因如白蛋白（Albumin）、氨基甲酰磷酸合成酶I（CPS1）和鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）的表达随时间显著增加，证实了肝细胞功能的长期维持。
慢性肝损伤模型：通过给予低剂量脂多糖（LPS）和对乙酰氨基酚建立的慢性损伤模型显示，模型组表现出进行性纤维化特征，包括胶原蛋白I型α1链（COL1A1）mRNA水平升高及III型前胶原N端肽（PIIINP）和I型前胶原N端肽（PINP）分泌增加。转录组分析揭示了纤维化通路激活与尿素循环功能受损，且伴随脂滴积累和细胞核形态异常增大。
急性肝损伤模型：高剂量LPS和对乙酰氨基酚刺激导致肝细胞功能标志物急剧下降，CYP3A4酶活性显著降低，同时伴有氨水平升高和广泛的肝星状细胞活化，成功模拟了急性肝衰竭的病理特征。
药物治疗验证：研究人员应用地塞米松处理损伤模型，结果显示其能有效逆转纤维化标志物（如降低COL1A1），恢复白蛋白和CPS1的基因表达，并通过免疫荧光证实了其抗纤维化和保护肝细胞的功能。
免疫三方共培养系统：引入THP-1单核细胞后，研究人员观察到在急慢性损伤条件下，通过transwell非接触式共培养，可溶性因子可诱导单核细胞NF-κB通路的激活及白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-1β（IL-1β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等促炎因子的释放，证实了模型具备模拟免疫微环境的能力。
讨论部分总结认为，该3D生物工程肝模型成功克服了传统2D模型无法长期维持肝功能及模拟慢性纤维化的缺陷。GelMA-CMCMA水凝胶提供的仿生微环境有效维持了肝星状细胞的静息状态，直至受到损伤刺激。研究结论强调，该模型不仅能区分急性和慢性药物诱导肝损伤的动力学差异，还因整合了免疫细胞组分，为研究免疫介导的肝脏病理提供了有力工具。这一平台在药物临床前安全性评价、复杂肝脏疾病机制研究以及个性化医疗方案的制定中具有广阔的应用前景。
