Rhazya strictaDecne.叶片与茎提取物在人血浆与人外周血单个核细胞中的植物化学、抗氧化及止血特性比较研究

《Frontiers in Molecular Biosciences》：Comparative phytochemical, antioxidant, and hemostatic studies of leaf and stem extracts of Rhazya stricta Decne. in human plasma and human peripheral blood mononuclear cells in vitro

　　

摘要： 引言：Rhazya strictaDecne.是一种重要的药用植物，富含具有抗癌活性的生物碱等次生代谢物。已从其不同部位鉴定出多种吲哚生物碱，但仅有少数此类代谢物的细胞毒性潜力已知。 方法：本研究采用分析化学方法测定了R. stricta茎(RS)和叶(RL)及其提取物中的生物碱。利用电喷雾离子化-四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-Q-TOF)正离子模式对提取物进行分析，并对叶片和茎的四组不同提取物（茎A-D，叶A′–D′）进行了体外生物活性评估。 结果与讨论：本研究初步阐明了R. stricta不同部位的10个新吲哚生物碱化合物，其中6个生物碱苷类在自然资源中未被检出。研究人员在体外评估了四种R. stricta茎(A–D)和叶(A′–D′)提取物对由H2O2/Fe2+诱导的人血浆氧化应激的保护效果。此外，还评估了这些植物提取物对人外周血单个核细胞(PBMC)DNA片段化的影响。研究还旨在确定A–D和A′–D′提取物对人血浆选定止血参数（如活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)和凝血酶时间(TT)）以及对PBMC活力的影响。基于结果，研究人员首次证明，含有不同吲哚生物碱化合物的受试叶片和茎提取物（特别是叶片来源的C′和D′制剂）是良好的体外抗氧化模型，其效果具有剂量依赖性，并可能在体内具有潜在应用前景。例如，在A–D和A′–D′实验中，研究人员观察到H2O2诱导的DNA损伤水平存在显著差异。在所有测试浓度下，两种叶片提取物(C′和D′)也被发现可保护血浆免受H2O2/Fe2+诱导的脂质过氧化。此外，制备物C′不具有细胞毒性。提取物C′的代谢组学潜力可能与rhazisidine、secamine及其衍生物的存在相关。

一、 研究背景、问题与目的

生物碱是药用植物中广泛存在的一类天然代谢物，其结构含有一个或多个氮原子。其中，吲哚生物碱是生物碱的主要类别之一，常见于茜草科和夹竹桃科植物，具有降压、抗菌、抗肿瘤等多种药理活性。然而，高浓度的某些吲哚生物碱（如哈尔满和去甲哈尔满）也可能表现出神经毒性作用。

Rhazya strictaDecne.（俗称“Harmal”）是夹竹桃科的一种耐旱植物，传统上用于治疗慢性风湿病和发热。该植物是吲哚生物碱、单萜吲哚生物碱、三萜、酚类和苷类的丰富天然来源。既往研究表明，R. stricta提取物及其纯化的生物碱代谢物具有抗糖尿病、抗氧化和抗癌特性。然而，该植物不同部位，特别是其吲哚生物碱对人类血液各组分生理学的影响，包括与人血浆和止血系统的相互作用，相关数据尚属空白。氧化应激是癌症和心血管疾病等多种人类疾病进展的关键因素，植物中的植物化学物质在治疗和预防氧化应激相关疾病方面展现出巨大潜力。

因此，本研究首次系统性地探讨了R. stricta叶片和茎部提取物在体外对人类血浆氧化应激、DNA损伤、止血参数及细胞活力的影响。研究的主要目的是：1）建立快速、灵敏的超高效液相色谱-电喷雾电离-四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-Q-TOF)技术，用于初步鉴定R. stricta叶片和茎中的生物碱代谢物；2）阐明其四种茎提取物(A-D)和四种叶提取物(A′–D′)对H₂O₂/Fe²⁺（羟基自由基供体）诱导的人血浆氧化应激的体外保护作用；3）评估这些提取物对人外周血单个核细胞(PBMC)DNA损伤的影响；4）确定这些提取物对人血浆关键止血参数（APTT、PT、TT）及PBMC活力的影响。本研究发表于《Frontiers in Molecular Biosciences》。

二、 主要关键技术方法

研究人员从沙特阿拉伯卡西姆省采集了Rhazya stricta植物样本，经鉴定后凭证标本保存。将干燥后的叶片(RL)和茎(RS)分别用80%甲醇提取，得到粗提物。随后通过C18柱色谱，用不同比例的甲醇-水（20%、40%、60%、80%甲醇）进行梯度洗脱，分别得到茎的四个组分（A-D）和叶的四个组分（A′–D′）。所有提取物经薄层色谱(TLC)和Dragendorff试剂检测呈生物碱阳性。

生物活性研究使用的人血浆和PBMC均分离自波兰罗兹血库提供的健康献血者样本，相关实验程序均获得了所在大学的生物伦理委员会批准。体外生物活性评估主要包括：1）UPLC-ESI-Q-TOF分析：采用正离子模式([M+H]⁺)对粗提物及各组分进行代谢物鉴定，通过质谱碎片推测新化合物结构。2）氧化应激指标测定：将血浆与不同浓度提取物预孵育后，用H₂O₂/Fe²⁺诱导氧化应激，随后测定硫代巴比妥酸反应物(TBARS，反映脂质过氧化)、羰基含量（反映蛋白质氧化）和巯基水平。3）DNA损伤分析：采用碱性彗星实验，检测PBMC经提取物处理和H₂O₂刺激后的DNA损伤程度（以彗星尾DNA百分比表示）。4）细胞活力测定：使用刃天青还原法评估提取物对PBMC代谢活性的影响。5）止血参数测定：使用光学凝固分析仪，测定提取物孵育后血浆的凝血酶原时间(PT)、凝血酶时间(TT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)。数据分析使用Statistica软件，采用方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较检验等进行统计学处理。

三、 研究结果

3.1 植物制备物的化学特征

利用UPLC-ESI-Q-TOF正离子模式对R. stricta茎(RS)和叶(RL)粗提物进行分析，获得了相应的色谱图。通过比较保留时间、分子量、质谱碎片以及已知代谢物的裂解规律，成功鉴定和初步鉴定了多种吲哚生物碱。

3.2 从R. stricta茎部鉴定新的吲哚生物碱

研究人员从茎提取物中初步阐明了7个新的吲哚生物碱（化合物1-7）。例如，化合物1和8（在茎和叶中均存在）的质谱数据显示质子化离子为m/z 753，推测分子式为C₃₅H₄₈N₂O₁₆，其碎片离子提示为含有两个己糖基和两个羧基的吲哚生物碱苷，被暂命名为rhazyaosidine A。化合物2推测为N-氧化物吲哚生物碱苷，命名为rhazyaosidine B。化合物3结构复杂，可能为两个吲哚生物碱衍生物通过连接基团结合，并连有两个己糖基，命名为rhazyaosidine C。化合物4推测为N-氧化物吲哚生物碱，含有乙酰氧基，命名为arafacine。化合物5和6为差向异构体，推测为甲基-育亨宾及其异构体。化合物7推测为蛇根碱的二聚体。

3.3 从R. stricta叶部鉴定新的吲哚生物碱

从叶提取物中初步阐明了3个新的吲哚生物碱（化合物8-10）。化合物8同茎中的化合物1。化合物9的质谱数据提示其结构类似strictosidine，但甲酯被丙酯取代，命名为rhazyaosidine D。化合物10也被初步鉴定。

3.4 已知吲哚生物碱的鉴定

通过与文献数据对比，研究人员还从茎提取物中鉴定了包括rhazicine、akuammidine、strictosidine、tetrahydropresecamine、decarboxytetrahydrosecamine、strictisidine等多种已知吲哚生物碱。从叶提取物中鉴定了包括aspidospermiose、rhazidine、strictosidine、rhazisidine、secamine、dihydropresecamine、tetrahydropresecamine等多种已知吲哚生物碱。这些化合物分布在不同的提取组分中。

3.5 不同提取物对体外氧化应激的影响

研究人员评估了茎(A-D)和叶(A′–D′)提取物在体外对氧化应激生物标志物的影响。在H₂O₂/Fe²⁺诱导的血浆氧化模型中，两种叶提取物C′和D′在所有测试浓度下（0.5-50 μg/mL）均能显著降低由氧化应激引起的硫代巴比妥酸反应物水平，表明其具有抑制脂质过氧化的强效抗氧化活性。特别是C′提取物，其保护作用与浓度呈正相关，且在测试浓度下未显示细胞毒性。某些茎提取物（如D）在较高浓度时也能减少脂质过氧化，但效果通常弱于叶提取物。在蛋白质氧化（羰基化）和巯基水平方面，提取物的保护效果相对较弱或不一致。

3.6 不同提取物对DNA氧化损伤的影响

通过彗星实验评估提取物对PBMC DNA氧化损伤的影响。用H₂O₂处理后，PBMC的DNA损伤显著增加。预孵育叶提取物C′和D′能显著降低H₂O₂诱导的DNA损伤，表现出保护作用。茎提取物的效果则不明显。

3.7 不同提取物对细胞活力的影响

通过刃天青还原实验评估提取物对PBMC活力的影响。在浓度为0.5-50 μg/mL范围内孵育24小时，大多数提取物对PBMC活力没有显著影响，表明在测试浓度下无细胞毒性。其中，叶提取物C′在所有浓度下均未影响细胞活力。

3.8 不同提取物对止血参数的影响

研究人员测定了提取物对人血浆凝固参数的影响。与对照组相比，叶提取物C′和D′显著延长了活化部分凝血活酶时间(APTT)，表明它们可能通过影响内源性凝血途径发挥抗凝作用。部分提取物（如叶提取物B′和C′）也轻微延长了凝血酶原时间(PT)。提取物对凝血酶时间(TT)的影响较小或不显著。茎提取物对止血参数的影响较弱。

四、 讨论与结论

讨论：

本研究成功应用UPLC-ESI-Q-TOF技术对Rhazya stricta叶和茎提取物中的吲哚生物碱进行了系统分析，初步鉴定了10个新化合物，并确认了多种已知生物碱。化学分析表明，叶和茎提取物的生物碱组成存在差异。生物学实验首次揭示了R. stricta提取物，特别是叶提取物C′和D′，在体外具有多重生物活性。其强效的抗氧化活性（抑制脂质过氧化和DNA氧化损伤）可能与提取物中特定的吲哚生物碱成分有关，例如在活性显著的C′提取物中检测到的rhazisidine、secamine及其衍生物。此外，C′和D′提取物能显著延长APTT，提示其具有影响凝血 cascade 的潜力，这为探索其在心血管疾病方面的应用提供了新线索。值得注意的是，活性最强的C′提取物在测试浓度范围内未表现细胞毒性，这增加了其进一步开发的安全性预期。研究结果将R. stricta的传统药用价值与具体的分子机制和活性成分进行了初步关联，为将其开发为抗氧化剂或抗凝辅助剂提供了科学依据。然而，这些活性的具体作用分子靶点、体内有效性及安全性仍需通过后续研究，如化合物分离纯化、作用机制深入探索和动物实验来验证。

结论：

本研究初步阐明了来自R. stricta不同部位的10个新的吲哚生物碱化合物。其中，六个生物碱苷在自然资源中未被发现。本研究还首次证明，测试的含有不同吲哚生物碱化合物的R. stricta叶片和茎提取物（尤其是两个测试的叶片制备物C′和D′）是良好的体外抗氧化模型，且效果取决于剂量，它们可能在体内具有一些有前景的作用。例如，在A–D和A′–D′实验中，我们观察到H₂O₂诱导的DNA损伤水平存在显著差异。在所有使用的浓度下，两种测试的叶片提取物（C′和D′）也能保护血浆免受H₂O₂/Fe²⁺诱导的脂质过氧化。此外，制备物C′不诱导细胞毒性。提取物C′的代谢组学潜力可能与rhazisidine、secamine及其衍生物的存在相关。