褪黑素通过谷胱甘肽依赖性代谢重编程抑制ILC2驱动的气道高反应性

《Frontiers in Immunology》：Melatonin suppresses ILC2-driven airway hyperreactivity via glutathione-dependent metabolic reprogramming

　　

过敏性哮喘的特征是2型炎症和夜间症状加重，但驱动时间性变异的细胞代谢特征动态变化仍未明确。第2组先天淋巴细胞（ILC2s）是气道高反应性的核心介质。研究人员发现了褪黑素作为一种先前未被识别的ILC2代谢和功能调节因子。在小鼠过敏性气道炎症模型中，褪黑素减少了嗜酸性粒细胞增多、2型细胞因子产生和气道高反应性，但不改变ILC2数量。从机制上讲，褪黑素不依赖经典的褪黑素受体起作用，而是重编程ILC2代谢，使其偏向戊糖磷酸途径活性，增强烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）生成和核因子E2相关因子2（NRF2）依赖性谷胱甘肽（GSH）积累。代谢谱分析、功能缺失方法和药理学激活研究表明，NRF2既是抑制ILC2效应功能所必需的，也是充分的。重要的是，原代人ILC2s在响应褪黑素时表现出保守的NRF2激活、GSH积累和减少的2型细胞因子产生，强调了其临床相关性。综上所述，这些发现确定了褪黑素-NRF2-谷胱甘肽轴是调节先天2型免疫的代谢检查点，并表明靶向氧化还原代谢可能成为调节过敏性哮喘气道炎症的一种策略。

褪黑素通过谷胱甘肽依赖性代谢重编程抑制ILC2驱动的气道高反应性：论文解读

一、 研究背景与目的

哮喘是一种慢性肺部炎症性疾病，全球影响数亿人，是发病和死亡的主要原因。大多数患者表现为2型炎症，其特征是气道嗜酸性粒细胞浸润、粘液产生和气道高反应性（AHR），症状包括呼吸短促、喘息和咳嗽。尽管适应性辅助性T细胞2（Th2）长期以来被认为参与哮喘发病机制，但第2组先天淋巴细胞（ILC2s）现在被认为是过敏性气道炎症的关键启动者和放大器。ILC2s能快速响应上皮源性警报素，独立于适应性免疫系统产生大量白细胞介素-5（IL-5）和白细胞介素-13（IL-13），是气道炎症和高反应性的关键调节因子。

尽管对哮喘的细胞驱动因素有了深入理解，但该疾病的几个基本特征仍未得到很好的解释。其中最显著的是症状严重程度的明显昼夜变化。哮喘症状通常在夜间加重，气道阻塞和高反应性的峰值发生在清晨。临床上，哮喘的夜间恶化与严重急性加重和哮喘相关死亡风险增加有关。此外，昼夜节律的破坏，特别是通过夜班工作，与哮喘患病率和疾病严重程度增加密切相关。这些观察结果表明，昼夜节律调节的生理信号在塑造气道炎症中发挥着直接且有临床意义的作用，然而，这种时间易感性背后的免疫机制仍未完全明了。

在昼夜节律调节的激素中，褪黑素尤其令人关注。褪黑素主要由松果体分泌，协调昼夜节律，在健康个体中于夜间达到峰值。在哮喘患者中，褪黑素分泌经常失调，并与夜间症状恶化相关。临床观察还发现，哮喘患者的褪黑素分泌相对于健康个体常常发生相移，这可能限制了免疫细胞在适当时间启动褪黑素依赖性调节程序的能力。此外，褪黑素在调节细胞氧化还原稳态方面也具有公认但尚未充分探索的功能。它能够增强谷胱甘肽的合成和再循环，而谷胱甘肽是控制氧化还原敏感信号通路的关键细胞内抗氧化剂。哮喘患者的气道中谷胱甘肽水平经常降低，其合成和维持需要协调的代谢输入，包括通过戊糖磷酸途径生成的NADPH，并受到转录因子核因子E2相关因子2（NRF2）的转录调控。因此，本研究旨在阐明褪黑素在调节ILC2驱动的过敏性气道炎症中的作用，探索褪黑素是否通过代谢重编程直接影响ILC2功能，并揭示其潜在的分子机制和临床转化潜力。

二、 主要技术方法

本研究采用了多种体内外实验模型和技术方法。研究人员使用了对内源性褪黑素生成缺陷的BALB/c小鼠，建立了交替链格孢（Alternaria alternata）和重组小鼠IL-33（rmIL-33）诱导的过敏性气道疾病模型，并辅以腹腔注射外源性褪黑素和/或褪黑素受体拮抗剂Luzindole进行处理。通过精细点呼吸机系统（FinePointe RC）评估气道高反应性，对支气管肺泡灌洗液（BALF）和肺组织进行流式细胞术分析以量化免疫细胞群和细胞因子。使用组织学染色（H&E）评估肺部炎症和上皮厚度。通过过继转移实验，将体外处理的活化ILC2s注射到Rag2^-/-GC^-/-小鼠体内，以特异性评估ILC2功能。从人和小鼠肺部分离ILC2s进行体外培养，并用褪黑素、受体激动剂/拮抗剂、NRF2激活剂（如富马酸二甲酯，DMF）或抑制剂进行处理。通过批量RNA测序（RNA-seq）分析转录组变化。使用Seahorse分析仪测量细胞外通量以评估代谢状态。通过商业试剂盒和流式细胞术检测细胞内代谢物（如乳酸、NADPH、β-羟丁酸、谷胱甘肽）水平、线粒体膜电位和葡萄糖摄取。利用公开可用的单细胞RNA测序数据集进行荟萃分析，以评估褪黑素受体和相关基因的表达。研究还使用了健康成人志愿者的外周血分离的人ILC2s，以验证小鼠研究结果在人类中的保守性。

三、 研究结果

1. 外源性褪黑素给药减轻了过敏原暴露小鼠的过敏性气道疾病严重程度

研究人员在交替链格孢（AA）诱导的BALB/c小鼠哮喘模型中发现，腹腔注射褪黑素能显著减轻疾病表型。具体表现为：肺质量/体重比和BALF总细胞数增加幅度降低；组织学上，肺实质免疫细胞浸润和上皮增厚显著减少；流式细胞术分析显示，肺和BALF中的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞增多被显著抑制，但ILC2s的比例和绝对数量没有显著改变。尽管ILC2数量未变，BALF中的IL-5和IL-13水平显著降低，表明褪黑素抑制了ILC2的功能而非清除细胞。生理学测量也证实，褪黑素处理改善了AA暴露小鼠的气道高反应性，恢复了动态顺应性。这些结果表明，褪黑素在过敏原驱动的疾病模型中具有保护作用。

2. 褪黑素在ILC2偏向的过敏性气道疾病模型中发挥保护作用，即使在存在经典受体阻断的情况下也是如此

为了分离ILC2的内在反应，研究人员采用了IL-33诱导的ILC2偏向模型。在此模型中，褪黑素治疗同样减轻了肺部炎症、上皮增厚、嗜酸性粒细胞和中性粒细胞增多，并且同样不改变ILC2的数量，但降低了BALF中IL-5和IL-13的水平。重要的是，即使同时使用褪黑素受体MT1/MT2的非选择性拮抗剂Luzindole，褪黑素的保护作用（如减轻嗜酸性粒细胞增多、改善气道功能）仍然存在。这表明褪黑素对ILC2的调节可能不依赖于经典的MT1/MT2受体信号。

3. 褪黑素独立于经典MT1/MT2受体调节ILC2功能

为了验证受体依赖性，研究人员分析了公共单细胞RNA测序数据集和小鼠ILC2批量RNA测序数据，均未在ILC2s中检测到经典褪黑素受体Mtnr1a（MT1）和Mtnr1b（MT2）的表达。功能实验表明，选择性MT1或MT2激动剂无法模拟褪黑素对ILC2产生IL-5和IL-13的抑制作用，而相应的拮抗剂也无法阻断褪黑素的抑制作用。此外，褪黑素在实验浓度下不影响ILC2的活力。这些转录组学和功能数据共同排除了经典MT1或MT2受体信号在褪黑素介导的ILC2功能调节中的必要性。

4. 褪黑素对ILC2介导的气道高反应性发挥独特的保护作用

通过过继转移实验，研究人员将体外经褪黑素或载体预处理的活化ILC2s过继转移到缺乏适应性免疫的Rag2^-/-GC^-/-小鼠中。结果显示，与载体处理的ILC2s相比，褪黑素预处理的ILC2s诱导的肺部炎症、上皮增厚、嗜酸性粒细胞增多和气道高反应性均显著减轻。这直接证明了褪黑素能够特异性地抑制ILC2s的效应功能，从而减轻其驱动的气道病理。

5. 褪黑素重编程活化ILC2s的效应状态和代谢

对褪黑素处理的ILC2s进行批量RNA测序分析发现，其转录组谱发生显著变化。促炎基因（如Il5、Il13、Csf2）表达下调，而分子生物钟组件（如Arntl）和谷胱甘肽合成相关基因（如Gclc）表达上调。体外功能实验证实，褪黑素处理降低了ILC2s产生IL-5、IL-13、IL-9、IL-6、IL-10等多种细胞因子的能力，并降低了活化标志物KLRG1的表达，但不影响其谱系决定转录因子GATA-3的表达，表明褪黑素改变了ILC2的效应状态而非谱系身份。

代谢层面，RNA-seq显示糖酵解、三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化通路基因广泛下调。功能实验证实，褪黑素处理的ILC2s乳酸产量减少，糖酵解中间体果糖-6-磷酸（F6P）水平降低，但葡萄糖-6-磷酸（G6P）水平和葡萄糖摄取未受影响，提示葡萄糖代谢流在糖酵解早期发生了分流。β-氧化通路基因也下调，其终产物β-羟丁酸积累减少。线粒体功能分析显示，褪黑素处理导致线粒体尺寸增大、膜电位降低（去极化）。Seahorse代谢分析进一步证实，褪黑素处理的ILC2s基础呼吸、备用呼吸能力、糖酵解速率和糖酵解能力均下降。这些数据表明，褪黑素深刻扰乱了ILC2的代谢，使其进入一种与促炎效应表型不相容的代谢状态。

6. 褪黑素驱动ILC2s中谷胱甘肽的积累

转录组分析发现，褪黑素处理显著上调了谷胱甘肽代谢相关基因，特别是戊糖磷酸途径限速酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）和NRF2的经典靶基因Gclc、Gclm。功能上，褪黑素处理增加了ILC2s细胞内NADPH和谷胱甘肽水平，并伴随NRF2蛋白以及谷胱甘肽合成限速酶GCLC、GCLM表达升高，而促进谷胱甘肽氧化的谷氧还蛋白（GLRX）表达降低。谷胱甘肽合成依赖于半胱氨酸的可用性，当使用伊马唑酮erastin（IKE）抑制半胱氨酸/谷氨酸逆向转运体System Xc^-，从而限制半胱氨酸输入时，褪黑素诱导的谷胱甘肽积累被阻断，同时其对ILC2产生IL-5和IL-13的抑制作用也被逆转。这表明褪黑素以谷胱甘肽依赖的方式抑制ILC2效应功能。

7. 褪黑素通过激活NRF2抑制ILC2功能

研究人员假设褪黑素通过激活NRF2-GSH轴发挥作用。使用已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准的NRF2激活剂富马酸二甲酯（DMF）处理ILC2s，发现其能模拟褪黑素的作用，诱导谷胱甘肽积累、NRF2表达增加，并抑制IL-5和IL-13的产生。相反，使用反义吗啉寡核苷酸阻断Nfe2l2（编码NRF2）的翻译，则消除了褪黑素诱导的谷胱甘肽积累及其对ILC2细胞因子产生的抑制作用。这些结果表明，NRF2是褪黑素信号通路中的核心介质，连接了褪黑素与细胞氧化还原机制。

8. 褪黑素以谷胱甘肽依赖性方式对人ILC2s发挥免疫调节作用

为验证临床相关性，研究人员从健康成人外周血中分离了人ILC2s。与小鼠ILC2s类似，褪黑素处理增加了人ILC2s中GCLC和NRF2的表达，并诱导了细胞内谷胱甘肽的积累。这种积累可被IKE阻断。功能上，褪黑素显著抑制了人ILC2s产生IL-5、IL-13和IL-4，而IKE共处理则废除了这种免疫抑制作用。这表明褪黑素依赖的NRF2激活和谷胱甘肽介导的效应功能抑制在小鼠和人ILC2s中是保守的。

四、 讨论与结论

本研究的讨论部分深入阐述了研究发现的意义和潜在机制。研究人员指出，哮喘症状的昼夜变化已被认识数十年，但其背后的激素机制仍未完全明了。本研究提出，褪黑素可作为ILC2s的代谢调节剂，将葡萄糖利用从产能途径转向支持氧化还原的途径，从而抑制炎症效应程序。

研究发现，即使在褪黑素缺陷的BALB/c小鼠中，外源性褪黑素也能调节ILC2功能。然而，在具有内源性褪黑素节律的小鼠（如CBA品系）中，评估褪黑素治疗的时序效应将是未来研究的重要方向。研究还指出，哮喘患者经常表现出血清褪黑素节律紊乱，特别是峰值相位延迟。鉴于NRF2及其靶基因（如Gclc、Gclm）在肺中表现出昼夜振荡，且肺谷胱甘肽水平也有显著昼夜变化，因此，哮喘中褪黑素节律的病理后果可能源于褪黑素可用性与ILC2等关键免疫细胞中NRF2驱动的氧化还原程序之间的时间不匹配。

机制上，本研究支持褪黑素可能直接与KEAP1结合，破坏其与NRF2的相互作用，从而激活NRF2，促进抗氧化反应元件驱动的基因表达，包括Gclc和Gclm。本研究将褪黑素这一经典的昼夜节律激素确立为ILC2s中NRF2-谷胱甘肽轴的关键上游激活因子，为先前发现的NRF2是ILC2活化的关键抑制因子提供了缺失的因果链接。

在转化潜力方面，研究人员指出，临床用于治疗睡眠障碍的褪黑素剂量较低，而将其用作免疫调节剂可能需要更高的剂量。本研究揭示的NRF2-GSH轴为治疗干预提供了新靶点。例如，使用DMF等NRF2激活剂可能提供一种独立于褪黑素的治疗策略，既能利用对哮喘昼夜病理生理途径的理解，又能利用现有的靶向氧化还原的治疗方法，同时最大限度地减少激素疗法的脱靶效应。未来的研究需要包括时间治疗学研究，以评估外源性褪黑素或NRF2激活剂在疾病背景下的最佳给药时机。

研究结论翻译如下：

总而言之，我们的研究结果确定了褪黑素作为一种通过谷胱甘肽依赖性、受体非依赖性途径调节ILC2效应功能的因子。褪黑素将细胞代谢从糖酵解和氧化磷酸化重定向至生成NADPH的戊糖磷酸途径，从而增强NRF2活性和谷胱甘肽生物合成。这些结果揭示了昼夜节律激素节律、细胞氧化还原稳态和先天淋巴细胞活性之间的机制联系。未来使用具有褪黑素能力的小鼠、受体非依赖性的遗传验证以及时间给药模式的研究，对于确定褪黑素-谷胱甘肽轴是否可用于治疗哮喘至关重要。