利尿剂对实验性近视的抑制作用表明，视网膜离子转运过程在调节眼球生长中起着关键作用

《Frontiers in Medicine》：Diuretic inhibition of experimental myopia implicates retinal ion-driven efflux in the regulation of ocular growth

　　摘要
引言：近视（短视）的特征是眼球过度生长，是最常见的视觉障碍，也是日后失明的最大风险因素，尽管其病因尚不确定。我们之前曾提出，眼球体积的调节与视网膜离子驱动的液体从玻璃体流入脉络膜淋巴窦的速率有关，并预测常用的临床批准利尿剂（如阿米洛利、布美他尼和呋塞米）由于作用于视网膜和RPE（视网膜色素上皮）中的不同离子交换器和阳离子-氯离子共转运蛋白机制，因此会对通常导致近视和远视（长视）的光学离焦产生不同的、依赖信号的效果。

方法：在孵化后第5天，169只雏鸡通过玻璃体注射5微升1 mM的阿米洛利（一种节省钾的利尿剂，可阻断钠通道）、布美他尼或呋塞米（两者均为袢利尿剂，主要抑制Na+/2Cl–/K+共转运蛋白），载体使用DMSO，或者仅使用DMSO作为对照。随后给这些雏鸡佩戴+10D或-10D的镜片，或不佩戴镜片。饲养4天后收集生物测量数据。在没有镜片的情况下记录电视网膜图（ERGs；每组3-4只），以评估利尿剂对视网膜光反应的影响，包括急性反应（第5天）和注射后96小时（第9天）的反应。

结果：呋塞米和阿米洛利减少了负镜片引起的近视发展，而布美他尼和阿米洛利则抑制了正镜片引起的远视发展。ERG波形显示，注射药物后视网膜完整性得以保持，且ON通路与OFF通路信号的强度发生了变化。

讨论：由此可见，能够改变视网膜功能及相关离子驱动的液体从玻璃体流入脉络膜的利尿剂能够抑制由离焦引起的屈光不正。这突显了类似利尿剂的药物在治疗近视及其相关眼部病理中的潜力。

1 引言
近视（短视）和远视（长视）是全球最常见的视觉障碍，随着城市化、教育和技术的发展，近视的患病率和严重程度急剧增加，且发病年龄提前（1-3）。大约15-20%的近视患者在未来可能会发展成严重的视力威胁性疾病，如青光眼、视网膜黄斑病变和视网膜脱离（4-7）。因此，如果想要限制和管理极度近视相关的更严重并发症，识别出针对近视眼轴延长的治疗方法至关重要。近视发生时，眼睛的轴长和光学成分导致图像在玻璃体腔内聚焦，而不是在视网膜上。在动物中可以通过单眼遮盖或负离焦镜片来模拟实验性近视，以诱导过度的眼球生长并触发屈光补偿。眼球总体积由睫状体的液体产生和从前房通过施莱姆管以及从玻璃体到脉络膜的液体流动之间的平衡控制（8）。这种流动是由睫状体和视网膜色素上皮（RPE）上皮细胞的极化膜驱动的（9-11）。事实上，Gallermore等人（12）和Steinberg等人（13-20）详细阐述的光明/黑暗调节机制、离子转运以及视网膜下空间（SRS）和RPE体积的变化，构成了“视网膜离子驱动流动（RIDE）模型”（21）的基础。RIDE模型认为，外部视网膜细胞活动与SRS和RPE的离子微环境之间的相互作用，包括Cl–、Na+和K+的转运以及通过视网膜细胞类型表达的aquaporin（AQP）通道的水转运（13, 22, 23），决定了视网膜液体的流出速率，从而成为响应光学离焦导致快速眼球生长的关键机制。越来越多的发现驱动的分子研究支持了离子和液体转运机制在眼睛屈光不正发展中的重要性，这些研究既包括人类也包括动物模型。全基因组关联研究一致表明，与屈光不正相关的位点富含离子通道和转运蛋白活性，特别是涉及阳离子转运的位点（24-26），并且这些位点在生命早期就对屈光发育产生影响（26）。重要的是，视网膜/RPE中离子和溶质转运蛋白表达的不同发育轨迹（包括与GABA信号传导相关的）区分了动物模型中镜片引起的近视和远视模型（27, 28）。进一步支持离子介导的信号传导在近视中的作用的是遮盖实验，其中雏鸡视网膜的严重形缺近视与通过下调甘氨酸和GABA离子型受体抑制配体门控的氯离子转运途径有关（29）。同样，小鼠遮盖性近视的转录组分析发现，与离子转运相关的基因谱系，尤其是钾通道，是差异表达的长非编码RNA的主要特征，GABA信号传导途径也参与其中（30）。这些发现共同表明，离子转运和抑制性神经传递这两种对视网膜光处理至关重要的机制，在遗传、蛋白质组学和转录组学层面都反复被证实与屈光不正的发展有关。尽管有这些证据，但直接通过调控视网膜液流动来控制屈光发展的实验操作仍然有限。到目前为止，唯一明确通过调节离子驱动的液体转运来针对近视的研究使用了袢利尿剂布美他尼，这是一种选择性抑制CCC（阳离子-氯离子共转运蛋白）家族中的NKCC共转运蛋白的化合物（31），并证明了其对负离焦镜片的屈光补偿具有抑制作用，但对正离焦镜片则没有这种效果（32）。其他临床批准的利尿剂尚未系统的用于近视控制，尽管有大量证据表明，如呋塞米（一种具有广泛CCC活性的袢利尿剂）、阿米洛利（一种节省钾的利尿剂，作用于钠-氢交换）（33）和阿扎唑胺（一种碳酸酐酶抑制剂）等药物可以拮抗视网膜、视网膜色素上皮（RPE）和睫状体中的液体转运过程（20, 32, 34-49）。CCC转运蛋白家族在将光诱发的视网膜活动与离子和水流连接起来方面起着核心作用。这些普遍存在的蛋白质介导了氯化物离子与钾和/或钠的电中性转运，同时伴随着水分子的运动（20, 50, 51）。在视网膜中，NKCC和KCC转运蛋白同时表达在RPE和视网膜的ON细胞和OFF细胞上，它们建立了不同的细胞内Cl–梯度，这对光增量和减量的去极化和超极化反应至关重要（52-55）。通过这些机制，光驱动的视网膜ON和OFF通路的激活与氯化物和钾的流动以及视网膜和RPE中的水流紧密相关（图1）。

图1 利尿剂在视网膜和视网膜色素上皮（RPE）中的作用部位。神经视网膜和视网膜色素上皮（RPE）的示意图，显示了利尿剂在Müller胶质细胞内以及RPE顶端（朝向光感受器）和基底外侧（朝向脉络膜）膜上的潜在作用部位。药物敏感的通路包括对阿米洛利敏感的ENaC和NHE，以及对布美他尼和呋塞米敏感的NKCC和KCC，以及调节液体和离子稳态的关键离子转运机制（Na+/K+-ATP酶、NBC、AE2、CFTR和K+/Cl–通道）。肾上腺素（EP）被标记为离子转运的调节剂。部分图示来源于https://BioRender.com。ENaC，上皮钠通道；NHE，Na+/H+交换蛋白；NKCC，Na+-K+-2Cl–共转运蛋白；KCC，K+-Cl–共转运蛋白；Na+/K+-ATP酶，钠-钾ATP酶；NBC，钠碳酸氢盐共转运蛋白；AE2，阴离子交换蛋白2；CFTR，囊性纤维化跨膜传导调节因子；EP，肾上腺素。部分图示来源于https://BioRender.com。

与此框架一致，药理学上的CCC抑制剂显著改变了依赖光的液体动力学。布美他尼作为最选择性的NKCC抑制剂（59, 60），已被证明可以减少RPE顶端膜的K+和Cl–的转运（34, 36, 61-63），从而增加了视网膜到脉络膜的液体吸收（14, 64）。在雏鸡中，这导致视网膜下空间体积的急性抑制和视网膜粘附性的增强（14, 64）。呋塞米同样影响NKCC转运，但对KCC介导的通路更为敏感（65），而阿米洛利通过抑制钠交换也急性减少了光诱导的视网膜下空间扩张（如（12, 66）中总结的），并改变了非色素上皮和睫状体的体积（67-69）。这些发现共同支持了一种模型，即依赖光的视网膜信号通过离子驱动的机制调节视网膜液流（因此调节眼球生长）。因此，本研究旨在测试RIDE模型的关键预测，该模型提出光学离焦（特别是引起近视的负离焦）的屈光补偿是由离子转运蛋白介导的视网膜和RPE间的液体流动调节的。具体来说，我们检查了使用具有不同作用机制的临床批准利尿剂（布美他尼、呋塞米和阿米洛利）对膜结合离子共转运蛋白进行药理学操作是否可以在屈光发育过程中调节眼球生长反应。为了确定观察到的效果是否依赖于施加的光学离焦，我们将负镜片和正镜片引起的离焦对眼睛的反应与无镜片条件进行了比较，从而能够在没有屈光模糊的情况下评估利尿剂对眼球生长的影响。此外，我们还旨在表征利尿剂介导的视网膜离子转运扰动对光诱导的视网膜功能的影响。具体来说，使用电视网膜图来评估在基线（无镜片）条件下，无论是急性注射后还是经过4天的饲养期后，药物对视网膜ON通路和OFF通路反应以及外层视网膜活性的影响。这种方法用于确定利尿剂引起的视网膜光处理调节是否在短期内和长期内都存在，并且这些药物应用后是否会对视网膜功能产生潜在的负面影响。

2 材料和方法
2.1 伦理声明
所有程序均按照拉筹伯大学动物伦理委员会指南（批准号08/30P）进行，并遵守1986年11月24日的欧洲共同体理事会指令（86/609/EEC）和ARVO关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明。在整个饲养期间，每天两次监测雏鸡的福利和镜片的清洁度；所有方案都旨在最小化动物的痛苦，所有外科手术都在氯胺酮/赛拉嗪麻醉下进行。

2.2 动物和饲养
从当地孵化场获得的169只雄性孵化雏鸡（Leghorn/Australorp）从第0天到第9天在12/12小时的昼夜周期下，在光线和温度受控（30 ± 0.5°C）的环境中饲养。在正常日间（ND）光照周期的12小时内，通过天花板上的20W卤素灯保持环境照度恒定为183勒克斯。实验程序直到第5天才开始，以便左眼视神经的髓鞘化与右眼达到平衡（70, 71）。使用雄性雏鸡是为了尽量减少神经内分泌因素对药物与离子通道功能相互作用的潜在影响。每种条件下的动物数量见补充表1。在孵化后第5天，雏鸡在一天周期的中间通过肌肉注射氯胺酮45 mg/kg和赛拉嗪4.5 mg/kg进行麻醉，然后用DMSO载体将5 μL的1 mM布美他尼、呋塞米或阿米洛利中的任何一种注射到右眼（实验眼[EE]的玻璃体内，每种利尿剂的最终浓度为5 × 10–6M（Sigma-Aldrich，圣路易斯，MO）。药物剂量基于上述大量文献中关于这些化合物对视网膜和RPE液体调节的影响的研究（8, 12, 14, 34, 41, 42, 63, 72-75），以及我们自己的初步研究（32）。选择DMSO作为主要载体而不是生理盐水，因为阿米洛利和布美他尼不溶于PBS，而所有三种利尿剂都溶于DMSO。左眼被注射了5微升的DMSO，以控制由于在DMSO载体溶液中注射药物后玻璃体内体积增加5微升所导致的生物学效应。注射玻璃体内溶液后，将一副单眼散光眼镜（+10 D或-10 D）固定在眼睛上，这种眼镜由改良型的人造聚合物甲基丙烯酸甲酯（PMMA）硬性隐形眼镜制成（直径8.1毫米；Australian Custom Lenses，澳大利亚维多利亚州），并通过一个22毫米的魔术贴钩环固定在眼周的羽毛上，持续4天。+10 D或-10 D的光学散光条件分别预期会诱发远视和近视。还设立了一个无眼镜对照组，以评估利尿剂在不引起视物模糊情况下对眼睛的影响。

**2.3 生物测量分析**
在第9天，即非药物处理组的动物应达到最大屈光补偿时，对雏鸡进行麻醉（酮胺45毫克/千克：赛拉嗪4.5毫克/千克），并使用视网膜镜检查其眼睛的屈光情况（Keeler, Vista Diagnostic Instruments）。使用A-Scan超声检查（A-Scan III，TSL：Teknar公司，圣路易斯，7兆赫探头）至少测量三次以获取轴径尺寸。

**2.4 电生理学分析**
为了更好地了解实验药物对视网膜功能的影响，在单次玻璃体内注射上述相同体积和浓度的三种药物或仅注射载体后的0小时和96小时，测量了无眼镜雏鸡（每组3-4只）的ERG（视网膜电图）。采用了一个500毫秒亮光开启、500毫秒亮光关闭的方波刺激方案（150毫米全场刺激器，峰值亮度50坎德拉/平方米（Tektronix J6523窄角亮度探头），以便分别观察视网膜的亮光开启和关闭反应。在酮胺/赛拉嗪麻醉（45毫克/千克：赛拉嗪4.5毫克/千克肌肉注射）下，通过导管放置单元插入玻璃体内电极（Ag/AgCl），并参考巩膜进行测量。信号在保持麻醉状态的暗适应动物中由Powerlab放大器（ADI，悉尼，澳大利亚）记录，并通过带通滤波器（0.3–1,000赫兹）处理。每次测量平均20个电位，每只眼记录5次这样的测量结果。使用IGOR Pro 6.22软件生成图表。

**2.5 数据分析**
前述分析中使用的生物测量数据包括从实验眼减去同侧眼所得的结果，用于比较屈光状态、轴径长度、玻璃体腔深度和前房深度等变量。将每只动物的结果求和并平均，以获得每个因变量的平均差异，从而控制受试者内部效应，如雏鸡整体大小的微小变化。排除了超出箱线图四分位距1.5倍的异常值后，使用JASP统计软件（84）进行2（3种眼镜×4种药物）因素方差分析（ANOVA），显著性标准为α=0.05。使用Tukey或Games-Howell进行事后检验以检查显著的主效应，并在适当的情况下通过简单主效应分析进一步探讨交互效应。为了研究屈光状态与眼生长测量之间的关系，计算了屈光误差、轴径长度、玻璃体腔深度和前房深度之间的皮尔逊相关系数。首先在整个数据集范围内评估相关性，以了解生长和屈光之间的总体关联。然后，在控制眼镜条件的影响下进行偏相关分析，以确定这些关联是否由视物模糊引起。这种方法允许独立于眼镜诱导的效应来评估屈光和生长之间的关系。

**3 结果**
**3.1 眼镜和利尿剂对屈光误差及眼生长的影响**
**3.1.1 利尿剂调节屈光误差的发展**
注射后4天（孵化后第9天），每种利尿剂都改变了通常由眼镜引起的散光所导致的生长反应。总体而言，三种利尿剂都抑制了-10D眼镜的屈光补偿，其中氨氯地平的抑制作用最为显著。布美他尼对+10D眼镜的屈光补偿抑制作用最强（见图2a和补充表1）。与这些观察结果一致，双向ANOVA显示眼镜条件对屈光状态有显著的主效应（F2, 131 = 1058.32, p < 0.001, ηp2 = 0.942），药物治疗有显著的主效应（F3, 131 = 8.56, p < 0.001, ηp2 = 0.164），以及眼镜×药物之间的显著交互效应（F6, 131 = 7.35, p < 0.001, ηp2 = 0.252），表明利尿剂对屈光的影响强烈依赖于施加的散光方向。事后分析显示，在负镜片条件下，呋塞米和氨氯地平显著抑制了近视，而布美他尼的屈光误差与DMSO对照组无差异。相比之下，在正镜片条件下，布美他尼处理的眼睛远视程度低于所有其他药物组，氨氯地平处理的眼睛也低于DMSO对照组，这表明该药物部分减少了远视补偿。在无眼镜条件下，各药物组之间的屈光状态没有显著差异，表明利尿剂处理并未改变无散光状态下的基线屈光。

**图2**
利尿剂处理对眼镜引起的散光下的屈光补偿和眼生长的影响。注射后4天（孵化后第9天），不同眼镜条件（-10D、+10D、无眼镜）和药物处理（DMSO、氨氯地平、布美他尼、呋塞米）下的（a）屈光状态、（b）轴径长度、（c）玻璃体腔深度和（d）前房深度的平均值±标准误。负镜片条件引起近视补偿，正镜片条件引起远视补偿。利尿剂处理不同地改变了这些反应：氨氯地平和呋塞米在-10D眼镜下抑制了近视补偿，而布美他尼在+10D眼镜下最强烈地抑制了远视补偿。轴径长度的变化大致与屈光结果一致，具有轻微的药物依赖性调节。相比之下，玻璃体腔深度主要受眼镜条件影响，药物效应较小。前房深度显著受到药物处理的影响，与眼镜条件无关，氨氯地平增加了前房深度，而呋塞米则减少了前房深度。

**3.1.2 轴径长度和玻璃体腔深度显示利尿剂对生长的中等影响**
平均数据表明，轴径长度和玻璃体腔伸长的测量结果与屈光状态的变化基本一致（见图2b）。通过轴径长度评估总体眼尺寸时，显示眼镜（F2, 142 = 447.45, p < 0.001, ηp2 = 0.863）和药物（F3, 142 = 3.75, p = 0.012, ηp2 = 0.073）有显著的主效应。眼镜×药物交互效应接近统计学显著性（F6, 142 = 2.07, p = 0.060, ηp2 = 0.080），表明药物效应存在轻微的眼镜依赖性调节。简单主效应分析显示所有眼镜组之间的轴径长度有显著差异，氨氯地平和呋塞米处理的眼睛之间存在显著差异，总体而言，氨氯地平处理的眼睛最长，呋塞米处理的眼睛最短。这些发现表明利尿剂对轴径长度有可测量的影响，尽管这些影响的幅度有所不同，并且仅弱依赖于散光的符号。

**3.1.3 前房深度**
有趣的是，前房深度显著受到眼镜条件（F2, 153 = 9.58, p < 0.001, 部分η2 = 0.111）和药物处理（F2, 153 = 6.24, p < 0.001, 部分η2 = 0.109）的影响，眼镜×药物交互作用不显著（F2, 153 = 1.42, p = 0.209, 部分η2 = 0.053）。这些结果表明药物效应在不同眼镜条件下是一致的。事后分析显示，氨氯地平通常与前房深度增加有关，而呋塞米导致的前房深度减少与DMSO对照组相比（见图2d）。这些发现表明前段生长对离子转运机制的药理调节敏感。表1和表2总结了所有生物测量指标的主要统计结果及其与眼镜和药物靶点的关系。

**表1**
屈光状态、轴径长度、玻璃体腔深度、前房深度的主要统计结果

**表2**
结果指标
主效应：眼镜、药物
眼镜×药物交互作用
事后总结
药物靶点总结
屈光状态
显著（强效应）
显著（中等效应）
-10D眼镜：氨氯地平（ENaC）和呋塞米抑制了近视补偿；布美他尼没有变化。
+10D眼镜：布美他尼最强烈地抑制了远视补偿。
无眼镜：各药物组之间无差异。

**3.2 屈光误差与眼尺寸之间的关系**
皮尔逊相关系数分析揭示了生物测量指标之间的总体关联，显示屈光状态、轴径长度和后眼尺寸之间存在强相关性（见图3a）。屈光误差与轴径长度和玻璃体腔深度高度相关，这与轴径延长是屈光变化的主要结构相关性一致。轴径长度和玻璃体腔深度之间也存在强相关性。屈光误差与前房深度之间的相关性较弱，但仍显著，表明前房生长对屈光状态有次要贡献。部分相关性分析在控制了晶状体条件的情况下进行，以确定这些关系是否由光学离焦引起。分析结果显示，前房深度对折射补偿的贡献小于玻璃体腔深度和轴长（图3b）。这些发现表明，利尿剂并不破坏折射误差与眼后部生长之间的预期关联。

图3：热图显示了（a）所有条件下折射误差、轴长、玻璃体腔深度和前房深度的零阶相关系数，以及（b）控制晶状体条件（-10 D、+10 D或无晶状体）时折射误差、轴长、玻璃体腔深度和前房深度的部分相关性。红色越深表示负相关性越强，蓝色越深表示正相关性越强，颜色强度反映了相关性的大小。***p < 0.0001。

3.3 利尿剂对外层视网膜功能的电生理学评估

为了监测载体溶液DMSO及其中所含的三种利尿剂对外层视网膜功能的影响，分别在注射后0小时和96小时对无晶状体鸡苗进行了视网膜电图记录。图4展示了所有三种药物与DMSO相比在0小时和96小时时的100次记录的平均值（±标准误差）及其变化（阴影表示标准误差）。

图4：单次注射阿米洛利（a）、布美他尼（b）和呋塞米（c）后0小时和96小时记录的标准误差条纹的平均视网膜电图（ERGs），并与DMSO（在注射后0小时或96小时记录）进行比较。ERGs显示，在闪光刺激开始时出现了预期的a-/b波复合波，在刺激结束时出现了d波。与时间匹配的DMSO对照组相比，0小时阿米洛利和96小时布美他尼组中的b波强度降低（见图4和表3）。双向ANOVA分析显示，药物对b波有显著的主效应（F3, 19 = 4.17, p = 0.020, partial η2 = 0.397）。进一步的事后分析表明，阿米洛利和布美他尼组的b波均显著低于呋塞米组。未观察到药物或药物与时序交互作用对a波或d波幅度的影响。这些b波幅度的变化影响了b/d波比率（即ON通路与OFF通路信号强度的比率），0小时和96小时的阿米洛利和布美他尼组鸡苗的b/d比率低于年龄匹配的DMSO对照组。相比之下，96小时的呋塞米组鸡苗的b/d比率显著高于DMSO对照组（见表3）。

表3：注射后不同时间点的药物对AMiloride、Bumetanide、Furosemide引起的平均a波幅度（μV）、平均b波幅度（μV）和平均d波幅度（μV）以及a波与b波的比率。

4. 讨论

本研究结果表明，单次注射常用利尿剂会通过影响视网膜和RPE的离子转运机制来改变折射补偿，这些机制调节视网膜/RPE中的Na+、K+和Cl-的流动，从而导致ERG反应的变化，反映了视网膜离子动力学和相关神经传递的变化。这为利尿剂通过调控玻璃体到脉络膜的液体交换速率及渗透压梯度来影响眼生长提供了证据。相对于DMSO对照组，通过利尿剂分别选择性地抑制NKCC1或KCC2共转运蛋白或Na+/H+交换蛋白（布美他尼、呋塞米或阿米洛利）4天，可以减少佩戴-10 D晶状体的幼鸡的近视程度。这些药物还表现出对+10 D离焦补偿的抑制作用，这与折射测量中的晶状体×药物交互作用一致。该研究扩展了Crewther等人的早期实证发现（32）和RIDE模型的理论预测（21），证明了离子共转运系统破坏后折射状态和眼生长的调节。最近的分子和超微结构分析也表明，视网膜/RPE/脉络膜复合体维持着稳定的Na+、K+和Cl-的空间有序梯度，这些梯度依赖于Na+/K+泵、NKCC和KCC共转运蛋白及相关胶质细胞的协调活动（86–88），并且在模糊条件下这些梯度会迅速发生离子和基因相关的变化（27, 29, 89, 90）。这些发现共同表明，利尿剂的施用可能有效减少由离焦引起的生长，从而减轻通常会导致更严重近视及相关病理的情况（4, 91, 92）。由于目前治疗近视的方法（如眼镜矫正或角膜激光手术）不能降低相关病理的风险，将这些发现转化为哺乳动物模型，最终应用于人类近视的研究至关重要。

4.1 利尿剂对离焦折射补偿中视网膜离子转运的调节

阿米洛利和呋塞米在蛋白质靶点上的特异性低于布美他尼。阿米洛利抑制上皮钠通道和Na+/H+交换蛋白，这些过程对细胞内pH调节、渗透压平衡和跨上皮水分传输至关重要（33, 93–95）。布美他尼和呋塞米抑制Na+-K+-2Cl-共转运蛋白，其中布美他尼对NKCC1的选择性更强，而呋塞米还会影响双极细胞和光感受器上的KCC受体（42, 60, 65, 96–100），并在一定浓度下影响光感受器和双极细胞的氯离子传导性。在本研究中，阿米洛利在4天的饲养后普遍抑制了对任何方向离焦的补偿，表明这种药物通过影响RPE和睫状上皮顶膜的Na+依赖性转运系统，全局性地影响眼细胞稳态。这种破坏可能会影响Müller细胞对细胞外Na+、K+和Cl-的缓冲作用，进而影响神经元兴奋性和液体调节，可能影响线粒体功能和维持视网膜信号传导的能量能力（16, 95, 101, 102）。

呋塞米也显著降低了近视补偿。这与通常通过KCC和NKCC介导的Cl-跨视网膜神经元、Müller细胞和RPE的液体流出受到破坏的情况一致，导致了对负镜度离焦的折射补偿减少，并引起轴长和玻璃体腔深度的轻微变化。这表明呋塞米可能通过更选择性地干扰依赖Cl-的液体交换来干扰对眼离焦信号的响应。相比之下，布美他尼对负镜度镜片的补偿影响较小，但显著降低了远视补偿，这可能反映了其对NKCC共转运系统的更特异性调节。布美他尼对负光学离焦的折射补偿作用减弱可能与之前的Crewther等人（32）的研究结果不同，可能是因为载体（DMSO与生理盐水）的差异，DMSO由于诱导膜通透性孔隙增加了亲水性物质和液体的跨脂质膜进入（103–105）。

4.1.1 利尿剂治疗对前房的影响

特定药物对前房深度的改变也与药物对眼部不同离子通道介导的液体传输的影响一致，表明药物输送影响了前房的液体动态。阿米洛利与前房加深有关，尤其在负镜度条件下最为明显，这可能与抑制上皮钠通道和Na+/H+交换途径有关，这些途径调节房水的分泌和流出，从而将眼内液体积聚到前房（33, 46, 106）。相比之下，呋塞米导致前房变浅，这与破坏Cl-依赖的传输机制有关，这些机制促进房水的形成和渗透压平衡，减少了液体分泌，从而改变了前部结构的渗透压梯度（33, 107–111）。与Crewther等人（32）的研究一致，布美他尼引起的前房深度变化较小且不稳定。因此，前房深度对利尿剂引起的液体动态变化敏感，但这可能是由离子浓度梯度而非离焦信号本身驱动的。

4.2 ERG波形变化作为离子稳态改变的功能指标

ERG波形变化对外层视网膜过程和RPE电阻的变化敏感，主要来自光感受器、双极细胞和Müller细胞对光线开始和结束的响应（112）。ERG波形变化受到外层视网膜过程和RPE电阻变化的影响，主要来自光感受器、双极细胞和Müller细胞对光线开始和结束的响应（112），因此可以反映利尿剂对视网膜离子运输和相关神经元功能的调节。正如预期的那样，阿米洛利和呋塞米确实改变了ERG波形。特别是，阿米洛利和布美他尼减少了b波及其相关b/d比率，而呋塞米增强了b波和b/d比率。先前的研究也报告了呋塞米、布美他尼和阿米洛利急性给药后b波的浓度依赖性和可变调节（39, 43, 72）。这些结果进一步证明，改变的视网膜离子微环境（可能通过Müller细胞的钾交换、钠依赖性转运蛋白和下游RPE的液体流动）可能会影响玻璃体到脉络膜的液体流出速率，并改变外层视网膜的响应性，从而调节轴长和随后的折射状态。这支持了离子调节、SRS水合作用和ON/OFF通路信号传导之间的相互作用对眼生长模式的影响。

4.3 离子运输、跨视网膜电位和液体流动在折射补偿中的作用：对近视治疗调节的启示

总体而言，这些发现支持了一种模型，即视网膜离子运输和渗透压调节在视觉引导的眼生长中起着重要作用。利尿剂似乎通过改变离子驱动的液体流动来调节视网膜信号转化为轴长变化。未来的工作应进一步探讨细胞对视觉环境因素的反应与眼生长改变之间的联系，以及离子稳态之间的关系。特别是Müller胶质细胞在整合离子运输与神经元功能方面起着关键作用（16, 17, 22）。通过调节细胞外离子交换、pH值和液体流动，Müller细胞建立了影响突触增益和神经元兴奋性的离子环境。NKCC、KCC或Na+/H+交换的破坏预计会改变Müller细胞的缓冲能力（22），从而导致膜电位、细胞内氯离子水平和视网膜神经元及RPE的渗透压平衡的次级变化。这些离子变化预计会间接影响Ca+依赖的过程，包括光感受器-双极突触处的谷氨酸能传递和抑制性GABA能信号传导，从而改变ON/OFF通路的平衡。在系统层面，这些机制与强调离子驱动液体动态的拟正视化模型一致。Marshall和Crewther（86, 87）描述的渗透压梯度和Crewther等人（113）提出的时间ON/OFF调节模型都预测，视网膜离子运输能力限制了视觉信号转化为跨视网膜电位变化的方式，进一步支持了这一解释。眼睛在结构化视觉场景中的运动可能会根据离焦的符号产生快速ON/慢速OFF或快速OFF/慢速ON的时间不对称性，从而调节跨视网膜电位和液体流出（113）。利尿剂对离子传输的干扰可能会通过限制视网膜维持离子梯度的能力来减弱这些视觉驱动的变化，从而减轻近视生长，但不完全消除拟正视化。测试利尿剂引起的离子梯度变化如何影响离子稳态、视网膜信号传导和眼生长之间的因果关系对于确定治疗严重近视的机制至关重要。由于这些系统对神经元活动以及离子转运蛋白动态的变化非常敏感，它们可能为我们提供关于视网膜离子平衡变化如何影响眼睛生长和近视预防的长期调节机制的见解。4.4 局限性：虽然不能完全排除其他解释因素，如全身药物效应、视网膜适应以及视网膜阻抗的变化，但无晶状体眼睛中没有出现生物测量学上的改变，而在眼睛之间的差异测量中却观察到了相关效应，这表明作用机制并非纯粹的全身性的；同时，ERG波形结构的保留也排除了非特异性毒性的可能性。ERG测量结果提供了有关ON通路和OFF通路活动的间接指标，但无法将效应定位到具体的转运蛋白上；因此，需要进一步的研究来探讨利尿剂注射后药物作用机制与折射补偿机制之间的联系。尽管鸡视网膜和人视网膜在解剖结构和生理功能上存在细微差异，但调控视网膜液体平衡以及维持视网膜离子和水分平衡的基本细胞组织和机制在两种物种中都是通过类似的离子转运蛋白和水通道蛋白缓冲系统来实现的。利尿剂作用于这些保守的通路，因此其作用机制在鸡和人的视网膜组织中预计也会表现出相似性。因此我们认为，利尿剂影响的生理机制在不同物种间具有足够的共性，从而可以在未来的研究中对鸡和人的视网膜反应进行有意义的比较。5 结论：本研究整合了药理学、生物测量学和电生理学证据，证明了通过对视网膜/脉络膜视网膜上皮（RPE）中多种离子转运机制的操控来改变液体动力学，会显著影响对晶状体诱发近视和远视的代偿机制，并导致ON通路和OFF通路功能发生药物特异性改变。这些发现进一步支持了RIDE模型，该模型认为离子驱动的液体交换是近视形成的一个关键因素。这些发现强调了需要采取综合性研究方法，超越单一离子层面，探索离子、胶质细胞和神经递质过程如何协同作用以影响视觉引导的眼球生长。因此，通过利尿剂来靶向离子转运系统为近视的治疗提供了新的途径，有助于降低相关眼部病理发展的风险。