羊肝类器官的开发：一种强大的体外实验平台，可减少代谢和营养研究中对实验动物数量的需求

《Frontiers in Veterinary Science》：Development of ovine hepatic organoids: a powerful in vitro platform to reduce the number of experimental animals used in metabolism and nutrition assays

　　摘要背景：肝脏协调着决定牲畜生长、健康和生产效率的代谢过程。在反刍动物中，肝脏代谢适应于支持葡萄糖稳态、脂质分配以及瘤胃发酵期间的氮利用。因此，预测性实验模型对于研究营养物质对肝脏功能的调节至关重要。然而，传统的二维肝细胞培养无法再现天然肝脏组织的结构组织和功能复杂性，这限制了它们的转化价值。方法：从一只雄性Assaf羔羊的肝脏前体细胞中开发出了肝类器官，并通过组织学和免疫荧光分析进行了表征，随后使用RNA-seq进行转录组分析以及功能富集分析。通过添加DL-甲硫氨酸和/或甜菜碱，并通过RT-qPCR分析编码关键代谢酶（例如CPT1A和PDH1）和代表细胞增殖的核糖体蛋白（例如RPL22L1）的基因表达来评估代谢反应。结果：肝类器官形成了具有明确的顶基底极性的球形上皮结构，保持了紧密连接，表现出白蛋白表达和细胞内糖原积累。类器官与天然肝脏组织之间的比较转录组分析支持了核心细胞程序的保守性，尽管差异表达和功能富集分析表明，肝类器官在转录谱上偏向于细胞增殖、蛋白质合成和结构重塑，而与成熟肝脏代谢功能、免疫反应和系统稳态相关的基因则相对下调。DL-甲硫氨酸和甜菜碱联合处理显著增加了CPT1A（与线粒体β-氧化相关）和RPL22L1基因的表达，表明这两种化合物具有协同的代谢响应。讨论：羊肝类器官再现了肝脏组织的结构和细胞特征，证明了它们作为反刍动物体外代谢模型的相关性。转录组比较显示其功能成熟度相对于成年肝脏来说还不完全，这与类器官系统中常见的前体细胞状态一致。尽管如此，类器官保留的代谢反应突显了它们在研究营养物质-基因相互作用和在体内实验前评估饮食干预措施方面的价值。本工作首次报道了羊肝类器官，并为将其作为预测性体外平台用于研究反刍动物肝脏代谢、营养物质-基因相互作用和饲料添加剂策略奠定了基础。

1 引言
肝脏是一个中心的代谢器官，它协调着对生物体稳态至关重要的多种生理过程。它调节氨基酸和氮的代谢、脂质的合成和氧化、碳水化合物的处理、外源物质的解毒以及营养物质的感知，从而共同影响哺乳动物的生长、健康和生产特性（1）。这些综合功能使肝脏能够调节全身能量平衡，应对营养波动，并调节生物合成和分解代谢途径。这在动物生产中尤为重要，因为营养供应的不平衡——无论是不足还是过量——都会降低牛奶或肉类的生产效率（2, 3）。反刍动物（如羊和牛）表现出与其他单胃动物不同的代谢特征。由于瘤胃发酵的作用，很少有葡萄糖直接从肠道被吸收，而丙酸——瘤胃中产生的主要挥发性脂肪酸之一——作为肝脏糖异生过程中的主要底物，提供了大部分用于能量和泌乳所需的葡萄糖（4）。为了最大化糖异生作用，反刍动物肝脏中丙酮酸脱氢酶的活性受到限制，从而在葡萄糖前体（例如由糖酵解产生的丙酮酸）进入三羧酸循环之前调节其氧化。反刍动物肝脏中的线粒体脂肪酸氧化也是能量生产和代谢适应所必需的。此外，瘤胃微生物群在氮和氨基酸代谢中起着核心作用，将 dietary protein 转化为微生物蛋白，同时回收氮，这对于生产效率和减少氮向环境中的损失至关重要（5）。这些独特的肝脏和微生物代谢途径使反刍动物能够有效地从纤维饮食中提取能量和营养物质，在不同的营养条件下调节脂质分配，并维持生长和产品质量（6）。鉴于肝脏代谢是决定动物生产特性的关键因素，包括生长效率和营养物质利用率，开发稳健的实验系统以推进基础生物学和在牲畜物种中的转化应用至关重要。历史上，二维（2D）肝细胞培养和传统细胞系一直作为肝脏研究的体外模型。然而，这些系统无法再现器官的复杂细胞结构，缺乏营养物质和氧气的空间梯度，表现出异常的肝脏特异性功能，无法重现三维（3D）细胞-基质和细胞-细胞相互作用，并且对体内代谢结果的预测能力有限（7）。因此，在传统的2D单层培养中培养的原代肝细胞与完整的肝脏组织相比会发生广泛的转录组和蛋白质组变化，包括基因表达的改变，这可能限制了它们作为肝脏功能模型的生理相关性（8）。为了解决这些问题，三维（3D）肝类器官——由原代组织、前体细胞或多能干细胞衍生的多细胞自组织结构——作为一种先进的体外平台出现了，它们再现了天然肝脏组织的关键特征，包括极化的细胞组织、类似胆管的结构、药物代谢酶（例如CYP450）的活性以及功能输出，如白蛋白分泌和代谢酶表达，从而能够更准确地模拟肝脏功能（9, 10）。这些特性使类器官成为疾病建模、药物毒理学评估和肝脏代谢机制研究的强大工具（10, 11）。在生物医学研究中，肝类器官已被用于研究人类肝脏发育、疾病发病机制和治疗反应，通常比传统的体外和动物模型更好地保持了细胞异质性和功能忠实度（12）。尽管取得了这些进展，但在牲畜研究中，类器官技术尚未得到充分利用，而在这种研究中迫切需要预测性体外模型来研究营养物质代谢、代谢紊乱和特定物种的生理学（13）。实际上，尽管体内研究对于阐明反刍动物肝脏代谢的某些方面是必要的，但它们资源密集且存在伦理限制，这突显了代表性体外系统的需求（14）。为了解决这一差距，我们在这里报道了羊肝类器官的建立和表征，并对类器官与天然羊肝脏组织（原代组织来源）进行了比较转录组分析（RNA-seq），以评估类器官在多大程度上再现了体内表达模式。此外，我们通过添加DL-甲硫氨酸和/或甜菜碱后，通过RT-qPCR定量选定代谢基因的表达来评估代谢反应性。据我们所知，这是关于羊肝类器官的首份报告，本文提供的数据证明了3D羊肝类器官作为预测性体外模型在研究牲畜肝脏代谢、营养物质-基因相互作用和饲料添加剂策略方面的潜力。

2 材料与方法
2.1 羊肝类器官的生成和培养
羊肝类器官是从一只45天大的雄性Assaf羔羊的肝脏前体细胞中获得的。所有动物实验均符合西班牙和欧盟法规（RD 53/2013和2010/63/EU），并得到了CSIC动物实验委员会和相关当局的批准（协议编号100102/2021-6，授权日期为2022年1月31日）。
用于开发肝类器官的方案类似于小鼠肝类器官的报道（15）。简要来说，从雄性羔羊的肝脏中央区域收集3克组织，在死后进行切碎，并使用组织解离方案进行处理。得到的细胞悬液被过滤、沉淀，然后嵌入到Matrigel?基质（Corning?, Discovery Labware Inc., Bedford, MA, United States）中，放置在24孔板中。细胞簇上覆盖HepatiCult?小鼠类器官生长培养基（StemCell Technologies?, Vancouver, BC, Canada），并在37°C下含有5% CO?的条件下培养，每2-3天更换培养基一次。通过轻轻吸移破坏冰冷的Advanced DMEM/F-12（Gibco, Life Technologies Limited, Paisley, UK）中的基质并重新接种沉淀细胞，每周进行一次亚培养。通过每次选择15个类器官在7天时间点拍摄图像来监测类器官的生长情况，使用Nikon Eclipse Ti2显微镜（Nikon Instruments Inc., Tokyo, Japan）和Imaging Source DMK 33UX174相机（The Imaging Source Europe GmbH, Bremen, Germany）测量直径。
经过三次传代后，从两个含有大约200个结构的孔中收获类器官进行长期保存。使用1 mL CryoStor? CS10（StemCell Technologies?, Vancouver, BC, Canada）溶解细胞外基质，然后将得到的类器官悬液转入液氮中保存以备后续使用。
2.2 组织化学和免疫荧光染色
对于组织化学和免疫荧光表征，将7天大的类器官在室温（RT）下用4%无甲醇的甲醛（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States）固定在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中30分钟。固定后，将类器官从Matrigel?细胞簇中释放出来，然后在冰冷的PBS中洗涤两次。为了最小化机械损伤，所有操作都使用口径较粗、修剪过的吸管尖端进行。
对于组织学处理，类器官使用先前发表的方法（16）改编的方案嵌入琼脂糖中。简要来说，将2%高纯度琼脂糖（产品编号4757, Biotools, Madrid, Spain）溶解在PBS中，并在50 mL锥形管中冷却至约60°C。然后将类器官重新悬浮在琼脂糖中，琼脂糖在冰上固化。固化后，取出含有类器官的琼脂糖块并进一步固定在甲醛中，接着进行常规石蜡包埋。制备3 μm厚的石蜡切片，并将其安装在涂有聚L-赖氨酸的载玻片上（SuperFrost Plus, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, United States）。切片用苏木精和伊红（H&E）或Alcian Blue（pH 2.5）染色，随后用Periodic Acid–Schiff（PAS）染色以可视化糖原以及酸性和中性糖缀合物，包括 mucins 和糖蛋白。
对于全切片免疫荧光，将类器官在含有0.1% Triton? X-100（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, United States）和3%牛血清白蛋白（BSA）（Roche Diagnostics, Mannheim, Germany）的PBS中浸泡1小时，在室温下轻轻摇动以保持类器官的悬浮状态。然后按照先前的描述（15）将类器官与荧光素结合的抗体一起孵育。使用的抗体包括：一种大鼠抗-ZO-1（Zonula Occludens 1）Alexa Fluor 594-结合抗体（克隆R40.76, sc-33725 AF594, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, United States）和一种兔单克隆抗白蛋白Alexa Fluor 750-结合抗体（NBP3-08917AF750, Novus Biologicals, Centennial, CO, United States）。这两种抗体均以1:50的比例稀释在含有3% BSA和0.1% Triton? X-100的PBS中，在室温下轻轻摇动孵育2小时。然后使用含有0.05% Tween-20（PBS-T）的PBS洗涤类器官五次，并将其安装在Fluoroshield? mounting medium中，使用#1盖玻片作为间隔物以防止样品压缩。
宽场荧光成像使用Nikon Eclipse Ni-E显微镜（Nikon, Tokyo, Japan）进行，配备Prime BSI scientific CMOS相机（Photometrics?, Scottsdale, AZ, United States），并使用NIS-Elements Advanced Research软件（v6.20.00, Nikon）合并多通道图像。共聚焦成像使用Zeiss LSM 800共聚焦显微镜（Observer Z1, Carl Zeiss, Oberkochen, Germany）进行。为了三维可视化，以0.21 μm的间隔获取共聚焦Z-stack。图像恢复使用ZEN Blue Edition（v2.6.76.00000；Carl Zeiss）中的3D反卷积算法进行。反卷积过程利用了GPU加速和计算点扩散函数（PSF），应用了自动归一化和一阶正则化。处理基于泊松似然性，使用平均强度作为初始估计值。为了确保数据完整性和防止过度处理，算法限制每个通道最多进行7次迭代，自动停止收敛阈值为0.1%。
2.3 RNA-seq分析
转录组范围的RNA-seq分析使用了来自一只45天大的雄性Assaf羔羊的五块肝脏组织（约1 cm）样品，以及从五个不同孔中收集的羊肝类器官。样品在RNAlater?（Fisher Scientific, Waltham, MA, United States）中保存，并在?80°C下储存，然后进行RNA提取。RNA提取、文库制备和在Illumina NovaSeq X平台（2 × 150 bp，双端）上进行测序，由Seqplexing Genetest（Valencia, Spain）按照先前的描述（15）完成。映射后的质量控制表明，大多数样品的95%以上的读段成功对齐。使用HTSeq-count量化基因表达，使用DESeq2进行标准化，并根据Benjamini–Hochberg方法进行差异表达评估。数据可视化在R（版本4.4.2）中使用ggplot2（版本3.5.1）和pheatmap（版本1.0.12）等包生成热图、火山图、主成分分析（PCA）图和分散曲线。差异表达的基因根据Log2FC值1以及q值<0.1被分类为上调或下调。基因标识符被标准化为ENTREZ Gene IDs，转化成功率超过99%。功能富集分析，包括KEGG通路和基因本体类别（生物过程、细胞成分和分子功能），是使用NIH的DAVID web服务器（v2024q4）（17, 18）（DAVID功能注释生物信息学微阵列分析）进行的。

2.4 羊肝脏类器官对甲基供体补充的响应
将类器官（每个孔50–100个）培养在两个不同的24孔板中4天，然后选择最均匀的孔（每个板12个孔）进行如下实验处理：2个板（生物重复）× 4种处理 × 每个板和处理3次技术重复。然后，将实验处理[750 μL的0.02 mM DL-蛋氨酸、甜菜碱或DL-蛋氨酸+甜菜碱溶液，稀释在单层培养基（Hepaticult?）中]加入每个孔的圆顶中。24小时后，根据制造商的说明书使用GeneMATRIX Universal RNA Purification Kit（EUrx Ltd.，格但斯克，波兰）收集肝脏类器官以提取总RNA。使用QuantiFluor? RNA System和QuantusTM Fluorometer（Promega）测量RNA量，并使用Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies，加州圣克拉拉，美国）确定RNA完整性数值。根据制造商的说明书，使用Invitrogen? SuperScript? VILO? Master Mix将总RNA逆转录为cDNA。cDNA被用作定量实时PCR分析（RT-qPCR）的模板。最后，使用表1中描述的引物对评估编码脂肪酸线粒体β-氧化（例如Ovis aries肉碱棕榈酰转移酶1A，CPT1A）、线粒体葡萄糖氧化和细胞呼吸（例如丙酮酸脱氢酶（脂酰胺）α 1，PDHA1）以及细胞增殖（例如核糖体蛋白L22类似物1，RPL22L1）的基因表达。Ct值根据B2M基因（编码β-2-微球蛋白的参考管家基因）的表达进行归一化，结果表示为使用LinRegPCR程序计算出的效率校正的目标量（N0）。

表1
基因NCBI参考
正向引物
反向引物
产物大小
CPT1A
NM_001009
414.1
TGAAAAGGCAGCGTTCTTCGAAACCACCTGTCGAAACACC
127 bp
PDHA1
XM_0121
4034
4.2
TCATTGAAGGTTCGCAGCTGTTGCAAAATGACGGGATGCC
133 bp
RPL22L1
XM_0040
0316
5
TTCGTGATTGGCTTCGTGTGGCAAGCAAAGCCCTATGAAGG
132 bp
B2M
XM_0604
1869
4.1
TTCATTGTGCCTGCCTTTCCTGCAAAACACCCTGACCAAG
138 bp
用于羊肝脏类器官RT-qPCR扩增和研究表达的引物。

2.5 统计分析
使用线性混合模型（SAS PROC MIXED，SAS Institute Inc.）分析类器官的直径。将单个孔和孔随时间的交互作用视为随机效应，以解释层次结构和类器官的子采样。为了适应观察到的直径方差随时间的增加，使用了GROUP选项指定了异质方差结构。使用Satterthwaite方法估计分母自由度。通过SAS中的线性混合模型（PROC MIXED）也分析了RT-qPCR获得的每个基因的效率校正目标量（N0）值，其中处理（对照组、DL-蛋氨酸、甜菜碱或DL-蛋氨酸+甜菜碱）作为固定效应，板作为随机块。为了考虑层次结构，将板与处理的交互作用作为处理效应的误差项，而每组的三个孔作为技术重复。通过Kenward-Roger方法调整自由度。在两种模型中，使用Tukey’s HSD检验在p<0.05的显著性水平上识别均值之间的显著差异。通过应用Shapiro–Wilk检验验证模型假设。

3 结果
3.1 羊肝脏类器官的发育和表征
羊肝脏类器官在整个培养期间呈圆形（图1A），在培养的前7天内表现出快速生长，与早期时间点相比大小有显著差异（图1B），如果在第8–9天不进行传代，则开始分解。经过三次传代后，羊肝脏类器官被冷冻保存在液氮中，并在5个月后复苏，与亲本类器官没有形态差异。

图1
羊肝脏类器官随培养时间的生长。(A) 不同时间点的羊肝脏类器官的代表性明场显微镜图像。第0天是指将细胞团重新悬浮在Matrigel? Matrix Basement Membrane Phenol-Red Free（Corning?，Discovery Labware Inc.，马萨诸塞州贝德福德）中的时间点，之后进行细胞传代。图片是用Nikon Eclipse Ti2显微镜（Nikon Instruments Inc.，东京，日本）与Imaging Source DMK 33UX174相机（The Imaging Source Europe GmbH，不来梅，德国）一起拍摄的。刻度尺=100 μm。(B) 7天内羊肝脏类器官生长的图形表示（D1–D7）。每个时间点测量了15个类器官的直径（μm）。****p≤0.0001。
使用H&E染色显示类器官形成了封闭的球形上皮结构，通常由一层连续的多边形细胞组成，包围着一个中央腔室，尽管一些类器官显示部分分层。这些细胞表现出立方形到椭圆形的形态，基核呈嗜碱性，细胞质呈嗜酸性（图2A）。使用PAS与Alcian blue染色显示了细胞质内的空泡，表明有糖原积累（图2B,C）。
图2
体外培养7天后的羊肝脏类器官切片的显微镜分析。(A) H&E染色显示类器官由围绕闭合中央腔室的多边形细胞组成。细胞主要形成单层，尽管在较大的类器官中可能发生部分分层，如图下半部所示。(B) Alcian Blue与Periodic Acid Schiff’s (PAS)染色显示了几种细胞基侧的PAS阳性空泡，表明有细胞内糖原储存。(C) (B)的插图（B面板中的框选区域）突出显示了PAS阳性空泡（箭头）。(D) 用4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI，核）、Zonula Occludens 1 (ZO-1，紧密连接) 和 albumin染色的类器官的宽场荧光显微照片。合并图像显示了这三个元素的共定位；刻度尺=100 μm。图(A–D)的图像是用Nikon Eclipse Ni-E显微镜（Nikon，东京，日本）配备Prime BSI Scientific CMOS相机（Photometrics? Prime BSI?，亚利桑那州斯科茨代尔，美国）拍摄的。(E) 用DAPI染色并针对ZO-1标记的类器官的三维共聚焦重建，显示顶端向内的极性和基底定位的核；刻度尺以μm为单位。共聚焦成像是在Zeiss LSM 800（Observer Z1，Carl Zeiss，奥伯科亨，德国）上进行的。
进行免疫荧光分析以评估顶端极性、紧密连接完整性和肝脏功能（图2D）。使用DAPI染色显示核位于基底，观察到相邻细胞之间有狭窄的ZO-1阳性连接，朝向顶端一侧，并且在大多数细胞中检测到不同强度的albumin表达。最后，使用共聚焦显微镜进行类器官的三维重建，以更精确地描述结构，这证实了顶端向内的极性（图2E）。

3.2 羊肝脏类器官与肝脏组织之间的转录谱比较
为了比较羊肝脏类器官和羊肝脏组织的基因表达谱，进行了RNA-seq分析。主成分分析（图3A）为每种样本类型产生了统计上显著的簇（99%置信区间）。对肝脏类器官和肝脏组织的转录谱分析表明，在转录的15,424个基因中（补充表S1），14,344个基因在肝脏类器官和肝脏中共同表达，838个基因仅在我的组织中表达，242个基因仅在肝脏类器官中表达（图3B）。

图3
羊肝脏和肝脏类器官的转录分析。(A) 包括羊肝脏样本（L1–L5，黑点）和羊肝脏类器官（O1–O5，蓝点）的主成分分析。(B) 使用在羊肝脏组织和羊肝脏类器官中表达的基因进行的维恩图（橙色圆圈包括在肝脏组织中表达的基因数量，而蓝色圆圈包括在肝脏类器官中表达的基因数量）。在两个圆圈的交集中包含了同时在两个系统中表达的基因数量。(C) 仅在肝脏组织中检测到的838个基因转录本（左面板）和仅在羊肝脏类器官中检测到的242个基因转录本（右面板）的功能富集分析。六个最显著的KEGG（京都基因与基因组百科全书）通路用绿色条表示。(D) 在肝脏组织和肝脏类器官中共同表达的14,344个基因的功能富集分析。每个类别（KEGG通路、生物过程、细胞区和分子功能）中六个最显著的通路用彩色条表示。
这些仅在肝脏组织中表达的基因使用DAVID免费软件在六个最显著的KEGG通路中进行了分组（图3C），表明在肝脏组织中，这些通路与经典的肝脏代谢和免疫功能相关，包括视黄醇代谢、补体和凝血级联反应以及细胞因子-细胞因子受体相互作用。其他富集的通路如造血细胞谱系和细胞粘附分子进一步反映了肝脏在体内的复杂细胞组成和免疫作用。相比之下，肝脏类器官显示出与信号传导、增殖和上皮分化相关的通路富集，包括Wnt信号通路、催产素信号通路以及几个KEGG癌症相关通路，后者表明了高度增殖的细胞系统。此外，“角质化包膜形成”通路也显著富集，表明上皮分化程序存在差异。
为了确定六个最显著的代谢通路，基于KEGG结果以及同时在肝脏组织和肝脏类器官中表达的14,344个基因的生物、细胞和分子类别，使用DAVID免费软件进行了功能富集分析（图3D）。大多数共同表达的基因参与代谢通路，与泛素结合、细胞周期和蛋白质运输相关，表明两个系统之间在蛋白质质量控制和细胞稳态机制、增殖和蛋白质稳态方面有共同的保守程序。最活跃的细胞部位是细胞质和核，转移酶和水解酶非常丰富。
使用DESeq2进行了肝脏组织和肝脏类器官之间的差异表达分析。与肝脏组织相比，肝脏类器官中有3,974个基因上调，5,093个基因下调。火山图（图4A）显示过度表达和抑制基因之间的良好平衡，表明差异表达是显著的。可以使用热图（图4B）可视化两组之间差异表达最高的基因。与肝脏组织相比，肝脏类器官中上调最多的六个基因（表2）与增强的增殖、分泌和膜重塑活性相关。另一方面，几个在成熟肝脏功能中起重要作用的基因在类器官条件下显著下调（表3），包括血浆糖蛋白、补体级联反应的核心成分、参与维生素C生物合成的钙结合调节蛋白或脂肪酸转运蛋白（见讨论）。

图4
羊肝脏和羊肝脏类器官之间的差异表达。(A) 火山图显示了显著调节基因的表达谱。水平轴表示表达差异，表示为计算的倍数变化的Log2值。垂直轴表示证据水平，表示为?log(Padj)，显著调节的基因出现在图的顶部。灰色点表示既没有统计显著性也没有表达差异的基因。蓝色点表示表达变化没有统计学意义的基因。绿色点表示表达变化没有统计学意义的基因。红色点突出显示了既具有统计显著性又在类器官中差异表达的基因（左侧为下调基因，右侧为上调基因）。(B) 热图显示了羊肝脏类器官（O1–O5）和羊肝脏组织（L1–L5）之间差异表达最高的基因。应用的过滤器是：Log2FC1，以及q值<0.1。颜色刻度表示基因表达水平，从低（蓝色）到高（红色）。树状图反映了基于样本相似性的层次聚类。

表2
基因产品描述
a
Log2FC
bp值
S100
A1
4
S100
钙结合蛋白A
14
预测具有钙离子结合活性；钙依赖的蛋白质结合活性；以及趋化因子受体结合活性。预测参与白细胞趋化性的正向调节；对脂多糖的反应；以及Toll样受体4信号通路
5.20.0
SLC26
A2
溶质载体家族26成员2。它具有溶质：无机阴离子反转运蛋白活性和硫酸盐跨膜转运蛋白活性。参与软骨细胞分化；软骨细胞增殖；以及硫酸盐跨膜运输
6.1
1.3 × 10?219
SPINT2
丝氨酸肽酶抑制剂，Kunitz类型2。预测具有丝氨酸型内肽酶抑制剂活性。它在基底膜组织的上游或内部起作用；参与脊索动物胚胎发育；以及细胞极性的建立或维持
6.5
4.2 × 10?20
7
ANXA1
3
Annexin A13
预测具有钙离子结合活性和磷脂结合活性
5.7
2.3 × 10?19
AGR2
前梯度2，蛋白质二硫键异构酶家族成员。预测具有硫酸糖胺聚糖结合活性；表皮生长因子受体结合活性；以及蛋白质同二聚化活性。参与消化道形态发生；粘液分泌；以及发育生长的正向调节在炎症反应和肺杯状细胞分化过程中起上游作用或参与其中
6.91 × 10^-19
1PLP2
蛋白脂质蛋白2，预测能增强趋化因子结合活性
4.11 × 10^-17

与肝脏组织相比，绵羊肝类器官中表达最丰富的前六基因（按p值排名）：
a. 信息来自美国国家医学图书馆（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/gene/）
b. Log2FC = 计算出的倍数变化的自然对数

表3
基因产物
描述
a. Log2FC
bp值
AMBP
α1-微球蛋白/双库宁前体。该基因编码一种融合蛋白，经过蛋白水解处理后生成两种成熟蛋白质：α1-微球蛋白（A1m）是一种属于脂质钙调素超家族的血浆糖蛋白，可结合疏水分子；双库宁属于库尼茨型蛋白酶抑制剂超家族
?7.50
0
C5
补体C5
?6.10
0
ITIH1
α-间肽酶抑制剂重链1。该基因编码α-间肽酶抑制剂（IaI）家族的血浆丝氨酸蛋白酶抑制剂的重链
?7.40
0
LOC101110449
UDP-葡萄糖醛酰转移酶3A1类似物
?5.40
RGN
调节钙调素。它具有葡萄糖内酯酶活性，参与L-抗坏血酸的生物合成过程
?7.70
SLC27A5
溶质转运蛋白家族27的成员5。它具有胆汁酸-CoA连接酶活性和脂肪酸跨膜转运活性，在多种过程中起上游作用，包括酮体生物合成过程、长链脂肪酸跨质膜运输以及甘油三酯的动员
?5.22
5 × 10^-3

与肝脏组织相比，绵羊肝类器官中表达最减弱的前六基因（按p值排名）：
a. 信息来自美国国家医学图书馆（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/datasets/gene/）
b. Log2FC = 计算出的倍数变化的自然对数

通过对肝类器官中上调的3,974个基因和下调的5,093个基因进行功能富集分析，使用DAVID服务器详细研究了基因表达谱的差异。基于KEGG结果以及基因本体分类（生物过程、细胞成分和分子功能），展示了上调和下调基因的主要代谢途径（最多六个）（图5）。总体而言，类器官中上调的基因主要与细胞增殖、蛋白质转运和结构组织相关；而下调的基因则主要参与代谢过程、脂质和类固醇代谢、药物代谢、细胞外基质组织以及免疫相关功能。

图5
绵羊肝类器官与绵羊肝脏组织中差异表达基因的功能富集分析。左侧面板显示了肝类器官中上调的3,974个基因的分析，右侧面板显示了下调的5,093个基因的分析。每个类别（KEGG途径、生物过程、细胞区和分子功能）中表达最显著的六条途径以彩色条形表示。

3.3 绵羊肝类器官对甲基供体添加的反应
为了验证3D体外模型研究反刍动物肝脏代谢的功能，使用绵羊肝类器官在体外评估了DL-蛋氨酸、甜菜碱及其组合对肝脏代谢和细胞增殖相关关键基因表达的潜在影响。根据图6的结果，当同时供应DL-蛋氨酸和甜菜碱时，CPT1A（以肝脏为主的肉碱棕榈酰转移酶异构体1A，代表脂肪酸的线粒体β-氧化）和RPL22L1（类似核糖体蛋白L22的1，代表细胞增殖）基因的表达显著增加（p < 0.05）；而单独给予这两种化合物时，对这些基因的表达没有明显影响。PDHA1基因（丙酮酸脱氢酶（脂酰胺）α1，代表线粒体有氧代谢）的表达在任何处理情况下均无显著差异。

图6
通过RT-qPCR观察到的CPT1A、PDH1A和RPL22L1基因的表达。添加蛋氨酸（Met）、甜菜碱（Bet）或两者同时添加（Met + Bet）后的数据以校正效率后的目标数量（N0）值表示。条形上方不同的字母表示处理之间的显著差异（p < 0.05）。

4 讨论
绵羊3D系统的开发对于研究与动物生产和健康相关的生理和病理过程至关重要，因为它们更准确地再现了体内观察到的组织结构、功能性和细胞相互作用。与传统2D模型相比，3D系统能够更好地研究营养吸收机制、免疫反应、宿主-病原体相互作用以及药物或生物活性化合物的效果，同时减少了对动物模型的依赖（15, 19–22）。在此背景下，上一代绵羊十二指肠类器官及其在高通量筛选平台中的应用（23）证明了绵羊3D模型作为兽医和转化研究强大工具的可行性和潜力，为将其应用于其他组织和感兴趣的生物过程铺平了道路。在此背景下，我们已将绵羊肝类器官用于代谢研究。这一发展也应纳入牲畜类器官技术的更广泛扩展中（13）。近年来，已成功建立了来自肠道和上皮组织的牛和猪类器官系统，证明了它们能够再现体内生理的关键方面，包括营养运输、上皮屏障功能和宿主-病原体相互作用（24）。在牛中，肠道类器官被广泛用于研究消化生理和肠道感染，同时保留了组织特异性基因表达模式和功能反应（25, 26）。同样，猪类器官由于其与其他单胃动物和农业物种的生理相似性，已成为研究宿主-微生物相互作用、营养发育和基因编辑的强大模型（27）。这些进展凸显了牲畜来源的类器官作为具有生理意义的体外系统的日益重要性。在此背景下，绵羊肝类器官的开发将这些研究扩展到了反刍动物生理中的代谢核心器官，为研究肝脏特异性过程提供了互补的平台。

本研究中开发的3D结构来源于公羔的肝脏，表现出球形形态、早期渐进性生长以及长期储存后的完整性，这与之前关于其他动物肝类器官的报道一致（15, 28）。H&E染色显示，类器官形成了囊状上皮结构，大部分细胞显示出与肝细胞一致的形态特征。此外，在这些细胞的管腔面检测到了ZO-1（一种位于顶界的紧密连接蛋白），反映了与体内胆小管组织类似的顶极定向（29）。细胞质中的白蛋白积累以及含有糖原的液泡进一步支持这些细胞与肝细胞的代谢相似性（30, 31）。然而，并非所有细胞都含有这些结构，其水平在个体细胞间存在差异，反映了天然肝组织的功能异质性。这种变异性与成熟肝细胞样细胞、肝前体细胞以及其他可能的肝细胞的混合群体相一致。一些类器官中观察到的部分分层可能反映了活跃的增殖或分化异质性，以及类器官细胞中某些标志物的表达。制造商报告称，在HepatiCult?小鼠类器官生长培养基中培养的类器官形成了表达与肝干细胞和前体细胞（AXIN2、SOX9和CD44）、胆管细胞（KRT19和HNF1b）和肝细胞（HNF4a和AFP）相关标志物的上皮区室。这些标志物的表达，加上其他肝内胆管特征基因（如CFTR）（补充表S1）的支持，表明所开发的类器官中存在异质性细胞群体。这种细胞多样性类似于体内的肝微环境，并与之前关于来自成人组织的器官型培养物的报道一致（15, 33, 34）。当前研究的一个局限性是肝类器官来源于单一动物。尽管结果证明了该系统在测试条件下的可行性和可重复性，但无法评估不同动物之间的生物学差异。未来的研究将包括来自不同年龄或生理状态的多个个体的类器官，以评估动物间的差异性并增强模型的稳健性和普遍性。

转录组分析突出了协调细胞周期进展与蛋白质周转和转运的保守机制，支持肝类器官作为模型系统的生理相关性。然而，肝脏组织和肝类器官的转录谱比较显示，体外3D系统仅部分再现了成熟肝脏的代谢和信号通路，保留了与更不成熟或活跃重塑的细胞状态一致的转录程序。这种现象在肝类器官中很常见，其转录特征类似于胎儿或新生肝细胞（35）。在本研究中，培养条件主要是为了类器官的扩增和维持，而不是为了诱导完全的肝细胞成熟。这可能解释了观察到的转录谱，反映了与成熟肝脏组织相比的增殖和发育不成熟状态。因此，未来的工作应侧重于优化培养条件，以促进肝细胞成熟，包括调节或撤回增殖信号、加入分化诱导因子，或使用与非实质肝细胞共培养的系统。这些方法可能提高模型的生理相关性，并增强其再现成熟肝脏代谢功能的能力。

对肝类器官与肝脏组织相比上调和下调最多的六个基因的分析提供了关于该绵羊3D系统生理特征的关键见解。S100A14、SLC26A2、SPINT2、ANXA13、AGR2和PLP2在肝类器官中的协调过表达反映了类器官的发育、增殖和重塑状态，而不是分化肝组织的表型。S100基因在肿瘤发生中起重要作用，通过调节细胞增殖、侵袭、转移、细胞存活或细胞死亡（36）。具体来说，S100A14编码一种钙结合蛋白，通过RAGE-ERK/NF-κB等信号通路调节细胞增殖和存活（37），这与类器官中增强的增殖程序一致。SLC26A2在肝类器官中的表达增加可能与类器官细胞的未成熟和增殖状态有关，而不是肝脏特异性功能。SLC26A2编码一种硫酸盐转运蛋白，对于细胞内硫酸盐供应和随后的蛋白聚糖硫酸化至关重要，这是发育和组织重塑过程中的细胞外基质生物合成和生长因子信号传导所必需的。尽管传统上与软骨疾病相关，但SLC26A2在多种非软骨组织中也表达，支持其在多种细胞类型中调节硫酸盐稳态的更广泛作用（38）。其在类器官中的上调与发育样或再生系统的增强的生物合成和基质相关需求一致。SPINT2编码Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂HAI-2，调节细胞周围的蛋白水解和上皮完整性，并抑制肝细胞生长因子激活因子，从而在组织重塑过程中调节增殖并保护上皮完整性（39, 40），从而可能保护类器官的结构和完整性。ANXA13是 annexin家族的成员，以钙依赖方式结合磷脂，与增殖上皮细胞的膜动态和生长调节有关（41），因此在类器官增殖和分化中起作用。AGR2编码一种内质网驻留的蛋白质二硫化物异构酶，有助于蛋白质折叠和分泌，支持发育和再生过程中的高生物合成需求（42）。最后，PLP2编码内质网（ER）的膜整合蛋白。敲低研究表明，PLP2减少会增加ER应激和凋亡（43），而其过表达则与增殖增强和细胞迁移调节相关（44, 45）。因此，PLP2在类器官中的上调可能反映了这些不成熟组织样的结构中的高生物合成活性、ER应激管理和增殖需求。

另一方面，与成熟肝脏相比，AMBP、C5、ITIH1、RGN和SLC27A5在肝类器官中的一致下调表明，这些结构尚未完全激活与成熟肝细胞表型和系统肝脏功能相关的转录程序。AMBP编码α1-微球蛋白和双库宁的前体，在肝脏中高度表达，并受肝细胞核因子的调控，反映了其在体内的分泌活性和抗氧化保护作用（46）。C5编码一种参与先天免疫和系统炎症反应的中心补体成分（47, 48），其在缺乏系统免疫相互作用的组织有限模型中的下调是预期的。ITIH1属于α-间肽酶抑制剂家族，有助于维持细胞外基质稳定性和循环蛋白酶抑制，主要在肝脏中表达，其抑制与成熟的肝细胞分泌能力降低一致（49）。RGN（regucalcin）是一种具有钙结合能力的调节蛋白，主要在肝脏中表达，参与细胞内钙信号传导和稳态调节。它在完全分化的肝细胞中的功能比在增殖性的前体细胞中更为明显（50），并且还参与维生素C的生物合成（51）。此外，SLC27A5基因编码一种特异性存在于肝脏中的胆汁酸和长链脂肪酸转运酶（FATP5），在脂质代谢和胆汁酸结合中发挥作用（52, 53）；其表达下调与类器官相对于成体肝脏组织较低的代谢和脂质处理能力相一致。总的来说，这些特征表明类器官优先表达与发育和增殖状态相关的基因，而定义成熟肝脏代谢、免疫相关分泌和全身稳态的基因则受到抑制，从而支持将类器官视为发育不成熟、具有增强基质重塑和细胞稳态程序的增殖结构的观点。这一结论通过功能富集分析得到了证实，该分析揭示了肝类器官与天然肝脏组织之间存在显著的转录组差异。参与细胞周期、有丝分裂和蛋白质转运的基因上调表明类器官具有较高的增殖和生物合成活性。与细胞连接和细胞骨架相关的术语富集反映了类器官的结构完整性和动态细胞组织特性（54, 55）。值得注意的是，“冠状病毒疾病 - COVID-19”KEGG通路的富集并不表明类器官中存在病毒感染。该类别中上调的基因大部分（约80%）编码核糖体蛋白，其余基因参与细胞内信号通路（MAPK、NF-κB、PI3K），这些都是增殖细胞中高度活跃的基本细胞过程（56–58）。因此，将这些基因映射到COVID-19通路反映了它们与病毒所利用的途径的功能重叠，而非SARS-CoV-2在系统中的存在。相反，与经典肝脏代谢通路（包括脂质代谢、类固醇生物合成和细胞色素P450介导的药物代谢）相关的基因下调可能表明类器官的功能成熟度不如成体肝脏组织。与细胞外基质和分泌成分相关的基因表达降低可能反映了组织结构的差异以及体外缺乏复杂的细胞-基质相互作用。此外，由于本研究中的绵羊肝类器官缺乏肝脏中存在的驻留免疫细胞，因此预期与先天免疫反应和补体级联反应相关的基因表达也会降低。目前大多数肝类器官系统缺乏免疫细胞（如组织驻留的巨噬细胞），这限制了它们在体内复制肝脏复杂免疫功能的能力（61）。总体而言，这些发现强调了肝类器官作为研究细胞增殖和基础肝脏生物学的模型的潜力，同时也指出了进一步优化以改善功能成熟度并更好地模拟成体肝脏生理学的必要性。

为了验证这种3D模型在肝脏代谢检测中的适用性，我们评估了methionine和betaine补充对两种参与一般代谢通路的基因（CPT1A和PDHA1）以及一种与细胞增殖相关的基因（RPL22L1）表达的影响。Methionine是一种含硫的必需氨基酸，也是反刍动物饮食中最缺乏的氨基酸之一，它在蛋白质合成中的作用至关重要，同时作为重要的甲基供体可以转化为S-腺苷甲硫氨酸和同型半胱氨酸（62）。适当的methionine或S-腺苷甲硫氨酸补充已被证明具有广泛的健康促进作用，特别是可以改善肝脂肪变性（63, 64）。然而，高水平的同型半胱氨酸会增加氧化应激和炎症，尤其是在肝脏中（65, 66）。因此，最近的研究表明限制methionine的摄入也可能对缓解肝脂肪变性和实现其他健康益处有益（67–69）。因此，寻找优化methionine作为饲料添加剂的策略是很有必要的。在这方面，betaine作为胆碱衍生物非常重要，因为它可以将甲基捐赠给同型半胱氨酸以形成methionine（70）。因此，在动物饮食中同时添加methionine和betaine可能会产生两种化合物之间的协同作用，从而在不受高同型半胱氨酸水平影响的情况下发挥methionine补充的积极作用。根据本研究的结果，向绵羊肝类器官中添加DL-methionine或betaine并未导致所测三种基因的表达出现显著差异。先前的体外研究表明，在牛肝细胞中补充不同浓度的DL-methionine后24小时内CPT1A的表达没有受到影响（71），从而证实了我们的methionine结果。有趣的是，在产蛋鸡的饲料中添加betaine可以激活肝脏中的CPT1A基因表达，从而促进脂肪酸β-氧化（72）。在我们的3D体外模型中，DL-methionine和betaine的共同作用促进了编码CPT1A的基因表达，CPT1A是肝脏中主要的肉碱棕榈酰转移酶1 isoform，这是一种控制长链脂肪酸线粒体β-氧化关键步骤的酶（73），其表达增加可能表明随着甲基供体的增加或betaine促进的同型半胱氨酸回收，脂肪酸氧化得到了增强。同样的机制也可能解释RPL22L1基因（编码与L22同源的核糖体蛋白）的显著上调。该基因已被证明通过调节信号通路参与细胞增殖和肿瘤进展（74），因此其上调表明蛋白质合成和细胞生长增强，这与methionine和betaine在one-carbon代谢和甲基化反应中的作用一致（75）。这些结果表明，当DL-methionine和betaine一起提供时，可能促进脂肪酸的线粒体β-氧化和细胞增殖，尽管这一点尚需通过功能性验证。实际上，这是本研究的一个关键局限性，因为代谢活性是基于基因表达数据推断的，而不是通过直接的功能检测得出的。因此，未来的研究应结合功能性方法，如测量线粒体呼吸、β-氧化速率或代谢产物分析，以验证绵羊肝类器官的代谢能力。

总之，绵羊肝类器官是一个有前景且生理相关的3D模型，能够捕捉肝脏的关键结构和转录特征，同时保留与成体肝脏组织相比的增殖和发育不成熟的表型。尽管需要进一步优化以改善功能成熟度并完全模拟代谢活动，但该模型为体外探索细胞过程和代谢调节提供了有价值的平台，从而突出了绵羊3D肝脏模型在反刍动物中研究营养-基因相互作用方面的实用性，为后续的体内实验奠定了基础。