豆蔻精油对变形链球菌（Streptococcus mutans）的体外抑制作用

《Frontiers in Oral Health》：In vitro inhibition of Streptococcus mutans by cardamom essential oil

　　摘要
龋齿是一种与生物膜相关的疾病，由于难以获得昂贵治疗手段，它对低收入人群的影响尤为严重。天然产品为预防龋齿提供了一种有前景且经济可行的替代方案。本研究调查了小豆蔻精油（CEO）的抗菌和抗生物膜活性，其中含有1,8-桉叶油醇、芳樟醇和蒈烯等生物活性化合物，这些成分对主要的致龋细菌——变异链球菌（Streptococcus mutans）具有抑制作用。抗菌活性通过琼脂孔扩散实验、肉汤微量稀释实验、生物膜检测（结晶紫法）和细胞活力检测（MTT法）进行了评估。利用定量PCR技术分析了CEO对六种毒力相关基因（gtfB、gtefC、gtefD、ldh、gbpB和vicR）的影响。结果显示，CEO的最低抑菌浓度为2.5%（体积比），最低杀菌浓度为5.0%（体积比）。在5.0%浓度下，生物膜形成和细胞活力下降了75%以上，而毒力基因表达则上调，表明细菌处于应激状态。在十二种测试的精油中，CEO对变异链球菌的生长和生物膜形成的抑制效果最明显。这些发现证明了CEO在体外对变异链球菌的抑制潜力，并强调了其作为天然、易获得化合物在未来开发高效口腔护理产品中的潜力。进一步的多微生物和体内模型验证将有助于确认并扩展这些发现，以探索其潜在的防龋应用。

1 引言
龋齿是一种表现为牙齿孔洞的疾病（1, 2）。治疗成本不仅对个人造成负担，也对整个医疗系统构成压力（3, 4）。发展中国家的人们或低社会经济地位的人群由于缺乏预防措施而更容易受到影响（1, 2）。龋齿是由多种细菌与牙齿相互作用引起的。变异链球菌在其中起关键作用（3, 5–10）。该细菌具备在有无蔗糖条件下吸附的能力，蔗糖的存在会促进其吸附，并使其能够形成稳定的生物膜，从而为其他致龋细菌提供栖息地（7, 8, 11, 12）。这种生物膜由细胞外聚合物物质（EPS）构成，主要由葡萄糖转移酶（gtfB、gtefC和gtefD编码）从蔗糖中合成（13）。这些葡萄糖聚合物增强了生物膜的结构稳定性，保护细菌免受环境压力，并维持低氧或无氧环境（14）。在这种条件下，变异链球菌通过糖酵解代谢碳水化合物生成丙酮酸，进而发酵产生乳酸、醋酸和甲酸等酸类物质（2, 6, 11, 12）。生物膜的形成和酸的产生与变异链球菌中多种毒力基因的表达密切相关，包括gtfB、gtefC和gtefD（编码负责可溶性和不可溶性葡萄糖聚合物的转移酶）、ldh（编码乳酸脱氢酶，产生乳酸）、gbpB（编码参与生物膜完整的葡萄糖结合蛋白B）以及vicR（毒力基因表达调节因子）（5）。已建立的龋齿预防方法包括利用唾液中的矿物质或牙膏中的氟化物进行自然再矿化（3, 6, 12）。去除牙齿表面生物膜和防止酸产生的最常用方法是刷牙，但如果细菌负荷过高，通常需要使用氯己定等抗菌剂（3, 6, 16）。然而，这些抗菌剂存在诸多副作用，使得许多患者不愿使用（16–19）。由于天然化合物如植物提取物和精油具有较低的毒性和易于获取的特点，它们正逐渐成为对抗变异链球菌的替代抗菌剂（20, 21）。不过，这些化合物的效果可能因化学成分的差异、稳定性问题和生物利用度不同而有所变化（22）。此外，许多天然化合物对生物膜内的细菌疗效有限，这限制了其在口腔感染管理中的应用（13）。因此，需要研究更一致和有效的天然抗菌剂。在这方面，小豆蔻精油（CEO）是一个有潜力的候选者。

小豆蔻，学名Elettaria cardamomum L. Matón var. cardamomum，属于姜科植物，原产于印度、斯里兰卡、危地马拉和坦桑尼亚（23–25）。这种植物结含有油脂的种子（26）。这些种子既用于烹饪，也用于传统医学，治疗腹痛、咽喉痛和口腔疾病（23–25, 27）。人们常咀嚼小豆蔻荚以释放精油（EO），从而刺激唾液分泌并提高口腔pH值（23, 28）。这些效果源于EO中的生物活性成分，包括1,8-桉叶油醇、α-萜品醇、芳樟醇、芳樟酰乙酸、D-柠檬烯和蒈烯（补充图S1）（24, 27）。然而，目前尚不清楚小豆蔻精油（CEO）在其他精油中是否具有最强的防龋效果。

本研究初步筛选了12种来自不同食物的精油对变异链球菌的抗菌作用。基于研究结果，小豆蔻精油（CEO）因其含有具有抗菌特性的生物活性化合物而备受关注。但与丁香、肉桂和茶树精油等研究较为深入的精油相比，CEO得到的科学关注较少，其对变异链球菌生长、生物膜形成和毒力基因表达的影响仍缺乏深入研究。因此，选择CEO进行进一步分析，旨在全面评估其在体外对变异链球菌的抑制作用。具体而言，本研究考察了其对细菌生长、生物膜形成以及六种毒力相关基因（gtfB、gtefC、gtefD、ldh、gbpB和vicR）表达的影响。本研究的研究假设（H0）是小豆蔻精油对变异链球菌的生长和毒力基因表达没有显著影响，且与其他测试的精油无显著差异。然而，考虑到其主要成分的已知抗菌特性，推测CEO可能能够抑制变异链球菌的生长并调节其毒力基因表达，从而具有作为天然防龋剂的潜力。

2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 样品
十二种精油，包括小豆蔻（Elettaria cardamomum）、生姜（Zingiber officinale）、柠檬（Citrus limon）、柠檬香型桉树（Eucalyptus citriodora）、柑橘（Citrus reticulata）、肉豆蔻（Myristica fragrans）、薄荷（Mentha piperita）、蓝桉（Eucalyptus globulus）、留兰香（Mentha spicata）、八角（Illicium verum）、茶树（Melaleuca alternifolia）和野薄荷（Mentha arvensis），均购自Symrise AG（德国Holzminden）。
2.1.2 化学试剂
使用PURELAB flex 3（Veolia Water Technologies，德国Celle）制备纯净水。二甲基硫氧化物（≥99.8%，p.a.）、硫氰化胍（≥99%）和氯化钠购自Carl Roth（德国Karlsruhe）。硫氰化铵购自Honeywell International Inc.（美国New Jersey州Morristown），无核酸酶的水购自Life Technologies Corp.（美国Texas州Austin）。酚（水饱和并稳定处理）和TAE缓冲液50X购自ITW Reagents（西班牙巴塞罗那）。分析用无水乙酸钠、脑心浸出液、结晶紫和甲基噻唑偶氮四唑溴盐由Merck（德国Darmstadt）提供。氯仿分子生物学试剂由MP Biomedicals, INC.（德国Eschwege）提供，甘油（≥97%）由VWR（德国Darmstadt）提供。乙醇（99%，含1%甲基乙基）、酮类和异丙醇购自WALTER CMP（德国Kiel）。M-MLV逆转录酶和M-MLV RT 5X缓冲液购自Promega（德国Waldorf）。DNase I（无核酸酶）、1 U/μL、含MgCl2的10X反应缓冲液、dNTP套装100 mM溶液、PowerTrack SYBR green mastermix和SYBR Safe DNA凝胶染料由Thermo Fisher Scientific（德国Schwerte）提供。
2.1.3 微生物
使用变异链球菌ATCC 25175（DSMZ，德国）作为测试菌株。初步实验表明，变异链球菌在标准培养箱条件下无需额外供给二氧化碳也能良好生长。因此，所有培养均在37°C的标准培养箱中进行。琼脂实验使用常用于变异链球菌培养的胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）。生物膜和基因表达分析选用添加蔗糖的脑心浸出液（BHI），因为它能促进细菌生长，模拟富含糖的口腔环境，并便于与先前研究结果比较。
2.1.4 变异链球菌的连续稀释
选取十二个试管，其中一个装有2.85–3.45毫米的玻璃珠，用Kapsenberg盖子封闭后通过Systec公司的VX-65高压灭菌器进行灭菌。将10毫升培养基加入装有玻璃珠的试管中，再将相同体积的培养基加入其余试管。使用灭菌的接种环取第二代变异链球菌菌落，搅拌后离心3分钟。调整该试管中细菌悬液在600纳米处的光密度（OD）至0.25–0.3之间，确保菌细胞数量约为1.0×10^8 CFU/mL。通过初步实验确定OD与CFU的关系。从样本中取1毫升转移至含9毫升培养基的试管中，重复此操作直至稀释度达到10^-6。将10^-6和10^-5稀释度各100微升分别滴加至两个TSB琼脂平板上，用Drigalski细胞涂布器均匀分布。干燥30分钟后，将平板倒置放在37°C下培养2天。
2.2 方法
2.2.1 基于琼脂孔扩散法评估抗菌活性
使用12种精油进行初步筛选。根据结果，小豆蔻精油（CEO）因其抗菌活性相关的生物活性化合物而受到特别关注。然而，与丁香、肉桂和茶树精油等研究较多的精油相比，CEO受到的科学关注较少，其对变异链球菌生长、生物膜形成和毒力基因表达的影响尚未得到充分研究。因此选择CEO进行进一步分析。具体研究内容包括：
2.2.1.1 琼脂孔扩散法
TSB琼脂平板（含15克/升酪蛋白胨、5克/升大豆胨、5克/升NaCl、15克/升琼脂）每孔加入100微升10^-2稀释度的样本，使用Drigalski细胞涂布器涂布。平板干燥10分钟后，用火焰消毒的镊子夹取无菌1,000微升移液器头，将其宽开口（直径0.9厘米）压入琼脂孔三次，用无菌移液器和镊子清空孔洞后加入80微升样本。将精油在≥99.8%二甲基硫氧化物中稀释20倍和40倍，得到5.00%（体积比）和2.50%（体积比）的浓度。包括含有80微升DMSO的溶剂对照组和含有80微升1毫克/毫升青霉素的阳性对照组。使用Ahlstrom Germany（德国Baerenstein）的通用指示纸检测样本的pH值。平板用封膜纸封好，置于生物安全柜中10分钟。37°C下培养48小时后，用尺子测量无细菌生长的抑菌圈直径。每个实验重复三次。
2.2.2.2 肉汤微量稀释法测定最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）
在96孔板中制备稀释系列：第二列第二个孔中加入50微升胰蛋白酶大豆肉汤（TSB：17克/升酪蛋白胨、3克/升大豆胨、5克/升NaCl、2.5克/升磷酸二钾、2.5克/升葡萄糖）、38微升纯净水、2微升二甲基硫氧化物和10微升小豆蔻精油。其余孔中加入50微升混合液（含50%（体积比）TSB、48%（体积比）纯净水和2%（体积比）二甲基硫氧化物）。上下搅拌后，将第二列初始孔中的50微升溶液转移到相邻孔中，继续稀释至完整系列。每次稀释后丢弃移液器头。弃去最后稀释度的50微升溶液。将10^-6和10^-5稀释度的100微升样本分别加入所有已填满的孔中。最终CEO的浓度范围为5.00%（体积比）至0.01%（体积比）。在作为中等对照的情况下，向一个孔（"MC"）中加入了100 μL TSB；作为载体对照，将50 μL混合液和50 μL TSB结合在另一个孔中（"VC-"）。另一个载体对照由50 μL混合液和50 μL细菌悬液组成（"VC+"）。一种由25 μL TSB、25 μL纯净水和50 μL细菌悬液组成的混合物作为未受干扰生长的阴性对照（"NC"）。此外，还包括了不同稀释度青霉素的对照。为此，在孔中混合了25 μL TSB、19 μL纯净水、1 μL二甲基亚砜和5 μL溶于纯净水中的青霉素，然后加入10^-2稀释度的50 μL细菌悬液。使用的青霉素稀释浓度分别为1 μg/mL、10 μg/mL和100 μg/mL，最终在100 μL总体积中的浓度分别为0.05 μg/mL、0.5 μg/mL和5 μg/mL。A行和H行的孔以及第1列和第12列的孔中加入了纯净水，随后将盖子盖在微孔板上，并用胶带密封盖子的边缘。之后，将微孔板放入Tecan Infinite F200微孔板读数仪（Tecan Group AG，瑞士M?nnedorf）中。将微孔板读数仪设置为37°C，并在接下来的24小时内记录细菌生长情况。动力学周期包括48个周期，每个周期间时间为30分钟。在测量620 nm处的光密度之前，微孔板以3 mm的振幅线性摇晃15秒。24小时后，通过寻找不会导致光密度增加的最小卡达蒙精油浓度来确定最小抑菌浓度（MIC）。接着，将所有样品的60 μL转移到直径为60 mm的培养皿中，并覆盖上温暖的液体TSB琼脂。通过水平移动培养皿使液体混合后，让琼脂在细菌安全柜中干燥，然后在37°C下培养48小时。通过寻找导致99.9%细菌死亡的最小卡达蒙精油浓度来确定最低杀菌浓度（MBC）。这些肉汤微稀释试验每个生物重复三次，每个重复三次。

2.2.3 晶体紫试验用于评估生物膜形成
96孔微孔板按照与肉汤微稀释方法相同的步骤填充对照。但是，使用了脑心浸出液[BHI，27.5 g/L营养基质，2 g/L D-(+)-葡萄糖，5 g/L NaCl，2.5 g/L磷酸二氢钠]肉汤和0.2%（w/v）蔗糖来促进生物膜形成。对于系列稀释，使用了一种混合液，该混合液由50%（v/v）BHI、0.2%（w/v）蔗糖、48%（v/v）纯净水和2%（v/v）二甲基亚砜组成。微孔板用Bio-Rad Laboratories（德国Feldkirchen）提供的微密封胶带密封，并在37°C下培养24小时，期间不进行摇晃。小心地用移液器去除培养基，避免接触孔底，然后向孔中轻轻加入250 μL PBS（0.14 M NaCl，0.0027 M KCl，0.01 M PO43?+H3O+），再移除。这个清洗步骤重复两次。将96孔板翻转到纸巾上，在37°C下无盖放置10分钟使其干燥。然后，向孔中加入150 μL溶于纯净水中的0.1%（w/v）晶体紫，微孔板在室温下培养15分钟。通过移液器去除染料后，按照上述方法用250 μL PBS清洗所有孔五次，然后在37°C下无盖放置10分钟使其干燥。之后，向所有孔中加入150 μL溶于纯净水中的95%（v/v）乙醇，将微孔板放入Biosan（拉脱维亚Riga）的 orbital shaker incubator 中，以250 rpm培养10分钟。将96孔微孔板放入Tecan Infinite M200微孔板读数仪（Tecan Group AG，瑞士M?nnedorf）中。在测量之前，将微孔板以3 mm的振幅线性摇晃15秒。在550 nm处测量光密度。为了标准化数据，从所有吸光度值中减去培养基对照的平均光密度值。通过使用以下公式1计算抑制率来可视化生物膜形成的减少：
抑制率 = (1 - 样品吸光度) × 100%
抑制率 = (1 - 样品吸光度) × 100%

晶体紫试验每个生物重复三次，每个重复三次。

2.2.4 甲基噻唑吡啶四唑溴化物（MTT）试验用于评估细胞活力
96孔微孔板的填充方式与晶体紫试验相同，对照组也相同，但卡达蒙精油的样品比例减少到5.00%、2.50%、1.25%、0.63%和0.31%。之后，用Bio-Rad Laboratories（德国Feldkirchen）提供的微密封胶带密封微孔板，并在37°C下培养24小时，期间不进行摇晃。然后，向96孔微孔板的孔中加入10 μL Merck（德国Darmstadt）提供的MTT标记试剂，该试剂由5 mg/mL MTT溶于PBS组成。通过上下移动移液器将MTT与孔中的培养基混合大约三次。然后，用微密封胶带和盖子封闭微孔板，并将其包裹在铝箔中。之后，在37°C下培养4小时，然后加入100 μL二甲基亚砜。将微孔板放入Biosan（拉脱维亚Riga）的 orbital shaker incubator 中，以37°C和250 rpm培养15分钟，然后放入Tecan Infinite M200微孔板读数仪中，以3 mm的振幅线性摇晃15秒，随后分别在600 nm和700 nm处测量OD600和OD700的光密度。OD700值作为参考波长，从其值中减去OD600值后，从所有先前计算的吸光度值中减去培养基对照的平均值（OD600—OD700）以进行标准化。细胞活性的抑制率按照公式2计算：
标准化OD600 = (OD600 - OD700) / (OD600 - OD700) - (OD600 - OD700) / 培养基对照平均值

每个实验每个生物重复三次，每个重复三次。

2.2.5 通过定量动力学PCR（qPCR）确定毒力基因表达
S. mutans细胞在含有0.2%（w/v）蔗糖的BHI培养基中生长以促进生物膜形成。使用公式3将细菌悬液稀释至最终光密度为0.35：
Xml = (0.35 × 10^m) × LODMeasured
其中XML表示达到总体积10 mL光密度0.35所需的细菌悬液体积。因此，10 mL - XML即为稀释所需的含有0.2%（w/v）蔗糖的BHI体积，将其加入到三个高压灭菌的试管中。向每个试管中加入计算出的细菌悬液量后，每个试管涡旋一分钟。将细菌悬液分配到24个微管中，并分别准备青霉素和卡达蒙精油的处理。在37°C和250 rpm下培养24小时后，收集细胞，并按照Rio等人的协议提取RNA（略有修改）：初次离心在12,000 × g和4°C下进行15分钟。最终RNA沉淀物用1 mL 70%（v/v）乙醇溶于纯净水在1,400 rpm下清洗10分钟，然后以7,500 × g和4°C离心5分钟。去除上清液后，沉淀物在室温下风干5分钟，再悬浮在25 μL无核酸酶水中。使用NanoDrop? OneC分光光度计（Thermo Fisher Scientific，德国Schwerte）测量RNA浓度，然后储存在-80°C。

反向转录为互补DNA（cDNA）并进行动态定量聚合酶链反应（qPCR），按照Hornbacher等人的方法进行，略有修改。使用随机非amer引物进行cDNA合成。qPCR在10 μL反应混合物中进行，该混合物包含5 μL PowerTrackTM SYBR green mastermix（Thermo Fisher Scientific GmbH，德国Schwerte）、每种引物0.4 μL（Eurofins Genomics，德国Ebersberg）和2 μL cDNA模板及无核酸酶水。分析了七个目标基因，引物列在表1中。还包括了用无核酸酶水代替cDNA模板的阴性对照。为了量化cDNA，通过将每个孔中的三个重复样品混合并在其中加入4倍稀释液来制备标准曲线（最终浓度见补充表S1）。qPCR在QuantStudio?系统（Thermo Fisher Scientific，德国Schwerte）上进行，使用补充表S2中显示的梯度。相对基因表达通过将六个毒力基因的绝对表达值除以16S rRNA的绝对表达值来计算。每个实验每个生物重复三次，每个重复三次。

2.2.6 确定毒力基因表达通过定量动力学PCR（qPCR）
S. mutans细胞在含有0.2%（w/v）蔗糖的BHI培养基中生长以促进生物膜形成。使用公式3将细菌悬液稀释至最终光密度为0.35：
Xml = (0.35 × 10^m) × LODMeasured
其中XML表示达到0.35光密度所需的细菌悬液体积（总体积10 mL）。因此，10 mL - XML即为稀释所需的含有0.2%（w/v）蔗糖的BHI体积，将其加入到三个高压灭菌的试管中。向每个试管中加入计算出的细菌悬液量后，每个试管涡旋一分钟。将细菌悬液分配到24个微管中，并分别准备青霉素和卡达蒙精油的处理。在37°C和250 rpm下培养24小时后，收集细胞，并按照Rio等人的方案提取RNA（略有修改）：初次离心在12,000 × g和4°C下进行15分钟。最终RNA沉淀物用1 mL 70%（v/v）乙醇溶于纯净水在1,400 rpm下清洗10分钟，然后以7,500 × g和4°C离心5分钟。去除上清液后，沉淀物在室温下风干5分钟，并重新悬浮在25 μL无核酸酶水中。使用NanoDrop? OneC分光光度计（Thermo Fisher Scientific，德国Schwerte）测量RNA浓度。然后按照Hornbacher等人的方法进行逆转录为cDNA和动态定量聚合酶链反应（qPCR），并进行少量修改。使用随机非amer引物进行cDNA合成。qPCR在10 μL反应混合物中进行，该混合物包含5 μL PowerTrackTM SYBR green mastermix（Thermo Fisher Scientific GmbH，德国Schwerte）、每种引物0.4 μL（Eurofins Genomics，德国Ebersberg）、2 μL cDNA模板和无核酸酶水。分析了七个目标基因，引物列在表1中。还包括了用无核酸酶水代替cDNA模板的阴性对照。为了量化cDNA，通过将三个重复样品在一个孔中混合并在其中再稀释五倍来准备标准曲线（见补充表S1的最终浓度）。qPCR在QuantStudio?系统（Thermo Fisher Scientific，德国Schwerte）上进行，使用补充表S2中显示的梯度。相对基因表达通过将六个毒力基因的绝对表达值除以16S rRNA的绝对表达值来计算。每个实验每个生物重复三次，每个重复三次。

2.2.6 统计分析
所有统计分析均使用Posit Software PBC（美国波士顿）的RStudio进行。数据进行了正态性（Shapiro–Wilk）和方差同质性（Levene's test）检验。组间差异通过Kruskal–Wallis检验进行分析，随后使用Dunn's post hoc检验，调整后的p < 0.05。结果以平均值±标准差表示。

3 结果
3.1 抗菌活性（琼脂孔扩散试验）
精油（EOs）的抑制圈直径平均在10 mm到15 mm之间，主要取决于EO的浓度（图1）。只有薄荷EO和留兰香EO在稀释40倍后抑制圈直径没有减小。卡达蒙EO产生的抑制圈最大，显著大于柠檬香味口香糖EO和八角茴香EO的抑制圈（见补充表S3）。南方蓝胶EO、茶树EO、野生薄荷EO和肉豆蔻EO的抑制圈相似。柠檬、生姜、柑橘、柠檬香味口香糖和留兰香的抑制圈非常小，而八角茴香几乎没有任何效果。所有稀释后的EO的pH值都在6到7之间。溶剂DMSO的pH值也在同一范围内。
图1：12种精油对S. mutans的抑制圈（cm）与DMSO和1 μg/mL青霉素（阳性对照）的比较。黑色和灰色条形代表分别溶于DMSO中的5.00%和2.50%（v/v）精油的精油。数值为平均值±标准差（n = 9）。相对于DMSO对照的统计显著性通过Kruskal–Wallis检验 followed by Dunn's post hoc检验（Bonferroni校正）确定。图中的显著差异（p < 0.05）用星号表示。

3.2 最小抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）
卡达蒙精油（CEO）对S. mutans的MIC为2.50%，而MBC为5.00%（图2）。对于2.50% CEO处理和5.00% CEO处理，在620 nm处的光密度（OD620）没有增加（图2）。较高稀释度范围内的0.01%至0.16% CEO的生长曲线与参考生长曲线没有差异。0.31%和0.63% CEO的生长曲线似乎稍晚一些开始上升。1.25% CEO的生长曲线在较晚的时间开始上升，且斜率较低（图2）。显著差异见补充表S4。

3.3 CEO对生物膜形成的抑制
由于肉汤微稀释试验显示CEO的存在减少了S. mutans的生长，因此进行了晶体紫试验以阐明其对生物膜形成的影响。在5.00% CEO浓度下，生物膜形成减少了99.4 ± 1.25%（图3）。这种减少显著高于0.01% CEO、0.02% CEO、0.08% CEO和VC+样品的减少幅度（见补充表S5）。在5.00% CEO浓度下，对生物膜形成的抑制作用与5 μg/mL和0.5 μg/mL青霉素的效果相似。2.50% CEO浓度略微抑制了生物膜的生长，甚至低于0.05 μg/mL青霉素的对照组。所有其余CEO浓度在0.01%到1.25%之间的样本均没有显示出显著的抑制作用（图3）。

图3：在豆蔻精油（CEO；0.01%–5.00%）和青霉素（0.05–5 μg/mL）存在下，S. mutans生物膜形成的抑制率（%）。深色条形表示在含有0.2%（w/v）蔗糖和1%（v/v）DMSO的BHI肉汤中稀释的CEO样品；浅色条形对应于在相同条件下制备的青霉素对照组。数值以平均值±标准差（n=9）呈现。统计显著性通过Kruskal–Wallis检验后采用Dunn的事后检验和Bonferroni校正来确定（p<0.05）。

3.4 对细胞活力的影响

进行了MTT实验来分析是仅生物膜形成受到干扰还是生物体的活力受到干扰。在5.00% CEO浓度下，S. mutans的计算细胞活力下降了76.1 ± 15.51%（图4）。这与5 μg/mL或0.5 μg/mL青霉素的效果显著不同，并且明显低于它们的抑制效率，因为它们的抑制率分别为101.7 ± 3.02%和101.0 ± 3.28%（补充表S6）。然而，5.00% CEO的抑制效果高于0.05 μg/mL青霉素。0.63%和1.25%的CEO浓度对S. mutans的抑制作用显著低于5 μg/mL或0.5 μg/mL青霉素对照组。尽管没有显著差异，但0.31% CEO样品也显示出低于0%的抑制率，这表明其对细胞活力的影响低于上述两种青霉素对照组。

图4：豆蔻精油（CEO；0.01%–5.00%）和青霉素（0.05–5 μg/mL）对S. mutans细胞活力的影响。深色条形代表CEO样品，浅色条形代表青霉素对照组，两者都在含有0.2%（w/v）蔗糖和1%（v/v）DMSO的脑心浸出肉汤中稀释。数值为平均值±标准差（n=9，青霉素0.05 μg/mL的情况除外，去除异常值后n=7）。根据Kruskal–Wallis检验后采用Dunn的事后检验（Bonferroni校正），与未经处理的对照组相比没有观察到统计学上的显著差异（p≥0.05）。

3.5 对毒力基因表达的影响

进行了qPCR分析以阐明CEO对六个毒力基因表达水平的影响。随着CEO浓度的增加，ldh基因的表达水平上升（图5）。在1.25%和2.50% CEO浓度下，这些水平低于未经处理的阴性对照（NC），而5.00%和10.00% CEO处理下的水平高于NC。所有CEO处理组的gtfB基因相对表达水平都高于NC，并且随着CEO浓度的增加而逐渐下降。1.25% CEO处理组的水平几乎是NC的三倍。2.50% CEO处理组的水平大约是NC的1.5倍，但5.00%和10.00% CEO处理组的水平与NC相似。对于gtfC、gtfD和gbpB的相对基因表达也观察到了类似的趋势。从1.25% CEO到2.50% CEO，这些水平略有下降，然后在5.00%和10.00% CEO时逐渐上升。在10.00% CEO下，gtfC和gtfD的相对表达水平高于gbpB。在vicR的情况下，所有CEO处理组的相对基因表达水平都高于NC。从1.25% CEO处理组到2.50% CEO处理组，这些水平略有上升，但在5.00% CEO处理组时水平相似。总体而言，这四个水平之间的差异不大，但都比NC的水平高出两倍以上。显著差异显示在补充表S7中。

图5：豆蔻精油（CEO；1.25–10.00%）和青霉素（0.05–5 μg/mL）对S. mutans中与毒力相关的基因（gtfB、gtfC、gtfD、ldh、gbpB和vicR）相对表达的影响。表达水平归一化为16S rRNA，并以平均值±标准差（n=9）呈现。统计分析使用Kruskal–Wallis检验后采用Dunn的事后检验和调整后的p值（Bonferroni校正，p<0.05）进行。

4 讨论

本研究表明，豆蔻精油（CEO）对S. mutans具有抑制作用，包括在体外抑制生长和生物膜形成。在筛选的十二种食品来源的精油中，CEO显示出最强的抗菌活性，支持其作为天然抗菌剂的潜力。不同精油活性的差异主要取决于植物种类及其次级代谢物的组成。植物来源、提取方法、储存条件以及包括温度和湿度在内的环境参数等因素进一步调节了这种组成，从而解释了即使来自同一植物种类的精油之间也存在生物效应的差异（24, 25, 29, 34–45）。与此一致，文献中报告的CEO及其衍生物的最小抑制浓度（MIC）值也存在显著差异。例如，Karimi等人（25）报告CEO的MIC值为0.03 mg/mL，而Binimeliz等人（24）报告乙醇提取物的MIC值为7.34 mg/mL。这些差异被认为与所使用的提取方法以及植物来源的差异有关，也与1,8-桉叶油的浓度差异有关，1,8-桉叶油是CEO的主要活性成分。

与更广泛研究的精油（如丁香油或茶树油）相比，关于CEO对致龋细菌的影响的研究相对较少。Yang等人（46）的研究也支持1,8-桉叶油在CEO抗菌活性中的作用。在这项研究中，报告称Litsea cubeba精油（LC-EO）对S. mutans的最小杀菌浓度（MMC）范围为0.375到1.5 mg/mL（无生物膜），而与生物膜相关的MMC大约是这个值的两倍。有趣的是，本研究中测得的CEO样品中的1,8-桉叶油水平超过了这些MMC，表明油中的其他成分可能调节其效力，或者生物膜内的细菌聚集提供了部分保护。

CEO通常含有20%–30%的1,8-桉叶油，以及α-萜品烯、芳樟醇和萨比烯（46–49）。已知这些化合物可以破坏细菌膜和酶活性，但它们的具体相互作用尚不清楚。目前的数据表明，虽然1,8-桉叶油是主要的抗菌成分，但其活性可能会受到共存化合物的协同或拮抗作用的影响。

生长曲线分析表明，CEO表现出浓度依赖性的抑制作用。在低浓度下观察到的效果有限，而在中等浓度下观察到部分抑制，在高浓度下观察到显著的生长抑制。这表明即使低于MIC的浓度也能干扰细菌生理，因此不应忽视亚致死效应。关于生物膜抑制，本研究首次直接证明了CEO对S. mutans生物膜的作用。与其他精油如丁香油或柠檬油相比，CEO需要更高的浓度才能达到类似的生物膜抑制效果，这表明在这方面的潜力可能较低（44, 50, 51）。尽管如此，5% CEO对生物膜的破坏程度与5 μg/mL青霉素相当，尽管大约24%的细胞仍然存活。这些发现表明CEO干扰的是生物膜的完整性，而不是完全消灭浮游细胞，这与Vazquez等人（52）提出的假设一致，他们认为1,8-桉叶油可以穿透生物膜并创建微孔，破坏结构而不会导致细胞死亡。

He等人证明肉桂醛对S. mutans的杀菌效果优于CEO（30）。这表明精油的抗菌活性不仅取决于其组成，还取决于其活性成分的浓度。实际上，Song等人（42）证明必须使用高浓度的精油才能完全消除S. mutans。与这些研究类似，本研究也发现CEO的抗菌效果是浓度依赖性的，且只有在高浓度下才观察到细胞活力的显著下降。

在豆蔻精油暴露下观察到的毒力相关基因的上调可能代表了细菌的应激反应。尽管qPCR实验包括了高达杀菌水平的CEO浓度，但这些实验是在形成生物膜的条件下进行的，预计细胞活力的空间异质性较大。正如针对S. mutans和其他形成生物膜的物种所报告的，杀菌剂可能有效地杀死生物膜表面的细胞，而深层中的亚群仍然存活并具有代谢活性。因此，检测到的转录本可能来自生物膜内的存活细胞，而不是来自裂解的细胞。这种方法旨在模拟口腔生物膜的情况，在那里完全根除细菌的情况很少发生，应激诱导的基因调控有助于持续性和适应性。因此，认为S. mutans在抗菌化合物引起的次优条件下增加了粘附和生物膜相关因子的表达，以维持其定植能力。

CEO对毒力基因表达的影响与ficin相似，但与肉桂醛相反。虽然肉桂醛减少了gtfB的表达，但ficin和CEO（尤其是在1.25%和2.50%的浓度下）显著增加了它。对于gtfC和gtfD也观察到了类似的趋势，认为这些增加可能支持可溶性和不溶性葡聚糖的产生（19, 30）。这样的转录变化可能与S. mutans在不利条件下（如生物膜形成抑制或细胞损伤）发展出补偿性反应有关。观察到gbpB的表达增加与surface adhesion相关，而vicR的表达增加则调节了多种毒力基因。在CEO和ficin的影响下，观察到vicR的表达增加与gbpB、gtfB和gtfD基因的增加一致。相比之下，ldh基因的表达不受vicR的调节，并且对CEO表现出浓度依赖性的响应。在低浓度下观察到的减少与肉桂醛对ldh表达的影响相似，而在高浓度下观察到的增加与ficin的响应相似。鉴于CEO的MIC为5.00%，认为在抑制浓度下观察到的ldh表达增加可能与膜破坏导致的能量需求增加有关，从而可能增强丙酮酸向乳酸的转化。

尽管发现CEO对S. mutans具有显著的抑制作用，但本研究无法直接证明其背后的具体机制。根据观察到的表型和转录变化，认为CEO可能干扰细菌膜的完整性、生物膜相关功能或应激反应途径。然而，需要直接的机制分析，如膜完整性测定、电子显微镜或膜电位测量来验证这些假设。此外，CEO在哺乳动物细胞中的安全性尚未评估。需要进行细胞毒性和溶血试验来确定其在临床应用中的潜在性。

5 结论

本研究提供了关于豆蔻精油（CEO）对S. mutans的抗菌和抗生物膜作用的重要发现。值得注意的是，5.00% CEO浓度被确定为杀菌剂，并显著抑制了生物膜的形成。基因表达分析与表型观察之间的相关性表明，CEO对S. mutans具有生物学上的显著影响。这些发现表明它可能具有防止S. mutans在牙齿表面定植的潜力，并为开发天然口腔护理产品提供了希望。

6 局限性和未来展望

本研究的一个局限性是使用16S rRNA作为参考基因。尽管它在之前的S. mutans研究中经常被使用（例如（30），但有多份报告警告说其在应激条件下的表达可能会变化，这可能会影响normalization的准确性。因此，我们不能完全排除将正常化归一化为16S rRNA可能对某些变化的大小有所贡献。然而，多个毒力基因中观察到的一致方向以及与表型数据的一致性支持了结果反映生物学应激反应的结论。在未来的研究中，建议使用geNorm、NormFinder或BestKeeper等方法验证S. mutans的其他参考基因（例如gyrA、recA、tuf、rpoB、atpD）（53–55）。此外，本研究使用的是单一物种的S. mutans培养物进行。然而，龋齿是一种多微生物疾病，此处观察到的CEO的抑制作用可能无法完全应用于混合微生物生物膜或体内条件。因此，未来的研究应包括其他致龋菌种和多微生物生物膜模型，以更好地反映临床情况。本研究的另一个局限性是缺乏直接证据来解释CEO抑制S. mutans的机制。尽管结果表明其对细菌生理和毒力相关过程可能具有影响，但仍需要进一步的研究来探讨具体的机制。另外，使用16S rRNA作为参考基因可能存在局限性，未来的研究应考虑使用其他参考基因，如gyrA。还有一个局限性是在哺乳动物细胞系中未对CEO的细胞毒性和生物相容性进行评估。未来的研究应包括在上皮细胞系和红细胞中进行细胞毒性测试和溶血测试等方法，以评估其安全性。建议未来的研究应专注于在多微生物和体内模型中评估CEO的活性，以更好地反映临床情况，并改进其水溶性及制备成具有成本效益的配方，以便实际应用于口腔卫生产品中。