骆驼博卡病毒多表位疫苗候选物的制备及其在小鼠模型中的免疫原性评价

《Frontiers in Immunology》：Preparation of a multiepitope vaccine candidate for camel bocavirus and evaluation of its immunogenicity in a mouse model

　　

摘要 引言：单峰骆驼博卡病毒（Dromedary camel bocavirus, DBoV）对骆驼健康构成威胁，但目前尚无可用疫苗。 方法：研究人员运用免疫信息学方法，预测了源自DBoV VP1/VP2蛋白的B细胞、细胞毒性T细胞（CTL）和辅助性T细胞（HTL）表位。设计了四种含有不同佐剂的多表位构建体（DBoV-A1至A4），并进行了计算机模拟评价。选择DBoV-A2和DBoV-A4在大肠杆菌中表达、纯化，并在BALB/c小鼠模型中进行测试。 结果：计算机模拟结果显示，DBoV-A2和DBoV-A4与Toll样受体9（TLR9）有强结合力，且分子动力学模拟稳定。在小鼠体内实验中，两种构建体均能诱导产生显著水平的抗原特异性免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）和免疫球蛋白A（IgA）抗体反应，促进Th1/Th2型细胞因子分泌，并引起CD4+T细胞扩增，且未观察到器官毒性。 讨论：计算机模拟预测与体内免疫原性结果之间的一致性，支持了这些多表位构建体作为有前景的DBoV疫苗候选物的潜力。

一、 研究背景与问题

骆驼产业作为特色畜牧业，在促进牧区经济增长中扮演重要角色。然而，随着养殖规模的扩大，传染病风险也随之增加。单峰骆驼博卡病毒（Dromedary camel bocavirus, DBoV）作为一种新发病原体，因其高感染率和潜在的跨物种传播风险而受到关注。该病毒属于细小病毒科，具有独特的开放阅读框3（ORF3）基因组结构，基因组为线性单链DNA，编码非结构蛋白NS1、NP1以及衣壳蛋白VP1和VP2。研究表明，该病毒在骆驼群体，尤其是幼年个体中感染率较高。目前，针对DBoV的有效商业疫苗尚属空白，其致病机制也尚未完全阐明，防控措施不足。因此，开发安全有效的疫苗已成为紧迫的研究任务。

随着反向疫苗学和免疫信息学的发展，基于计算模型筛选免疫原性表位，并设计多表位疫苗已成为应对新发、突发或复杂病原体的有效策略。多表位疫苗能够整合不同病原体蛋白的关键免疫表位，具有广谱、高效、可应对抗原变异等优势。本研究旨在利用免疫信息学方法，设计并评估针对DBoV的多表位疫苗候选物，以期为DBoV的防控提供新的解决方案。本研究成果发表在免疫学领域的学术期刊《Frontiers in Immunology》上。

二、 主要技术方法概述

本研究采用了一套结合计算机模拟与动物实验的系统性研究方法。首先，研究人员从国家生物技术信息中心（NCBI）数据库获取了23株不同DBoV毒株的VP1和VP2蛋白序列，筛选出抗原性最高的参考序列。随后，利用一系列生物信息学工具和服务器进行预测与分析：通过ABCpred服务器预测B细胞线性表位（BCL），通过NetMHCpan-4.1预测细胞毒性T细胞（CTL）表位，通过NetMHCIIpan-2.1预测辅助性T细胞（HTL）表位。候选表位进一步通过VaxiJen v2.0、AllerTOP v2.0、ToxinPred等工具进行抗原性、过敏原性和毒性评估。利用筛选出的安全、高免疫原性表位，研究人员分别与四种佐剂（β-防御素-3、HBHA、L7/L12、FliC）通过特定的连接肽（EAAAK、AAY、GPGPG、KK）连接，构建了四种多表位疫苗（DBoV-A1至A4）。对构建体进行理化性质、二级/三级结构预测与优化（使用NetSurfP-3.0、I-TASSER、GalaxyRefine），并通过Ramachandran图、ProSA、ERRAT进行结构验证。通过ElliPro预测构象性B细胞表位。利用ClusPro 2.0进行疫苗与牛Toll样受体9（TLR9）的分子对接，并用GROMACS进行100纳秒的分子动力学模拟以评估复合物稳定性。通过C-ImmSim服务器对DBoV-A2和DBoV-A4进行了免疫反应模拟。最后，将优选的两个构建体（DBoV-A2和DBoV-A4）的编码序列克隆至pET30a载体，在^大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，通过镍柱亲和层析纯化。将纯化的融合蛋白与弗氏佐剂乳化后，皮下免疫6-8周龄的雌性BALB/c小鼠，设立PBS+佐剂对照组、DBoV-A2组和DBoV-A4组。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清中特异性IgG、IgA、IgM抗体滴度及细胞因子（IL-4、IFN-γ）水平；通过流式细胞术分析脾脏淋巴细胞中CD4⁺和CD8⁺T细胞比例；并对主要脏器进行组织病理学检查评估安全性。数据采用GraphPad Prism软件进行统计分析。

三、 研究结果

1. 目标蛋白的选择

从23株DBoV毒株中筛选出抗原性评分最高的VP1和VP2蛋白序列（登录号分别为ASC49312.1和ASC49313.1），其抗原性得分均高于0.5，确认为适合的免疫原靶标。

2. B细胞表位预测

通过ABCpred服务器预测并筛选，最终从VP1和VP2蛋白中各获得3个具有强抗原性、无过敏原性、无毒性和无突变倾向的B细胞线性表位，共6个，用于疫苗设计。

3. CTL表位预测

利用NetCTL 1.2服务器预测，经过抗原性、免疫原性、安全性筛选，最终获得7个CTL表位（4个来自VP1，3个来自VP2），它们能有效结合特定的牛白细胞抗原（BoLA）等位基因。

4. HTL表位预测

通过NetMHCII服务器预测，并结合IFN epitope和IL4pred工具评估其诱导干扰素-γ和白细胞介素-4的能力，最终筛选出4个HTL表位（3个来自VP1，1个来自VP2）作为候选。

5. 四种多表位疫苗的构建

利用上述筛选出的6个B细胞表位、7个CTL表位和4个HTL表位，分别与四种不同佐剂（β-防御素-3、HBHA、L7/L12、FliC）以及一个泛HLA-DR结合表位序列连接，构建了四种多表位疫苗DBoV-A1、A2、A3、A4。

6. 预测的抗原性、稳定性与安全性

理化性质分析表明，四种构建体均为非过敏原、可溶性抗原蛋白，抗原性评分均大于0.5，不稳定指数小于40，具有良好稳定性。

7. DBoV-A2和DBoV-A4显示出更优的结构质量

二级结构预测显示四种疫苗均含稳定结构。三级结构建模与验证（Ramachandran图、Z值等）结果表明，DBoV-A2和DBoV-A4的结构质量优于A1和A3，因此被选为后续研究的重点。

8. DBoV-A2/A4中确认存在构象性B细胞表位

利用ElliPro软件预测，DBoV-A2和DBoV-A4均包含多个构象性B细胞表位，涵盖大量氨基酸残基且评分较高，支持了其免疫原性潜力。

9. DBoV-A2和DBoV-A4与TLR9稳定结合

分子对接显示，DBoV-A2和DBoV-A4与牛TLR9具有较强的结合亲和力（能量评分低）。后续的100纳秒分子动力学模拟（分析均方根偏差RMSD、均方根涨落RMSF、回转半径Rg、溶剂可及表面积SASA）证实了两种疫苗-TLR9复合物在模拟时间内保持相对稳定。

10. 免疫模拟预测DBoV-A2/A4可诱导强烈的免疫反应

使用C-ImmSim服务器进行的计算机免疫模拟显示，DBoV-A2和DBoV-A4在模拟接种后能诱导高水平的免疫球蛋白、B细胞、T细胞（辅助性和细胞毒性）活性，并增加巨噬细胞、树突状细胞数量，同时提升干扰素-γ、白细胞介素-2、白细胞介素-12等细胞因子水平，预测其能诱导有效的免疫应答。

11. DBoV-A2和DBoV-A4的成功表达与纯化

重组质粒pET30a-DBoV-A2和pET30a-DBoV-A4经双酶切和测序验证正确。在^大肠杆菌中诱导表达后，SDS-PAGE和Western blot证实成功表达了大小正确的DBoV-A2和DBoV-A4融合蛋白，并经镍柱纯化获得高纯度蛋白。

12. DBoV-A2和DBoV-A4在小鼠中具有安全性

对免疫后小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏进行组织病理学检查。与佐剂对照组相比，接种DBoV-A2或DBoV-A4融合蛋白的小鼠主要器官未观察到显著的病理损伤，表明这两种融合蛋白本身具有良好的全身安全性。

13. DBoV-A2和DBoV-A4诱导强烈的体液和细胞免疫

血清学检测显示，经过三次免疫，DBoV-A2和DBoV-A4组小鼠血清中抗原特异性的IgG、IgA和IgM抗体滴度均随时间推移逐步显著升高，且显著高于对照组，表明其诱导了全面的体液免疫应答。细胞免疫分析显示，与对照组相比，DBoV-A2和DBoV-A4组小鼠血清中Th1型细胞因子干扰素-γ和Th2型细胞因子白细胞介素-4的水平均显著升高，表明疫苗诱导了混合的Th1/Th2型免疫应答。流式细胞术分析脾脏T细胞亚群显示，实验组小鼠CD4⁺T细胞比例及CD4⁺/CD8⁺比值显著高于对照组，而CD8⁺T细胞比例无显著变化，表明免疫反应以CD4⁺辅助性T细胞扩增为主。+/CD4⁺and CD3⁺CD8⁺T lymphocytes were determined by flow cytometry. (G) Statistical analysis of the CD3⁺/CD4⁺/CD3⁺CD8⁺ratio across different groups. Significance was calculated using an unpaired two-tailed Student’s t test (*P < 0.05; P < 0.01;*P < 0.001; ns indicates not statistically significant).">

四、 讨论与结论

在讨论部分，研究人员阐述了本研究的思路、依据及局限性。由于骆驼主要组织相容性复合体数据缺乏，本研究参考了亲缘关系较近的反刍动物——牛的MHC等位基因作为表位筛选的免疫遗传背景。研究选择了DBoV的结构蛋白VP1和VP2作为靶标，借鉴了针对犬细小病毒等多表位疫苗的设计经验。在构建过程中，使用了柔性连接肽以确保各表位的正确折叠和功能独立性，并引入了四种具有不同免疫刺激机制的佐剂以及泛HLA-DR结合表位以增强疫苗的免疫原性和稳定性。

对四种构建体的系统评估表明，DBoV-A2和DBoV-A4在结构质量、B细胞构象表位预测、以及与Toll样受体9的结合亲和力和复合物稳定性方面均表现优异。计算机免疫模拟也预测其能诱导强烈的免疫应答。这些计算预测在随后的动物实验中得到了验证：DBoV-A2和DBoV-A4在小鼠体内安全，并能诱导强烈的体液免疫（产生高滴度IgG、IgA、IgM抗体）和细胞免疫（促进CD4⁺T细胞扩增，并诱导Th1/Th2型细胞因子分泌）。

研究人员也指出了本研究的局限性：缺乏攻毒保护实验；使用了弗氏佐剂，其本身的强免疫刺激作用可能掩盖了内置佐剂的独立贡献；由于MHC背景差异，小鼠的免疫学数据不能直接外推至骆驼；表位筛选基于牛的MHC等位基因，未来需基于骆驼MHC数据进行优化。此外，观察到的疫苗蛋白与TLR9的结合不等于功能性激活，后续需通过TLR9报告基因实验验证其免疫刺激潜力。

研究结论：

计算机模拟预测与体内免疫原性之间的一致性，支持了DBoV-A2和DBoV-A4多表位构建体作为有前景的DBoV疫苗候选物。