利用mRNA脂质纳米颗粒快速评估免疫效应细胞介导的细胞毒性

《Frontiers in Immunology》：Rapid assessment of immune effector cell-mediated cytotoxicity using mRNA lipid nanoparticles

　　

细胞免疫疗法通过实现更具靶向性和个性化的疾病管理，彻底改变了癌症治疗。随着该领域的发展，人们越来越需要高通量的体外实验来有效评估治疗性细胞的细胞毒性。传统的细胞毒性实验在工作流程和可扩展性方面存在各种限制。在此，研究人员提出了一种mRNA脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）方法，可高效、稳健地将报告基因递送至靶细胞，用于评估免疫效应细胞介导的细胞毒性。该方法能够在不影响靶细胞活力的前提下，实现快速、均一的报告基因表达。使用mRNA-LNP转染细胞获得的细胞毒性结果具有高度一致性，并且与使用稳定表达报告基因的细胞系获得的结果具有可比性。最后，研究人员强调了mRNA-LNP方法在多种肿瘤模型（包括原发性肿瘤来源模型）中的广泛适用性，从而能够快速、高通量地评估各种细胞毒性治疗细胞的效力。

论文解读：利用mRNA-LNP快速评估免疫效应细胞介导的细胞毒性

一、 研究背景与问题

细胞免疫疗法，特别是嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法，已在血液系统恶性肿瘤治疗中取得革命性进展。随着T细胞受体（TCR）工程化T细胞、肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）疗法及其他免疫效应细胞（如自然杀伤（NK）细胞）的不断发展，对治疗性细胞进行准确、高效的细胞毒性评估变得至关重要。这种评估贯穿细胞疗法的整个生命周期，从早期候选物筛选、机制研究到后期产品质量控制。

然而，传统的细胞毒性评估方法存在诸多局限。金标准方法通常依赖于通过病毒转导（如慢病毒）使靶细胞稳定表达报告蛋白（如绿色荧光蛋白（GFP）或萤火虫荧光素酶（Fluc））。但此过程耗时（通常需要数周至数月）、成本高昂，且许多肿瘤细胞系（尤其是原代细胞）难以转导，通常需要通过流式分选、抗生素筛选或单细胞克隆以获得均一的报告细胞系，这可能损耗宝贵的肿瘤细胞异质性，降低临床相关性。此外，病毒转导存在插入突变风险，可能改变靶细胞的表型。非病毒方法（如DNA转染或电穿孔）则常导致细胞活力严重下降，且需要繁琐的细胞系特异性优化。细胞标记染料虽然快速，但信号在分裂细胞中衰减明显，且同样存在细胞系特异性问题。

因此，研发一种快速、安全、稳健、通用且可高通量应用于多种肿瘤模型和免疫效应细胞类型的报告细胞生成及细胞毒性评估方法，是当前领域的重要需求。本研究旨在解决这一瓶颈。

二、 研究方法概要

本研究开发并验证了一种基于mRNA脂质纳米颗粒（mRNA-LNP）的报告基因递送系统，用于快速评估免疫效应细胞的细胞毒性。核心流程是：将编码报告基因（GFP或Fluc）的mRNA封装在LNP中，与靶细胞（肿瘤细胞）共孵育进行转染，随后将转染后的报告细胞与免疫效应细胞（如CAR-T细胞、NK细胞）共培养，最后通过成像（Incucyte系统监测GFP信号）或发光（荧光素酶底物）检测来量化细胞毒性。靶细胞包括已建立的肿瘤细胞系（如NALM6（B-ALL）、A375（黑色素瘤）、B16F10（鼠黑色素瘤）等）以及患者来源的原代肿瘤细胞系（如SJSA-1（骨肉瘤）、CY1006（黑色素瘤）、KL1118（胶质母细胞瘤）等），均由相关研究机构提供。免疫效应细胞包括靶向CD19、EGFRvIII、TYRP1等抗原的人源及鼠源CAR-T细胞，以及NK92细胞系。研究通过流式细胞术、Incucyte活细胞成像分析和荧光素酶活性检测等技术，系统评估了mRNA-LNP转染的效率、动力学、细胞毒性以及对细胞活力的影响，并将其结果与传统的慢病毒（LV）转导稳定系方法进行直接对比。

三、 研究结果

1. mRNA-LNP能够实现对靶细胞的高效、低毒标记，并在细胞毒性实验中产生与病毒转导细胞可比的结果

研究人员以NALM6细胞为模型，使用GFP mRNA-LNP进行转染。流式细胞术分析显示，转染后4小时内即有近100%的细胞表达GFP，24小时达峰值，且表达可稳定维持至72小时。转染对细胞活力影响极小，各剂量和时间点下细胞活力均保持在85%以上。将mRNA-LNP转染的NALM6细胞与CD19-CAR T细胞共培养，其杀伤动力学和剂量依赖性与慢病毒转导的稳定报告细胞系高度一致，两者数据的决定系数（r²）非常高。即使将mRNA-LNP剂量降低至0.2 μg/百万细胞，仍能获得稳健的细胞毒性读数。与电穿孔和阳离子脂质体转染等现有方法相比，mRNA-LNP法在维持高细胞活力（>80%）、高转染效率（>80%）和低成本方面更具优势。

2. mRNA-LNPs方法可实现同日快速的细胞毒性评估

使用Fluc作为报告基因时，NALM6细胞在转染后24小时发光信号达到峰值。将mRNA-LNP或慢病毒来源的Fluc表达NALM6细胞与CD19-CAR T细胞共培养24小时，两者的细胞毒性数据高度可比（r²= 0.8864）。值得注意的是，即使在转染后72小时（此时报告基因表达已降至峰值20%以下）再进行细胞毒性检测，读数仍然灵敏、稳健。研究人员进一步尝试了加速实验流程：NALM6细胞经Fluc mRNA-LNP转染4小时后，即与CD19-CAR T细胞共培养4或6小时。结果在10:1的效应靶比（E:T）下，4小时即可检测到超过80%的特异性靶细胞裂解，表明整个评估流程可在8小时内完成。

3. mRNA-LNPs方法适用于评估对已建立和原发性实体瘤的细胞毒性

在实体瘤模型B16F10中，mRNA-LNP转染可实现与慢病毒转导相当的稳定GFP表达，且48小时内细胞活力均高于90%。使用靶向TYRP1的鼠源CAR T细胞进行杀伤实验，mRNA-LNP与慢病毒方法产生的报告细胞在杀伤动力学和剂量响应上几乎一致，各E:T比下的r²>0.9。更重要的是，该方法成功应用于多种患者来源的原代肿瘤细胞系（SJSA-1, CY1006, KL1118）以及已建立的实体瘤细胞系（RD, MDA-MB-231）。所有这些细胞系经GFP mRNA-LNP转染后，均在48小时内表现出均一、稳定的高GFP表达，且细胞活力保持在80%以上。以EGFRvIII阳性的KL1118细胞为靶细胞，评估EGFRvIII-CAR T细胞的杀伤效果，结果显示在5:1的E:T比下，24小时内可实现高达80%的杀伤。

4. 基于mRNA-LNP的细胞毒性测定广泛适用于评估免疫效应细胞介导的靶细胞杀伤

研究将方法扩展到评估NK细胞介导的细胞毒性。使用A375人黑色素瘤细胞作为靶细胞，经mRNA-LNP转染后，GFP表达在48小时内保持稳健。将mRNA-LNP转染或慢病毒转导的A375细胞与NK92细胞共培养，结果显示两种方法在剂量响应、杀伤动力学和总体细胞毒性上均表现出高度一致性，各E:T比下的r²> 0.86，证明了该方法在评估NK细胞杀伤活性上的有效性。

四、 讨论与结论

讨论：

本研究引入了一种利用mRNA-LNP瞬时生成报告细胞系的简化方案，以快速、高通量地评估治疗性免疫效应细胞的细胞毒性。该方法确保了报告蛋白均一、无毒的瞬时表达，同时保持了靶细胞活力，并最大限度地降低了成本，避免了耗时的优化过程。该方案整个流程（包括mRNA-LNP报告基因递送和免疫效应细胞杀伤）最快可在8小时内完成。其他优势在于报告基因选择的灵活性，以及在广泛的已建立和患者来源肿瘤模型中的高度一致性。重要的是，使用mRNA-LNP方法生成的数据与通过金标准慢病毒转导生成的报告系统数据在多类免疫效应细胞（包括CAR-T和NK细胞）中均显著相似。这些特性使得基于mRNA-LNP的细胞毒性测定成为一种通用且稳健的替代方案，可用于确定免疫效应细胞的效力，并助力多种细胞免疫疗法的开发。

当然，该方法也存在一定局限性：由于报告基因表达是瞬时的，信号强度会随时间下降，且可能因靶细胞类型、mRNA载体和实验时间而异；某些肿瘤模型对LNP摄取的易感性可能存在差异；该方法适用于短期细胞毒性测定，可能不太适合需要长时间靶细胞追踪的实验；对于任何新的靶细胞类型，仍需评估转染对细胞健康或表型的潜在影响。实际操作中，性能不佳可能源于试剂储存/处理不当、报告表达不足或靶细胞活力下降，通常可通过调整mRNA-LNP剂量、基于报告动力学缩短或延长转染时间、在共培养前更换新鲜培养基、以及验证基线靶细胞活力和表型来解决。

结论翻译：

基于mRNA-LNP的细胞毒性测定为确定免疫效应细胞的效力提供了一种通用且稳健的替代方案，有助于各种细胞免疫疗法的发展。