成熟高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]籽粒的非靶向代谢组学揭示与产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)抗菌活性相关的代谢物

《Frontiers in Plant Science》：Untargeted metabolomics of mature sorghum [Sorghum bicolor (L.) Moench] grain reveals metabolites associated with antimicrobial activity against Clostridium perfringens

　　

摘要 家禽产业正面临抗生素耐药菌的挑战，尤其是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)——坏死性肠炎的致病因子。高粱籽粒因其高酚类含量可为消费者提供健康益处，为家禽饲料提供了良好机会。虽然高粱籽粒中的缩合单宁通过与蛋白质结合和降低家禽肠道养分吸收具有抗营养作用，但其浓度受遗传控制，且存在无单宁高粱。本研究利用液相色谱-质谱(LC-MS)非靶向代谢组学分析了由189个个体及双亲组成的无单宁高粱重组自交系(RIL)群体，以研究其对产气荚膜梭菌的抗菌(AM)活性。抗菌活性通过两种方法测量：1) 用籽粒酚类提取物进行最低抑菌浓度(MIC)分析；2) 基于定量聚合酶链反应(qPCR)的方法测量体外酶消化籽粒的细菌抑制。结果表明，具有不同抗菌活性的重组自交系表现出不同的代谢谱，且这些谱在不同方法间存在差异。qPCR测定分类揭示了更多富集的通路，其中α-亚麻酸代谢最为显著。同时，类黄酮生物合成是基于MIC的抗菌性状最富集的通路。代谢物选择分析显示，13种代谢物在区分高、低抗菌活性重组自交系中最相关，包括两种暂定为镰孢菌(Fusarium)产物的代谢物(C0153b和C0560)——镰孢菌是测试环境中天然存在的病原菌。这13种代谢物中只有两种在高抗菌活性品系中丰度更高，即羟基肉桂酸C0540和甘油磷酸C0916。数量性状位点(QTL)定位揭示，五种代谢物(C0153b、C0560、C0540、C0916和C0024)在1号染色体25.6 Mb处鉴定出一个主效数量性状位点，与先前报道的基于qPCR的抗菌性状数量性状位点共定位。这五种代谢物各自的相对丰度也定位到次要的，在某些情况下，第三数量性状位点，表明与抑制产气荚膜梭菌相关的代谢物生物合成受寡基因控制。这项工作为高粱抗菌活性的代谢和遗传基础提供了见解，可用于开发基于高粱的饲料添加剂，利用天然化合物改善家禽健康。

一、研究背景与意义

家禽产业正面临由产气荚膜梭菌引起的坏死性肠炎等疾病的严峻挑战，而抗生素耐药性问题加剧了这一困境。高粱作为一种重要的谷物，其籽粒富含酚类等生物活性化合物，具有抗氧化、抗炎和抗菌特性，特别是其高酚类含量（尤其类黄酮）为开发功能性饲料提供了潜力。然而，高粱中的缩合单宁虽能防御病原体，却具有抗营养作用。所幸，单宁的存在与含量由B1/B2（或Tan1/Tan2）基因位点控制，无单宁（即不具色素种皮）的高粱基因型得以存在，既能避免抗营养效应，又能保留其他有益的生物活性。先前研究表明，无单宁高粱可显著降低家禽微生物组中产气荚膜梭菌的浓度，其抗菌活性很可能归因于成熟籽粒中固有的组成型代谢物（或称植物抗毒素）。然而，对于无单宁高粱籽粒中哪些特定代谢物负责其抗菌活性，以及其遗传基础如何，目前缺乏系统性的代谢组学与遗传学关联研究。因此，在《Frontiers in Plant Science》发表的此项研究，旨在通过非靶向代谢组学分析一个无单宁高粱重组自交系群体，鉴定与抑制产气荚膜梭菌相关的关键代谢物，并进行数量性状位点作图，以揭示其代谢与遗传基础，为培育具有高抗菌活性的高粱品种、开发天然饲料添加剂奠定基础。

二、主要关键技术方法

本研究采用以下关键技术路径：1. 植物材料与田间试验：使用由德州农工大学提供的、源自亲本Tx2911（红果皮、高酚含量、抗籽粒霉变）和P850029（白果皮、高赖氨酸、高消化蛋白）杂交产生的189个无单宁高粱重组自交系（RIL）F₆群体及其双亲，于2023年在美国南卡罗来纳州进行田间试验，采用α晶格设计，双重复。2. 抗菌活性表型鉴定：通过两种方法评估抗菌活性：a) 最低抑菌浓度(MIC)分析：使用70%丙酮提取籽粒酚类物质，与产气荚膜梭菌（菌株CP6）共培养，测定抑制生长的最低提取物浓度。b) 体外酶消化结合qPCR分析：模拟消化过程后，与产气荚膜梭菌共发酵，通过针对plc基因的qPCR定量终端细菌浓度，以log₁₀(CFU)值作为抑制指标。3. 非靶向代谢组学分析：使用LC-MS（液相色谱-质谱联用，Waters Xevo G2-XS Q-TOF，正离子模式）对籽粒样本进行代谢物检测。数据用XCMS和RAMClustR处理，并进行注释（置信度等级2b）。4. 数据分析与统计：包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)、差异表达代谢物(DEM)分析、通路富集分析（使用MetaboAnalyst 6.0，以玉米为参考代谢组）、稀疏偏最小二乘(sPLS-DA/sPLS)用于变量（生物标志物）选择。5. 基因分型与数量性状位点作图：对RIL进行基因分型（DArT技术），获得2486个单核苷酸多态性(SNP)。使用R/qtl软件包进行数量性状位点作图，分析所选关键代谢物的遗传位点。

三、研究结果

3.1 重组自交系群体LC-MS结果

在成熟籽粒中共检测到3780种化合物，其中1022种得到计算注释或归属了代谢物类别。大部分代谢物的重复性较低，变异系数较高。

3.2 基于抗菌活性分组和籽粒颜色的代谢谱

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  多变量分析：PCA未显示清晰的抗菌活性分组分离。PLS-DA分析表明，基于qPCR的抗菌活性，高、低活性组能较好区分（曲线下面积AUC>0.80），有1484种代谢物的变量重要性投影(VIP) ≥ 1。而基于MIC的抗菌活性分组区分度较弱（AUC ≤ 0.60），模型性能不佳。果皮颜色（有色 vs. 白色）的PLS-DA则显示出非常清晰的分离（AUC > 0.90）。
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  代谢通路富集：基于qPCR的抗菌活性，高活性组最富集的通路是α-亚麻酸代谢、二萜类生物合成和花生四烯酸代谢。基于MIC的抗菌活性，最富集的通路是类黄酮生物合成。果皮颜色分析中，类黄酮生物合成也是最富集的通路。
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  差异表达代谢物：在qPCR分析中，103种代谢物在高、低抗菌活性组间存在显著差异表达，其中89%在高活性组中下调。在MIC分析中，仅发现16种差异表达代谢物，且其中75%在高活性组中下调。绝大多数与抗菌活性相关的代谢物在高活性品系中丰度较低。

3.3 生物标志物选择和数量性状位点作图用变量选择

变量选择分析（sPLS-DA和sPLS）确定了对区分qPCR抗菌活性分组最重要的13种代谢物。其中，C0153b和C0560被暂定为镰孢菌产物，C0540（羟基肉桂酸，双-阿魏酰胺丁烷）和C0916（甘油磷酸，lysoPA(16:0)）在高抗菌活性品系中丰度更高。

3.4 代谢物注释

对筛选出的13种代谢物进行手动注释，尝试根据精确质量、同位素模式和分类学信息推测结构，置信度为2b。确认C0540和C0916在高抗菌活性组中上调，而C0153b、C0560等下调。

3.5 与最显著代谢物相关的基因座

对13种代谢物进行数量性状位点作图。5种代谢物（C0153b, C0560, C0540, C0916, C0024）在1号染色体~25.6 Mb处鉴定出一个主效数量性状位点，与先前报道的基于qPCR的抗菌性状数量性状位点共定位，且处于强连锁不平衡。其中C0540和C0916（上调）与此数量性状位点完全连锁，而C0024、C0153b和C0560（下调）与此数量性状位点高度连锁。这些代谢物的相对丰度还定位到次要（如2号染色体）或第三数量性状位点，表明代谢物生物合成受寡基因控制。等位效应分析显示，1号染色体上的主效数量性状位点对代谢物丰度有主要影响，其有利等位基因（来自Tx2911）能显著增加上调代谢物（C0540, C0916）的丰度，降低下调代谢物（C0153b, C0560, C0024）的丰度，且它们之间的丰度存在显著相关性。

四、讨论与结论

讨论部分总结：

研究表明，具有不同抗菌活性的重组自交系确实表现出不同的代谢谱。两种抗菌活性检测方法（qPCR和MIC）的结果不一致，反映了它们可能测量了抗菌活性的不同方面。qPCR方法（模拟消化过程）揭示了更广泛的代谢变化，特别是α-亚麻酸代谢、二萜类生物合成和花生四烯酸代谢通路的富集，这些通路与植物防御和信号传导（如茉莉酸途径）密切相关。而MIC方法（丙酮提取物）主要富集类黄酮生物合成通路，这反映了提取方法主要捕获了可溶性的酚类化合物。有趣的是，大多数与抗菌活性相关的代谢物在高抗菌活性重组自交系中丰度反而更低，这表明许多代谢物可能与易感性相关，而少数上调的代谢物（如C0540和C0916）可能是驱动抗性的关键特化代谢物。果皮颜色对代谢谱有巨大影响，但在调整其作为协变量后，仍鉴定出与抗菌活性相关的独立遗传位点。数量性状位点作图结果揭示了1号染色体上一个主效数量性状位点，共同调控多个关键抗菌相关代谢物的丰度，这为分子标记辅助选择提供了潜在靶点。研究中鉴定出的部分代谢物（C0153b, C0560）可能源自田间自然发生的镰孢菌侵染，提示植物-病原互作可能间接影响籽粒的抗菌代谢组。

研究结论翻译：

这项工作为高粱籽粒对产气荚膜梭菌抗菌活性的代谢和遗传基础提供了见解。研究发现，两种抗菌活性检测方法（基于体外消化qPCR和基于酚提取物MIC）关联到不同的代谢谱和富集通路。变量选择确定了13种与qPCR抗菌活性最相关的代谢物，其中仅两种（羟基肉桂酸C0540和甘油磷酸C0916）在高抗菌活性品系中丰度更高。数量性状位点作图揭示了一个主效数量性状位点（1号染色体25.6 Mb），与先前鉴定的qPCR抗菌性状数量性状位点共定位，并共同调控多个关键代谢物的丰度。这些代谢物的生物合成显示为寡基因控制。该研究结果可用于开发遗传标记或生物标志物，以指导旨在提高籽粒生物活性化合物浓度的育种计划，为开发可持续解决方案以应对家禽抗菌耐药性提供了潜力。