将联合使用口服避孕药与全身免疫标志物特征联系起来：皮质醇的作用

《Frontiers in Endocrinology》：Linking combined oral contraceptive use to systemic immune marker profiles: the role of cortisol

　　摘要
引言：联合口服避孕药（COC）的使用与压力、代谢和炎症相关的变化有关。先前的研究表明，代谢变化与皮质醇有关。然而，尽管有炎症参与的迹象，COC使用者中的广泛免疫标志物模式仍不够明确。本研究调查了COC相关的广泛免疫标志物变化及其是否与皮质醇有关。

方法：使用线性模型分析了来自SHIP-TREND-0队列的392名绝经前女性（128名COC使用者）的数据，以估计COC使用者和非使用者之间的差异。免疫标志物包括基本的炎症参数以及一系列细胞因子、生长因子和趋化因子。在结构方程模型中测试了通过皮质醇的间接效应。

结果：与非使用者相比，COC使用者的皮质醇水平更高（β=1.24，p<0.001）。COC使用者的CRP（β=0.97，p<0.001）和血管生长因子（即PDGF-AB/BB和VEGF-A；两者均为β=0.27，p<0.05）也与皮质醇相关（间接效应：0.21至0.30；所有p<0.05）。COC使用者的单核细胞数量较少（β=-0.52，p<0.001），并且趋化因子水平发生变化（即eotaxin水平较低，MIG水平较高；β=-0.58和0.36，所有p<0.001），但这些变化没有发现间接效应。

讨论：COC的使用与广泛的免疫标志物变化有关，这是首次对COC使用者进行的大规模免疫标志物评估之一。通过皮质醇的间接效应表明，这些变化既依赖于皮质醇，也独立于皮质醇。这些发现为COC使用的全身免疫相关性提供了新的证据，并强调了其与内分泌调节的关联途径。

1 引言
在全球范围内，激素避孕（HC）是最常用的避孕方法（1）。在大多数西方国家，包括德国，口服避孕药（OCs）是最常见的HC，全球约有1.5亿女性使用，约占德国育龄女性的38%（1, 2）。OCs要么结合雌激素和孕激素（联合口服避孕药；COCs），要么仅使用孕激素。像所有药物一样，HC可能会导致不良药物反应（ADRs）。大约50%的女性在六到十二个月内停止使用OCs，其中三分之一的女性因ADRs而决定停止使用（3-5）。早期研究表明，不同的HC会报告类似的ADRs，包括月经失调、情绪变化、疼痛和恶心（4-8）。因此，观察性研究通常包括持续使用HC且ADRs较低甚至没有ADRs的女性（“生存者效应”）。尽管如此，已描述了HC使用者中的一些生理标志物变化，这些变化通过部分重叠的途径发生：（a）肝脏效应，表现为结合球蛋白和肝功能标志物的变化；（b）与压力相关的代谢变化；（c）炎症标志物的变化。OCs由肝脏代谢。更具体地说，合成雌激素会刺激肝脏合成性激素结合球蛋白（SHBGs）和皮质类固醇结合球蛋白（CBGs）（9-12）。CBGs是皮质醇的主要载体，其增加的可用性提高了总皮质醇水平（13）。关于游离皮质醇水平的结果相互矛盾，有些研究显示水平不变，有些研究显示水平升高（14, 15），后者也与皮质醇生成增加相符（12）。皮质醇受下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴的调节，在急性应激反应中具有抗炎作用。然而，OCs常常长期使用，据认为会导致HPA轴调节的压力相关变化，包括循环皮质醇水平升高（14）。长期暴露于糖皮质激素可能会促进糖皮质激素受体（GR）的抵抗性（即GR敏感性降低），从而减弱皮质醇的抗炎信号传导，并导致慢性压力与炎症之间的正相关（15）。在大鼠中，雌激素注射通过激活下丘脑中的雌激素受体减弱了HPA轴的负反馈作用（16）。此外，OCs通过抑制黄体生成素和促卵泡生成素的释放减少了内源性卵巢激素的产生。由于内源性雌激素和孕激素通常对HPA轴有抑制作用，因此它们的抑制作用消除了这种抑制（17, 18）。因此，CBG可用性的增加和HPA轴抑制作用的减少可能相互作用，将肝脏类固醇结合的变化与COC使用者的压力-免疫调节变化联系起来。
针对肝脏途径，孕激素会不同程度地降低SHBG的合成，从而产生不同的雄激素性（6）。虽然早期的乙炔雌酮衍生物具有更强的雄激素性，但新一代孕激素旨在最小化这些效应（19, 20）。此外，雌激素与白蛋白合成的减少有关，这可能反映了肝脏资源分配的情况，平衡了结合蛋白的合成和血浆蛋白的产生（21, 22）。此外，皮质醇可以结合白蛋白，而白蛋白与C反应蛋白（CRP）和白细胞水平呈负相关（13, 22, 23）。这些关联提供了另一种肝脏和HPA相关压力-免疫调节之间的联系。与非使用者相比，COC使用者的CRP、白细胞和淋巴细胞水平较高（11, 24, 25）。然而，COC的使用并未改变细胞因子浓度，如IL-6和TNF-α，表明其主要影响是肝脏而非炎症（26, 27）。关于经皮和宫内HC的结果不一致，有些研究显示CRP浓度较高，有些研究显示水平不变（11, 24, 28, 29）。总体而言，关于HC对广泛炎症标志物的影响知之甚少（12, 30）。Francis等人（2016）研究了坦桑尼亚女性中COC使用者和HC非使用者在宫颈阴道细胞因子、趋化因子和生长因子水平上的差异（31）。他们发现COC使用者的IL-1β、IL-6、IL-8、MIP-1β和G-CSF水平较高，但没有考虑HPA轴的共调节作用。然而，炎症与HPA轴激活和皮质醇相关（32, 33）。更准确地说，Noushad等人（2021）将皮质醇、CRP、IL-6和甘油三酯描述为慢性压力的潜在标志物（34）。因此，皮质醇可能是连接这些重叠途径和COC相关变化的宝贵候选因素。事实上，COC的使用与皮质醇水平升高和其他HPA轴相关压力变化有关（12, 14, 27, 35）。一些与COC相关的脂质变化，包括甘油三酯水平升高，可能在统计上与较高的皮质醇水平相关（14, 36）。COC使用者还报告了其他代谢变化，如高密度脂蛋白（HDL）水平升高、氨基酸浓度降低和胰岛素水平升高（11, 14, 24, 36）。从临床角度来看，COC和一些报道的变化（例如，皮质醇、甘油三酯和CRP水平升高，以及白蛋白水平降低）与心血管疾病风险增加有关（30, 37, 38）。相比之下，较高的HDL水平和较低的血小板-淋巴细胞比率（PLR），也与COC的使用有关，但与心血管风险降低相关（39, 40）。然而，潜在的生物学途径仍不甚清楚。关于连接参数（如皮质醇）的证据才刚刚开始出现，关于全面免疫标志物变化的大规模数据也很稀缺。本研究使用了一系列基本的炎症标志物、细胞因子、生长因子和趋化因子来调查COC使用者的广泛炎症变化。基于一个大型的普通人群样本，这是首批提供与COC使用相关的免疫标志物变化的全面概述的研究之一。此外，我们将这些免疫标志物与内分泌-代谢指标结合起来。在更多探索性分析中，我们测试皮质醇是否在统计上解释了COC相关的生理变化，这将现有的代谢发现扩展到了更广泛的免疫背景中。

2 材料与方法
2.1 研究队列
使用了波美拉尼亚健康研究（SHIP-TREND-0）的一个队列的基线数据。SHIP是一项涵盖各种（亚临床）疾病的常见风险和韧性因素及共同特征的一般人群研究。SHIP-TREND-0的参与者是2008年至2012年间在德国东北部西波美拉尼亚随机招募的成年人（N=4,420）。其中2,671名参与者（1,392名女性）的细胞因子、生长因子和趋化因子水平数据可用。对于本研究，我们专注于绝经前女性。排除了男性、孕妇和绝经后女性，以及报告使用可能干扰研究药物的女性（见下文）。最终分析样本包括264名HC非使用者和128名COC使用者（图1）。

2.2 伦理批准
所有SHIP-TREND-0的评估和本研究中的分析均遵循赫尔辛基宣言进行。研究方案得到了德国格赖夫斯瓦尔德大学医学部的伦理委员会的批准（批准编号：BB 39/08）。在参与者参与之前获得了书面知情同意。所有数据均以匿名形式处理，以确保参与者隐私。本研究仅呈现组级统计数据，不报告个别数据。

2.3 数据收集
2.3.1 访谈数据
在结构化、标准化的访谈中收集了基本的社会人口统计数据，包括性别、年龄和教育程度。教育程度按正规教育年数计算，即上学年和职业培训年数（41）。此外，参与者报告了他们的吸烟状况，以便区分从未吸烟、曾经吸烟和当前吸烟者。酒精消费量以过去30天的每天克数（g/d）计算（42）。在女性问卷中，询问了她们是否仍然月经来潮、是否曾经和目前是否使用OC，或者是否怀孕。与先前的研究一样，绝经前女性需要仍然月经来潮、未怀孕且年龄在56岁以下（图1）（14, 36）。此外，还询问了她们最后一次停用OC的日期。该日期与评估日期之间的差异被用作月经周期的第一天。

2.3.2 药物使用
参与者被要求报告过去7天内使用的药物，并携带他们的药物或药物说明书。药物根据解剖治疗化学（ATC）分类进行编码（ATC-Index, 2007）。本研究关注COC对压力和炎症系统的影响，因此排除了使用以下药物的女性：用于全身治疗的皮质类固醇（H02）、用于全身治疗的急性抗感染药物：抗生素（J01）、抗真菌药物（J02）和抗病毒药物（J05）、免疫抑制剂（L04）、非甾体抗炎药和抗风湿药（M01A）以及非避孕目的的性激素（G03）。仅通过女性问卷识别出具体信息不明的参与者（n=48），以及使用其他类型HC而非COC的女性（n=43）也被排除在外。COC的使用定义为报告使用用于全身治疗的联合HC（G03AA或G03AB），或抗雄激素和雌激素（G03HB）。这些制剂都含有具有相似内分泌效应的雌激素-孕激素组合。尽管这些制剂通常不是主要作为避孕药使用，但由于其相似的激素组成和预期的全身效应，它们也被包括在内。由于90.0%的当前HC非使用者报告曾使用过OCs，因此将曾经的HC使用者与从未使用者区分开来。

2.3.3 问卷数据
使用患者健康问卷（PHQ-9）的抑郁模块来评估过去两周的抑郁症状（43, 44）。九个症状在4点量表上评分，较高的总分（范围：0-27）表示更严重的抑郁症状。此外，还使用了多伦多-述情障碍量表（TAS-20）来评估述情障碍，定义为识别或描述情绪的困难（45, 46）。二十个项目在5点量表上评分，较高的总分（范围：20-125）表示更严重的述情障碍。

2.3.4 人体测量
在体检过程中，经过培训的研究护士按照标准操作程序手动测量了参与者的身高、体重、腰围和臀围。所有测量都是在参与者站立状态下进行的，不穿鞋，穿着轻便的衣服。身高使用便携式身高计（Soehnle Industrial Solutions，德国Backnang）测量，精确到1厘米。腰围使用弹性带在肋骨下缘和髂嵴中间水平测量，精确到1厘米。这两个测量值被整合为腰围与身高比率（WHtR），作为体脂分布的近似值。与常用的BMI不同，WHtR与内脏脂肪有更强的相关性（47）。心率、收缩压和舒张压使用数字监测仪（HEM-705CP，Omron Corporation，东京，日本）在右臂上测量，测量前有五分钟的休息时间，每次测量之间有三分钟的休息时间。第二次和第三次测量结果取平均值用于分析。

2.3.5 实验室指标
血液在上午7点到下午1:30之间从肘静脉抽取。样本存储在格赖夫斯瓦尔德大学医学部的综合研究生物库中，温度为-80°C（48）。要求参与者在评估前禁食。记录最后一次进食和摄入热量饮料的时间，用于计算禁食时间。所有实验室测量均按照制造商的说明进行。血清皮质醇使用ADVIA Centaur XP System（Siemens Healthcare Diagnostics，埃施博恩，德国）进行化学发光免疫测定，该测定方法具有较低的交叉反应性。血小板、白细胞和白细胞类型使用Sysmex公司的XT2000、XE 5000或SE9000分析仪测量（Sysmex Deutschland GmbH，诺德施泰特，德国）。注意，测量的是白细胞类型的比例。仅包括淋巴细胞的绝对水平，因为这些细胞被纳入血小板-淋巴细胞比率（PLR）的计算中，而PLR被认为是心代谢健康的一个潜在标志物（25, 49）。使用Dimension Vista 500分析系统（西门子股份公司，德国埃尔朗根）来测量血清中的甘油三酯、总胆固醇（Chol）、高密度脂蛋白（HDL）、低密度脂蛋白（LDL）、高灵敏度C反应蛋白（CRP）、白蛋白、γ-谷氨酰转移酶（GGT）和胆红素的浓度。使用多参数检测方法（HCYTA-60 K-PX48，默克密理博公司，美国马萨诸塞州波士顿）来测量细胞因子、生长因子和趋化因子（下文统称为分析物）。结果使用Luminex系统（Luminex，美国德克萨斯州奥斯汀）记录，具体方法在其他文献中有描述（50）。总体上，检测到了47种分析物。所有细胞因子的检测限已在其他文献中给出（50）。在这项研究中，排除了那些有超过20%浓度缺失数据或每组有效数据点少于50个的分析物（非COC使用者/COC使用者）（补充表1）。未进行数据插补。没有任何分析物数据的女性被排除在分析之外（n=262；图1，表1）。

表1
分析的变量
由于分析物数据缺失而排除的变量

非HCC
COC
非HCC
N
26
41
12
8
15
18
6

年龄 [年]
40.0 [34.0; 45.0]
33.5 [26.8; 41.5]
40.0 [34.5; 44.0]
32.0 [27.0; 37.0]

吸烟情况
从未
98 [37.1]
53 [41.4]
46 [30.5]
29 [33.7]
曾经
71 [26.9]
30 [23.4]
47 [31.1]
30 [34.9]
目前正在使用
95 [36.0]
45 [35.2]
58 [38.4]
27 [31.4]

教育程度
11.0 [11.0; 13.0]
11.0 [11.0; 13.0]
11.0 [11.0; 13.0]
11.0 [11.0; 13.0]

采血时间 [hh:mm]
09:06 [08:21; 10:46]
09:09 [08:18; 10:45]
09:13 [08:23; 10:56]
09:47 [08:17; 10:05]

空腹时间 [hh::mm]
11:29 [03:29; 13:21]
12:41 [10:43; 13:04]
11:14 [03:55; 13:01]
11:38 [02:10; 13:10]

酒精摄入量 [g/d]
2.5 [0.7; 6.0]
2.5 [1.0; 6.5]
2.2 [0.7; 5.9]
3.3 [0.7; 6.6]

腰围身高比（WHtR）
0.5 [0.4; 0.5]
0.4 [0.4; 0.5]
0.5 [0.4; 0.5]
0.4 [0.4; 0.5]

月经周期天数
14.0 [7.0; 23.0]
14.0 [8.0; 21.0]
13.0 [6.0; 21.0]
14.0 [6.0; 20.8]

COC使用情况
未指定
38 [29.7]
21 [24.4]
第二个月经周期
50 [39.1]
第三个月经周期
25 [19.5]
第二十五个月经周期
25 [29.1]
第四个月经周期
15 [11.7]
第七个月经周期
7 [8.1]

皮质醇 [nmol/ml]
265.4 [203.8; 332.2]
512.7 [407.5; 629.1]
252.6 [196.2; 344.6]
464.8 [355.9; 587.9]

CRP [mg/l]
0.9 [0.5; 2.0]
3.0 [1.4; 5.1]
0.9 [0.5; 2.1]
2.4 [1.2; 4.2]

白细胞 [Gpt/l]
5.9 [5.1; 7.1]
6.1 [5.2; 7.1]
6.0 [5.2; 6.8]
5.9 [5.0; 7.2]

中性粒细胞 [%]
59.5 [53.3; 64.7]
59.4 [53.6; 65.9]
59.3 [54.4; 62.9]
58.3 [54.9; 64.1]

单核细胞 [%]
8.0 [7.0; 9.7]
7.2 [6.0; 8.5]
8.2 [6.9; 9.4]
7.3 [6.1; 8.6]

嗜酸性粒细胞 [%]
2.2 [1.4; 3.2]
1.8 [1.2; 2.9]
2.2 [1.4; 3.0]
1.9 [1.2; 3.2]

嗜碱性粒细胞 [%]
0.4 [0.3; 0.6]
0.4 [0.3; 0.5]
0.5 [0.3; 0.6]
0.4 [0.2; 0.6]

淋巴细胞 [%]
29.1 [24.4; 33.7]
30.4 [25.3; 35.1]
28.8 [25.5; 33.3]
30.7 [26.2; 34.7]
淋巴细胞 [Gpt/l]
1.7 [1.4; 2.0]
1.9 [1.6; 2.2]
1.7 [1.4; 2.0]
1.9 [1.5; 2.1]

血小板 [Gpt/l]
241.5 [211.8; 284.0]
251.0 [212.8; 282.0]
257.0 [219.5; 290.5]
248.5 [212.0; 277.0]
PLR
149.7 [119.2; 176.0]
133.1 [107.1; 158.2]
154.0 [123.7; 179.9]
134.7 [112.5; 168.6]

甘油三酯 [mmol/l]
0.9 [0.7; 1.4]
1.2 [1.0; 1.7]
1.0 [0.7; 1.4]
1.3 [0.9; 1.6]

HDL [mmol/l]
1.5 [1.3; 1.8]
1.7 [1.4; 2.0]
1.6 [1.3; 1.8]
1.7 [1.5; 1.9]

LDL [mmol/l]
3.1 [2.6; 3.7]
2.9 [2.3; 3.4]
3.1 [2.5; 3.5]
2.8 [2.3; 3.3]

胆固醇/HDL
3.3 [2.8; 3.9]
3.0 [2.6; 3.6]
3.2 [2.8; 4.0]
2.9 [2.5; 3.5]

白蛋白 [g/l]
40.0 [38.0; 42.0]
38.0 [36.0; 40.0]
38.0 [38.0; 42.0]
37.0 [36.0; 39.0]

GGT [μkatal/l]
0.4 [0.3; 0.5]
0.4 [0.3; 0.5]
0.4 [0.3; 0.5]
0.4 [0.3; 0.4]

胆红素 [μmol/l]
6.7 [5.2; 9.2]
6.0 [4.5; 7.6]
6.5 [5.2; 8.8]
5.7 [4.3; 6.7]

心率 [次/分钟]
75.0 [66.4; 80.5]
74.5 [67.8; 80.5]
73.0 [67.5; 79.5]
75.5 [70.0; 84.5]
收缩压 [mmHg]
112.0 [104.0; 121.5]
112.0 [105.5; 119.5]
111.5 [104.2; 123.0]
111.5 [103.5; 117.5]

PHQ-9
4.0 [2.0; 6.5]
3.0 [1.0; 5.0]
4.0 [2.0; 7.0]
3.0 [2.0; 5.0]

TAS-20
39.0 [34.0; 47.0]
38.0 [33.0; 44.0]
39.0 [35.0; 46.0]
39.0 [32.2; 43.0]

非COC使用者和COC使用者的样本特征，以及因缺少细胞因子、生长因子和趋化因子数据而被排除的女性。
连续数据的中间值[25%百分位数；75%百分位数]和分类数据的样本量 [%]已列出。HC：激素避孕药；COC：复合口服避孕药；WHtR：腰围身高比；CRP：高灵敏度C反应蛋白；PLR：血小板-淋巴细胞比率；HDL：高密度脂蛋白；LDL：低密度脂蛋白；Chol/HDL：总胆固醇-HDL比率；GGT：γ-谷氨酰转移酶；BP：血压；PHQ-9：患者健康问卷的抑郁模块；TAS-20：多伦多Alexithymia量表。

2.4 统计分析
分析使用R 4.5.1进行。描述性数据显示为平均值、第25百分位数和第75百分位数；分类数据显示为绝对频率和百分比。
为了确定非COC使用者（参考组）和COC使用者之间的实验室标志物和临床参数是否存在差异，实施了带有稳健标准误差的加权一般线性模型（GLM）。实验室标志物（皮质醇、CRP、白细胞、白细胞类型比例、淋巴细胞水平、血小板、PLR、甘油三酯、HDL、LDL、Chol-HDL比率、白蛋白、GGT和胆红素）和临床参数（心率、收缩压、PHQ-9、TAS-20）被用作结果变量。经过视觉检查后，移除了极端异常值，并对变量进行了对数转换；所有结果都进行了标准化。所有分析都调整了年龄、月经周期天数、吸烟状况（从未/曾经/目前）、WHtR和酒精摄入量。涉及实验室标志物的分析进一步调整了空腹时间和采血时间（非线性）。非线性关联使用三个自然样条函数进行建模。为了平衡组间协变量分布，从倾向得分中得出估计平均处理效应（ATE）的逆概率权重。为了考虑多重检验，使用Bonferroni方法调整了显著性水平（padj<0.05）。对于COC使用者和非COC使用者之间存在差异的结果，使用带有稳健标准误差的ATE加权结构方程模型计算了通过皮质醇的间接效应（SEM；lavaan包）。SEM仅限于在主要模型中具有名义显著性的分析物（p<0.05），以减少维度同时保留潜在的信息关联。这些分析被视为探索性的，未对中介结果应用多重检验校正。此外，由于横断面设计，间接效应不表示时间顺序或因果关系。它们代表观察到的关联的基于模型的分解，作为统计关联的度量。所有SEM都类似于GLM进行了调整。
为了关注免疫标志物，使用细胞因子、生长因子和趋化因子作为结果变量，在带有稳健标准误差的ATE加权GLM中重复进行了分析，并调整了年龄、吸烟状况、WHtR、酒精摄入量、采血时间、样本组和存储时间。在排除了缺失率较高或每组样本量较低的分析物后（补充表1），所有分析物都进行了对数转换和标准化。然而，敏感性分析仅基于有效值进行。为了考虑多重检验，使用Bonferroni方法调整了显著性水平（padj<0.05）。最后，使用上述SEM计算了与COC使用相关的所有分析物的间接效应（未调整水平，p<0.05）。
为了验证单个分析的结果，进行了主成分（PC）分析（补充表2）。PC是从ComBat协调的细胞因子水平计算得出的，使用经验贝叶斯方法调整了样本组、批次和存储时间（51）。使用非线性迭代最小二乘算法处理缺失值。具有大于1.0的特征值和大于5%解释方差的PC被用作带有稳健标准误差的ATE加权GLM的结果变量，以估计非COC使用者（参考组）和COC使用者之间的差异。为了了解生物学相关性，计算了PC与协变量以及基本实验室和临床参数之间的皮尔逊相关性。

3 结果
最终样本包括392名女性（128名COC使用者）。描述性数据显示，COC使用者比非COC使用者更年轻，吸烟较少，空腹时间较短（表1）。假设80%的统计功效和修正后的显著性阈值padj<0.05，所有COC使用者和非COC使用者之间的对比的最小可检测效应大小为f2≥0.04。

3.1 肝脏、代谢和基本炎症标志物
主要分析显示，大多数实验室参数在非COC使用者和COC使用者之间存在差异（表2）。对于皮质醇（β=1.24 [1.08; 1.40]，f2=0.60，padj=2.97e-40）、CRP（β=0.97 [0.78; 1.16]，f2=0.27，padj=2.53e-20）和白蛋白（β=-0.82 [-1.02; -0.61]，f2=0.16，padj=7.41e-13），效应中等至较大。此外，COC使用者的甘油三酯水平（β=0.69 [0.47; 0.90]，f2=0.10，padj=4.25e-8）和HDL水平（β=0.37 [0.14; 0.60]，f2=0.03，padj=0.044）较高。COC使用者的胆红素水平较低（β=-0.42 [-0.61; -0.23]，f2=0.05，padj=0.001），支持了肝脏效应。此外，COC使用者的单核细胞比例较低（β=-0.52 [-0.74; -0.30]，f2=0.06，padj=8.58e-5）和绝对淋巴细胞水平较高（β=0.41 [0.20; 0.33]，f2=0.04，padj=0.004），可能支持免疫效应。

表2
结果
β
95%-CI
p值
padj
皮质醇
1.24
[1.08; 1.40]
0.60
1.35e-4
12.97e-40
CRP
0.97
[0.78; 1.16]
0.27
1.15e-2
12然而，总皮质醇水平反映的是压力调节系统的广泛变化，而不仅仅是生物活性糖皮质激素信号的变动，它仅代表了一种可能的机制。4.1 肝脏、代谢和基础炎症标志物：皮质醇水平的升高反映了HPA轴活动的改变，这是本研究中的一个关键关联，并被作为观察到的炎症和代谢特征变化的潜在统计解释（14, 35, 36）。长期使用避孕药（COC）被认为会像慢性压力一样持续增加皮质醇暴露（14）。持续的糖皮质激素信号传导已被证明会增强GR抵抗性，削弱抗炎控制，从而促进更高的炎症水平（15）。雌激素会刺激肝脏中的CBG合成，导致联合使用避孕药的患者的总皮质醇水平升高（9–11）。然而，其他研究也显示自由皮质醇水平升高，支持皮质醇产生的额外增加（12, 35）。已经证明，COC使用者的皮质醇水平升高与脂质和代谢物谱的变化有关（14, 36）。在我们的数据中，这种间接效应也体现在CRP、淋巴细胞和生长因子上。据报道，雌激素会改变肝脏代谢，增加结合蛋白如SHBG和CBG的合成（9–11）。支持肝脏代谢改变的事实是，我们的数据显示COC使用者的白蛋白和胆红素水平较低。尽管先前的研究已将白蛋白水平降低与雌激素联系起来，但关于COC使用者白蛋白和胆红素的研究较少（21, 22, 53）。COC使用与血浆体积增加和毛细血管通透性增强有关，这可能导致循环中的肝标志物轻微下降（54）。此外，雌激素通过上调胆汁转运蛋白来减少白蛋白mRNA的表达并增加胆红素的排泄（12, 21）。虽然可以推断COC使用者的肝脏代谢与HPA轴活动之间存在关联（例如CBG合成增加），但皮质醇并不能解释我们样本中的白蛋白变化。与先前的发现一致，我们复制了较低的PLR值（25, 55）。PLR已被描述为心血管疾病（CVD）的预后标志物（40）。然而，鉴于效应量较小，PLR的差异在我们的研究中可能具有有限的临床意义。同样，其他临床标志物（如心率、血压、抑郁或情感冷漠）的影响在我们的数据中也较为有限。COC使用者在一般人群样本中通常报告较少的心理和身体症状，这可能受到幸存者效应的强烈影响（14, 56）。样本中较低的抑郁症状和情感冷漠水平可能也受到这种幸存者效应的影响。然而，这些效应可能仅限于静息状态下的评估。在对社会压力的反应中，COC使用者报告的主观压力更高，情绪更消极（57）。有趣的是，我们数据中所有与基础临床指标的关联都与较高的总皮质醇水平有关。与这一点一致，抑郁和CVD都与HPA轴活动的改变有关（58–61）。尽管如此，本研究中的间接效应仅反映了统计关联，并不一定反映了生物学途径。关注基础免疫标志物，我们的研究发现COC使用者的CRP和淋巴细胞水平高于非使用者，这与先前的发现一致（11, 25）。CRP和淋巴细胞水平都与皮质醇相关。皮质醇和CRP都与慢性压力和HPA轴调节有关，表明在这种情况下可能存在共同调节（34）。然而，CRP是由肝细胞产生的，因此也反映了肝脏代谢，这一点通过其与白蛋白的负相关得到证实（23）。在我们的研究中，测量的是总血清皮质醇水平，这些水平受CBG水平的影响，而CBG也是由肝脏合成的。因此，皮质醇和CRP之间的关联可能反映了共同的肝脏调节或与压力相关的生理途径。在先前的研究中，COC使用与细胞因子水平（如TNF-α或IL-6）的变化无关，表明COC使用者的CRP升高主要由其他因素驱动（26, 27）。与这一发现一致，我们的数据仅发现COC使用者的IL-18水平升高，而没有其他细胞因子的变化。总体而言，我们无法区分观察到的关联是反映了肝脏效应、压力相关机制还是两者的结合。对于淋巴细胞，通过皮质醇的间接效应是负面的，表明存在抑制途径。COC使用会增加淋巴细胞水平，而皮质醇则具有相反的免疫抑制作用（62）。因此，总的正面关联可能是一个主要的、与皮质醇无关的机制，皮质醇部分抵消了这种增加。与绝对淋巴细胞水平相反，COC使用者和非使用者之间的白细胞水平没有差异。然而，在白细胞组成方面，COC使用者的单核细胞比例较低。单核细胞产生并释放多种细胞因子，如TNF-α和一些白细胞介素，这些受雌激素的影响而减少（25）。尽管如此，单核细胞比例的降低与皮质醇无关。此外，我们的数据中没有发现COC使用者和非使用者之间的TNF-α或白细胞介素水平存在差异。4.2 细胞因子、生长因子和趋化因子：本研究对COC使用者的细胞因子、生长因子和趋化因子的广泛调查代表了一种新的研究方法（12, 30）。一项针对坦桑尼亚女性的早期研究报告称，COC使用者的宫颈阴道IL-6、IL-8、MIP-1β和G-CSF水平高于非使用者（31）。这些结果在我们的样本中未能得到复制，这可能支持组织特异性效应。与此一致，先前对单个血清参数（如IL-6或TNF-α）的研究没有发现与COC使用有关的关联（26, 27）。在社会压力测试后，不同研究表明COC使用者和非使用者的唾液皮质醇和IL-6、TNF-α水平的变化之间存在关联（57）。这些结果可能表明至少在压力下COC使用者的HPA轴和炎症有改变的共调节。然而，我们的数据关注的是基础血浆水平，目前尚不清楚这些差异是压力反应特有的还是也在静息状态下显著存在。尽管如此，我们的分析表明COC使用者的某些分析物水平发生了变化。在单一分析物水平上，eotaxin和MIG是最显著的。Eotaxin（CCL11）由淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞合成（63）。它在过敏反应中是一个重要的趋化因子，负责招募、激活和促进嗜酸性粒细胞的存活（63, 64）。此外，较高水平的eotaxin与衰老（如CVD）和认知表现下降有关（50, 65, 66）。eotaxin能够穿过血脑屏障，较高水平的eotaxin与神经发生减少和痴呆风险增加有关（65, 67）。在我们的研究中，COC使用者的eotaxin水平低于非使用者。据报道皮质醇可以降低eotaxin水平（65），这与我们COC使用者观察到的较高皮质醇水平一致。然而，我们的研究没有观察到皮质醇对eotaxin水平的间接影响。MIG（CXCL9）由单核细胞、内皮细胞、成纤维细胞和巨噬细胞产生，参与T细胞的发育、增殖和招募（68）。在我们的研究中，COC使用者的INF-γ诱导的MIG水平高于非使用者。相比之下，IP-10（CXCL10）由相同的细胞产生，也由INF-γ诱导，但其水平在COC使用者中较低（68）。此外，COC使用者的IL-18水平较高，IL-18是一种促炎细胞因子，可以诱导INF-γ和T辅助细胞1的分化（69, 70）。MIG和IP-10具有抗血管生成作用，并被认为可以抑制微血管内皮细胞，从而阻碍血液与周围组织之间的物质交换（71）。此外，这两种趋化因子都与CVD风险增加有关，老年参与者的水平较高（72）。同样，IL-18与自身免疫疾病（如类风湿性关节炎和炎症性肠病）以及代谢综合征和CVD有关（70）。与较低的IP-10水平一致，COC使用者的PDGF-AA和PDGF-AB/BB水平较高，这些因子参与组织修复；VEGF-A的水平也较高，参与血管生成（73, 74）。这些生长因子主要由血小板产生，具有促血管生成作用（73, 74）。在这三项分析物上，它们在PC2上的负荷值均为负，而PC2与较低的血小板水平相关。尽管实验研究常报告糖皮质激素介导的VEGF和PDGF表达的抑制，但我们的数据显示COC使用者的皮质醇水平较高，同时VEGF-A、PDGF-AA和PDGF-AB/BB的血浆水平也升高（75）。尽管如此，我们的模型仍显示了与皮质醇的统计关联。COC使用的复杂系统环境可以解释这种明显的差异。在COC使用的系统激素环境中，升高的皮质醇可能反映了更广泛的内分泌-代谢变化。因此，间接效应代表的是统计关联，而不一定是因果刺激效应。总体而言，我们的结果复制了先前研究，这些研究未发现非使用者和COC使用者之间的血浆循环细胞因子（如IL-6和TNF-α）存在基础差异。然而，我们确实发现了其他先前未研究的标志物差异，如生长因子（如PDGF-AB/BB和VEGF-A）和趋化因子（如eotaxin和MIG）。除了基础水平之外，来自社会压力测试范式的发现表明，COC使用不仅可能影响内分泌和炎症活动的幅度，还可能影响皮质醇与特定免疫标志物之间的耦合模式（57）。Mengelkoch等人（2023）发现，COC使用者与自然周期女性的压力诱导唾液皮质醇变化与IL-6和TNF-α的关联不同（57）。这些结果可能表明皮质醇-免疫关系是标志物特异性的，并可能受到COC使用的影响，这有助于解释为什么皮质醇与我们研究中某些但不是所有免疫标志物的差异有关。然而，尚不清楚这种差异性耦合是否也适用于静息状态。此外，免疫标志物在生物学调控上存在显著差异，包括细胞来源、时间响应特征和糖皮质激素敏感性。因此，皮质醇不太可能与这里测试的所有参数都统一相关。4.3 强点和局限性：所呈现的结果基于COC使用者和非使用者的总体人群样本。由于经历严重不良反应（ADRs）的女性往往在使用的最初几个月内决定停止使用，基于人群的研究中可能存在幸存者效应（3, 5）。尽管如此，我们的研究仍然观察到了COC使用者的代谢、肝脏和炎症变化。如果这些变化伴随着更严重的主观ADRs，那么在决定停止使用的女性中，差异将会更大。此外，COC使用者之间的生物变化差异可能也有所不同。因此，Piltonen等人（2012）报告了COC使用者CRP变化的较大方差（11）。我们的研究集中在COC使用者上。由于使用者数量非常少，没有研究其他类型的避孕药，例如仅含孕激素的药片或宫内避孕器。尽管Morin-Papunen等人（2008）发现COC使用者存在心理变化，但Piltonen等人（2012）证明联合使用避孕药的变化与给药途径无关（11, 24）。这些先前的发现表明，雌激素成分对生物变化比给药途径更为重要。此外，由于子组样本量小，我们没有根据所用孕激素类型对COC使用者进行分层。我们的研究通过检查广泛的免疫标志物扩展了关于COC使用者免疫标志物变化的现有文献。因此，我们的首要任务是依靠更大的样本量产生可靠的结果。尽管如此，未来的研究应在其他类型的避孕药中复制我们的发现，并区分不同类型的孕激素。此外，我们的分析没有调整避孕药使用的时间。在访谈中评估了使用避孕药的总时间。然而，这个变量没有区分COC使用和仅含孕激素的药片。同样，我们无法解释处方实践的差异。我们的样本主要包含中年女性，并于2008年招募。自那时以来，女性的处方政策和避孕偏好可能已经改变。例如，不建议有代谢问题（如高血压、肥胖、糖尿病或血脂异常）的女性使用避孕药（30, 76, 77）。尽管我们的分析基于大型总体人群样本，并采用了稳健的统计方法，但所有结果都是横断面的，不能被解释为因果关系。更具体地说，扫描电子显微镜（SEM）模型用于描述统计上可解释的比例，其目的并非表示按时间顺序排列的生物途径，也不应被这样解读。未来需要采用实验性或纵向设计的研究来验证我们的发现。此外，我们的分析使用了总血清皮质醇水平，而非游离血清或唾液皮质醇水平；同时，分析样本中也缺乏连续血糖（CBG）数据。因此，所报告的结果可能并不完全反映具有生物学活性的糖皮质激素信号传导，而可能是通过糖皮质激素系统的改变产生的潜在效应。

4.4 结论
总之，本研究揭示了使用避孕药（COC）的人群中肝脏、代谢和免疫系统的广泛变化，扩展了以往的研究，发现了多种细胞因子、生长因子和趋化因子之间的显著差异。在炎症标志物中，C反应蛋白（CRP）、淋巴细胞和趋化因子呈现最强的关联。皮质醇水平的升高在统计学上解释了其中的一些变化，表明在使用避孕药的人群中，肝脏功能与应激-免疫调节机制可能存在关联。然而，这些间接效应仅代表统计相关性，并非生物学机制，这强调了未来研究 necessary to clarify the physiological pathways underlying COC-related alterations 以改进预测和临床咨询的必要性。未来研究应结合游离血浆或唾液皮质醇水平以及连续血糖测量来验证这些发现，从而更深入地理解具有生物学活性的糖皮质激素的影响。