高脂肪饮食引起的肥胖会损害兔子的内皮依赖性血管舒张功能，这与MLCK（myosin轻链激酶）上调有关；而通过使用ML-7可以在体外部分改善这一状况

《Frontiers in Cardiovascular Medicine》：High-fat diet-induced obesity impairs endothelium-dependent relaxation in rabbits: association with MLCK upregulation and partial ex vivo improvement by ML-7

　　**摘要**
**目的**：肥胖是心血管疾病和死亡率升高的独立危险因素，但其潜在机制仍不完全清楚。内皮依赖性松弛功能受损是血管损伤的早期表现。本研究探讨了高脂饮食（HFD）引起的肥胖对内皮依赖性松弛功能的影响，并探索了肌球蛋白轻链激酶（MLCK）信号通路在兔模型中的作用。
**方法**：45只雄性新西兰白兔被随机分为对照组（正常饮食）、HFD组以及ML-7组（HFD加MLCK抑制剂ML-7，1 mg/kg/天，n=15/组）。8周后，通过流介导的扩张（FMD）技术评估髂动脉的内皮功能，并测定血清脂质和空腹血糖水平。在离体条件下，使用乙酰胆碱（ACh，0.001–10 μmol/L）和硝普钠（SNP）的累积浓度评估内皮依赖性和非依赖性松弛反应。通过Western blotting技术分析主动脉环中MLCK、内皮一氧化氮合酶（eNOS）和磷酸化肌球蛋白轻链（p-MLC）的蛋白表达水平。
**结果**：HFD组的兔子出现肥胖（体重增加27.85% compared to对照组）、血脂异常（总胆固醇TC、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C和氧化低密度脂蛋白ox-LDL升高；所有P<0.001）、高血糖（P<0.05），以及明显的内皮功能障碍，表现为FMD减弱（P<0.05）和ACh诱导的主动脉环松弛反应降低。这伴随着主动脉中MLCK表达增加（P<0.001）和p-MLC/MLC比值升高（P<0.001），而eNOS表达和动脉NO水平保持不变。ML-7治疗显著降低了MLCK表达和MLC磷酸化。在高浓度（1和10 μmol/L）下，ML-7部分改善了主动脉环的ACh诱导松弛反应（P<0.05 vs HFD组），但未能增强体内的FMD。所有组中SNP诱导的非依赖性松弛反应相似。
**结论**：肥胖引起的内皮功能障碍与内脏脂肪积累、血脂异常和MLCK上调有关。ML-7抑制MLCK可部分恢复离体条件下的内皮依赖性松弛反应，但未能改善体内FMD。这种分离现象突显了血管功能障碍的复杂性，提示在临床前研究中仅用FMD作为内皮健康的替代指标需谨慎。

**1. 引言**
肥胖是一种慢性疾病，严重影响身心健康，降低生活质量（1），并带来巨大的医疗成本（2）。在中国，所有年龄段的肥胖患病率持续上升（3）；成人肥胖率从2004年的3.1%增加到2015–2019年的16.4%（4）。亚洲儿童，尤其是中国儿童，体脂百分比较高且存在中心性肥胖（5, 6），这与动脉粥样硬化（AS）的风险增加密切相关（7）。2021年全球疾病负担研究显示中国在肥胖绝对负担方面排名第一（8）。这些统计数据凸显了肥胖的严重性。肥胖加剧炎症和氧化应激，导致心血管疾病（CVDs）等严重并发症（9–13）。动脉粥样硬化是大多数CVD的病理基础，通常在儿童时期开始，通过长期复杂的过程发展；儿童肥胖会加速AS的进展，导致早发性CVD（14, 15）。因此，检测其初始阶段——内皮功能障碍（ED）至关重要（16）。ED包括内皮依赖性松弛功能受损、屏障功能下降和血管炎症。非侵入性流介导的扩张（FMD）技术具有预测内皮功能的潜力，但仍需进一步验证（17）。内皮功能障碍受多种因素影响，包括遗传、高血压、高脂血症、糖尿病、肥胖、衰老、吸烟和缺乏运动（18），但其潜在机制尚未完全阐明。我们之前的研究发现，肌球蛋白轻链激酶（MLCK）表达上调及其后续的肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化会加重与AS相关的内皮功能障碍；值得注意的是，MLCK抑制剂ML-7有效缓解了这种功能障碍（19）。此外，肥胖引起的内皮功能障碍与一氧化氮（NO）生物利用度降低和内皮一氧化氮合酶（eNOS）解偶联密切相关（20–22）。在肥胖小鼠中，eNOS解偶联导致NO生成减少，从而引起主动脉功能障碍（22）。本研究旨在探讨高脂饮食（HFD）引起的肥胖兔子中血管内皮依赖性松弛功能的变化及其与血脂和血糖等风险因素的关系，特别关注与MLCK表达/活性、eNOS表达/活性和NO水平的关联。这些研究有助于阐明肥胖引起的内皮功能障碍机制，并比较非侵入性FMD与离体主动脉环测试的结果，以更好地理解这两种评估方法之间的关系。

**2. 材料与方法**
**2.1 动物实验程序**
经过2周的适应期后，45只雄性新西兰白兔（3个月大，体重2.7（2.5, 2.8）公斤；南京Laifu动物繁殖中心；SCXK(Su)2019-0005）使用计算机生成的随机数表随机分为三组（每组15只），并在相同条件下饲养8周。HFD组每天通过口服给予高脂饮食（含0.5%胆固醇、5%猪油、5%大豆油和89.5%标准饲料）及超纯水。ML-7组除了高脂饮食外，还每日口服ML-7（1 mg/kg；DC Chemicals，中国；DC2052）。对照组每天通过口服给予标准饲料和超纯水。每天上午9:00至11:00使用硅胶导管进行口腔喂食；所有组均采用相同方法以确保不受压力影响。8周后，对所有动物实施安乐死以采集组织样本。所有程序均获得安徽省疾病预防控制中心伦理委员会的批准（批准号2023006）。主要评估指标是内皮依赖性松弛功能，通过ACh诱导的主动脉环松弛反应来评估。次要评估指标包括FMD、Oil Red O（ORO）染色、苏木精-伊红（HE）染色、蛋白表达（MLCK、p-MLC、MLC和eNOS）、动脉NO含量、血清参数（血脂谱、空腹血糖（Glu）和肾周脂肪组织（PRAT）。
**2.2 终末程序：超声评估、麻醉和安乐死**
在进行左外髂动脉的流介导扩张非侵入性超声评估后（按2.9节描述），立即进行麻醉。通过右耳缘静脉缓慢注射3%戊巴比妥钠溶液（30 mg/kg）。通过角膜反射和足趾 pinch 反射丧失确认麻醉平面。在动物处于稳定深度麻醉状态时，使用消毒电动剪去除颈部毛发，并再次消毒手术部位。沿颈部中线做约6厘米长的纵向切口。使用钝头止血钳逐层分离皮下脂肪和浅层筋膜，暴露 platysma 和胸锁乳突肌。用显微外科剪刀沿肌肉纤维方向分离肌肉层，暴露气管和两侧颈动脉（注意保持血管鞘的完整性）。然后通过穿刺右侧颈动脉缓慢收集全血至抗凝管中。在动物仍处于深度麻醉状态时，通过相同静脉途径注射过量戊巴比妥钠（150 mg/kg）实施安乐死。死亡通过呼吸和心跳永久停止以及瞳孔固定且对强光无反应来确认。
**2.3 组织采集与处理**
安乐死后，通过开胸术快速分离胸主动脉，置于4°C Krebs溶液中（保持在冰面上），并持续通入95% O?和5% CO?混合气体。使用眼科器械小心去除主动脉周围的脂肪和结缔组织。切除6–8毫米长的主动脉环段用于离体实验，剩余组织用于后续分析，包括ORO染色和石蜡切片。
**2.4 血脂谱和血糖检测**
从新西兰白兔的耳静脉采集血清。样品在室温下静置2小时凝固后，离心（3,500 × g，15分钟，4°C）以分离血清。上清液分装至无菌试管中，用铝箔包裹以防光照，储存于-80°C以防冻融降解。使用商业ELISA试剂盒测定Glu和血脂谱，包括总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和极低密度脂蛋白（VLDL）。Glu试剂盒（JL-T1253）、TC试剂盒（JL-T1371）、TG试剂盒（JL-T0853）、LDL-C试剂盒（JL-T0807）、HDL-C试剂盒（JL17060）和VLDL试剂盒（JL-33888）购自上海江莱生物技术有限公司；ox-LDL试剂盒（JM-09021R1）购自江苏精梅生物技术有限公司。
**2.5 ORO染色**
将主动脉组织切碎，并用ORO溶液染色（制备方法：将0.25克ORO溶解在50毫升60%异丙醇中，然后用蒸馏水按3:2比例稀释后染色20分钟）。染色后用60%异丙醇洗去未结合的染料。通过影像分析定性评估脂肪在主动脉中的分布情况。
**2.6 HE染色**
将胸主动脉标本切成5毫米厚的切片，固定在4%甲醛中过夜，通过乙醇梯度脱水，然后包埋在石蜡中。切片在光学显微镜（Leica，Wetzlar，德国）下进行HE染色以观察动脉壁结构。
**2.7 Western blotting (WB)**
主动脉组织先用Tris缓冲液冲洗三次，然后使用预冷的组织免疫沉淀缓冲液裂解，接着在4°C下以18,800 × g离心30分钟。使用商业试剂盒（Elabscience，E-BC-K318-M）测定总蛋白浓度，并构建标准曲线。等量的蛋白样品通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，然后转移到聚偏二氟乙烯膜上，在室温下用含有0.1% Tween-20的5%无脂Tris缓冲液封闭2小时。膜与以下一级抗体孵育：MLCK（1:1,000，Sigma，M7905）、p-MLC（磷酸化肌球蛋白轻链）（S20，1:5,000，Abcam，ab2480）、MLC（1:1,000，Santa Cruz，sc-365243/sc-293136）、eNOS（1:1,000，Immunoway，YT3174）和β-actin（1:10,000，Santa Cruz，sc-47778）。
**2.8 兔动脉壁中NO的检测**
处理后的动脉组织匀浆并离心，收集上清液并冷藏备用分析。使用商业试剂盒（Elabscience，E-BC-K035-M）测定动脉壁中的总NO浓度。
**2.9 左外髂动脉的非侵入性超声评估**
剃除兔子腹部和左侧腹股沟区域的毛发后，使用经皮超声评估左外髂动脉的FMD。在左侧腹股沟处涂抹超声凝胶，使用GE Vivid E9（USA）超声系统（9L8 MHz探头）定位左common髂动脉的分叉并跟踪外髂动脉，获取垂直于动脉壁的纵向图像。测量外髂动脉的基线舒张期直径（D0）。然后在外侧后肢将血压 cuff充压至240 mmHg维持5分钟，随后立即放气测量最大舒张期直径（D1）。重复三次测量，计算每只兔子的平均值。波动系数>15%的测量结果将被剔除并重新进行。FMD（%）定义为 (D1?D0)/D0 × 100% 以评估内皮依赖性扩张（19）。超声操作者对组别分配信息不知情（见2.12节）。
**2.10 离体动脉环松弛功能的分析**
保留有完整内皮的兔胸主动脉环。将动脉环悬挂在37°C Krebs溶液中（持续通入95% O?和5% CO?），使用BL-420 F系统（成都泰盟科技有限公司）记录张力。在2克静息张力下平衡45分钟后，用80 mM氯化钾预激活动脉环以评估其功能完整性并增强收缩反应，随后用1 μmol/L苯肾上腺素预收缩。达到稳定收缩后，加入不同浓度的ACh或硝普钠（SNP；0.001、0.01、0.1、1和10 μmol/L）。松弛反应表示为预收缩幅度的百分比。
**2.11 数据分析**
数据用SPSS 25.0软件分析，并用GraphPad Prism软件绘图。WB条带强度在Fiji（ImageJ）中量化，表示为目标蛋白/内参蛋白比值。分类数据以n（%）表示，并用卡方检验进行比较。连续数据首先进行正态性（Shapiro–Wilk检验）和方差齐性（Levene's检验）测试。数据以正态分布变量的均值±标准差（mean ± SD）或非正态分布变量的中位数（P25, P75）的形式呈现。组间比较：对于正态分布的数据，使用单向方差分析（one-way ANOVA）来比较三个组之间的差异。当总体F检验显著时（P < 0.05），使用LSD检验（当方差相等时）或Tamhane的T2检验（当方差不等时）进行事后成对比较。对于非正态分布的数据，使用Kruskal-Wallis检验，然后在总体检验显著时使用Dunn的事后检验进行成对比较。

具体终点及其统计检验：
单向方差分析（one-way ANOVA）：PRAT重量、ox-LDL、Glu、FMD、蛋白质表达（MLCK、p-MLC/MLC、eNOS）、NO水平以及每个单独浓度下的松弛率（所有ACh浓度和所有SNP浓度，除了0.1 μmol/L）。
Kruskal-Wallis检验：体重、TC、TG、HDL-C、VLDL、LDL-C以及0.1 μmol/L SNP下的松弛率。
用于剂量-反应曲线的双向重复测量方差分析（two-way repeated-measures ANOVA）：对于ACh诱导的松弛（0.001–10 μmol/L）和SNP诱导的松弛（排除0.1 μmol/L），使用双向重复测量方差分析，其中组（Group）作为组间因素，浓度（Concentration）作为组内因素。使用Mauchly检验来评估球形性；当违反球形性假设时，应用Greenhouse-Geisser校正。评估主要效应（Group、Concentration）和Group × Concentration的交互作用。当检测到显著交互作用时，使用上述单向方差分析进一步分析每个浓度下的简单效应。

相关性分析：鉴于大多数变量呈现非正态分布，使用Spearman等级相关系数（ρ）来评估代谢参数和内皮依赖性松弛率之间的关系。对于多重比较（9个代谢参数×5个血管终点），应用Bonferroni校正（显著性阈值：P < 0.00111）。

2.12 掩蔽
组分配由一个未参与实验的独立研究者完成。ML-7管理员知道分配结果，但没有参与数据收集或分析。
针对特定结果的掩盖：
FMD：由一名盲法操作的技术人员进行超声检查；由一名盲法分析人员计算FMD。
血管环：盲法研究者使用编码文件执行所有程序；解码前完成分析。
WB：由盲法研究者进行实验；带量化由另一名盲法研究者使用编码图像完成。
生化检测：实验室工作人员在不知道分配结果的情况下处理编码样本。一名盲法统计师进行所有分析；最终数据验证后破除编码。

3 结果
3.1 成功建立高脂肪饮食（HFD）诱导的肥胖模型
初始体重在各组之间没有显著差异。从第2周开始，与对照组相比，HFD组和ML-7组的体重显著增加（P ≤ 0.001），两组之间没有差异。这种趋势一直持续到实验结束。到第8周时，与对照组相比，HFD组的体重增加了27.85%（>25%），符合肥胖模型的标准。

3.2 PRAT沉积和ML-7干预效果有限的肥胖兔子的血脂异常
与对照组相比，HFD组和ML-7组的PRAT均显著增加，两组之间没有显著差异（图1A）。喂养8周后，HFD组和ML-7组的TC、LDL-C和ox-LDL水平显著高于对照组，其中ML-7组的ox-LDL水平高于HFD组（P < 0.001）。HFD组的Glu水平显著升高，而ML-7给药显著降低了这些水平（表1）。结果表明，HFD喂养的兔子出现了明显的内脏脂肪沉积、血脂异常（TC、LDL-C和ox-LDL升高）和高血糖，这增加了动脉粥样硬化（AS）和心血管疾病的风险。然而，尽管ML-7缓解了高血糖，但并未改善其余的代谢参数。

图1 HFD和ML-7对PRAT积累和主动脉形态的影响。（A）每组的肾周脂肪组织（PRAT）重量。（B）主动脉弓的代表性Oil Red 0染色显示脂质沉积（红色）。刻度尺=1 cm。（C）主动脉切片的代表性H&E染色显示结构变化。刻度尺=50 pm。数据以均值±标准差（PRAT重量每组n=15；Oil Red 0染色每组n=9；HE和Eosin染色每组n=3）呈现。统计分析：单向方差分析，随后进行LSD事后检验。*P < 0.05 vs. 对照组。

表1 参数
HFD（n=10） ML-7（n=10） 对照组（n=10）
H/FP Tc（mmol/L） 8.0（3.7, 21.5）* 13.2（10.2, 17.5）* 2.2（1.5, 3.7）13.9 < 0.001
TG（mmol/L） 57.0（38.5, 129.0）64.3（34.5, 187.4）41.2（33.1, 70.8）1.9 0.378
HDL-C（mmol/L） 1.6（1.1, 3.6）1.8（1.0, 5.3）1.2（1.0, 2.0）1.9 0.378
LDL-C（mmol/L） 7.2（3.1, 12.9）* 13.9（6.9, 22.6）* 1.7（0.9, 2.8）16.2 < 0.001
VLDL（mmol/L） 1.5（0.7, 5.4）1.4（0.6, 3.4）1.1（0.5, 3.1）0.6 0.735
ox-LDL（mmol/L） 71.6 ± 5.7* 95.6 ± 3.2*? 43.1 ± 3.43 85.9 < 0.001
空腹血糖（mmol/L） 1.9 ± 0.5* 1.5 ± 0.4? 1.5 ± 0.3 3.4 0.047
各组血液脂质和血糖水平的比较。数据以正态分布变量的均值±标准差（ox-LDL和空腹血糖）或非正态分布变量的中位数（第25和第75百分位数）（TC、TG、HDL-C、LDL-C和VLDL）呈现。统计分析：对于正态分布的数据，使用单向方差分析；当总体F检验显著时（P < 0.05），使用LSD进行事后成对比较。对于非正态分布的数据，使用Kruskal-Wallis检验；当总体检验显著时，使用带有Bonferroni校正的Dunn检验进行事后成对比较。

TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；VLDL，极低密度脂蛋白；ox-LDL，氧化低密度脂蛋白。新西兰白兔的正常参考范围[基于Wu等人，2020（25）]：TC，0.70–2.86 mmol/L；TG，0.37–2.05 mmol/L；LDL-C，0.13–1.77 mmol/L；HDL-C，0.39–0.93 mmol/L。本研究中的对照组值在这些范围内。请注意，参考范围可能因品系、年龄和饮食而异；本研究中的对照组值也在这些范围内。*P < 0.05 vs. 对照组。?P < 0.05 vs. HFD组。

3.3 各组主动脉ORO染色和HE染色的结果
在8周时，观察到各组主动脉壁病变的可见差异。与对照组相比，HFD组和ML-7组都显示出显著的ORO染色斑块，尽管ML-7干预减少了斑块的数量和面积（图1B）。HE染色显示肥胖兔子的主动脉内皮有显著的结构损伤，主动脉内膜明显增厚，并伴有丰富的泡沫细胞、脂质沉积和中层平滑肌细胞紊乱。总体而言，这些病理变化在ML-7组中部分得到缓解（图1C）。

3.4 体内髂动脉超声显示ML-7未能改善肥胖兔子的内皮依赖性FMD
通过经皮超声评估外髂动脉的FMD来评估体内内皮功能。与对照组相比，HFD组和ML-7组的FMD显著降低（P = 0.029/0.006），证实了肥胖引起的体内内皮功能障碍。关键的是，ML-7组和HFD组之间的FMD没有显著差异（P = 0.486；图2），表明ML-7治疗未能改善活体动物的内皮依赖性扩张。

图2 通过流动介导的扩张（FMD）评估内皮功能。通过经皮超声测量左外髂动脉的FMD。内皮依赖性扩张率（%）= (DI—DO)/DO × 100，其中DO是基线直径（压力前），D1是压力后的直径。数据以均值±标准差（每组n=8）呈现。统计分析：单向方差分析，随后进行LSD事后检验。*P < 0.05 vs. 对照组。确切的P值：P = 0.029，HFD vs. 对照组；P = 0.006，ML-7组 vs. 对照组；P = 0.486，ML-7组 vs. HFD组。

3.5 ML-7改善HFD诱导的肥胖兔子的内皮依赖性松弛功能障碍
双向重复测量方差分析显示ACh浓度有显著的主效应[F(1.499, 25.477) = 101.45, p < 0.001，部分η2 = 0.856]和浓度×组的交互作用[F(2.997, 25.477) = 4.36, p = 0.013，部分η2 = 0.339]，表明组的效应在不同ACh浓度上有所不同。在每个浓度下的简单效应分析（图3A）显示，与对照组相比，HFD组在0.1、1和10 μmol/L ACh下的松弛显著降低（所有p < 0.05）。ML-7治疗在1和10 μmol/L ACh下显著改善了松弛（两个p < 0.05），但在其他浓度下没有效果（所有p > 0.05）。值得注意的是，ML-7的改善仅在两个最高的ACh浓度（1和10 μmol/L）下观察到，并且没有将松弛恢复到对照组水平，表明其效应是部分的且受浓度限制。

图3 在主动脉环中离体评估血管松弛功能。（A）对乙酰胆碱（ACh）累积浓度的内皮依赖性松弛。（B）对硝普钠（SNP）的内皮非依赖性松弛。数据以均值±标准差（每组n=7）呈现。统计分析：对于ACh，使用带有Greenhouse-Geisser校正的双向重复测量方差分析显示显著的组×浓度交互作用（p = 0.013）。在每个浓度下进行简单效应分析，随后进行Bonferroni事后校正。对于SNP（排除0.1 'Amon），双向重复测量方差分析未显示显著的组效应（p = 0.633）或交互作用（p = 0.648）。在0.1 μmol/L SNP时，Kruskal-Wallis检验的结果显示各组之间没有差异（p = 0.407）。* P < 0.05，vs. 对照组；/P < 0.05，ML-7组 vs. HFD组。

对于SNP诱导的松弛，双向重复测量方差分析显示显著的浓度效应[F(1.414, 24.036) = 290.37, p < 0.001，部分η2 = 0.945]，但没有显著的组效应或交互作用（两者p > 0.05）（图3B）。在0.1 μmol/L SNP时，Kruskal-Wallis检验的结果确认各组之间没有差异（p = 0.407）。这些结果表明，HFD诱导的肥胖兔子的松弛障碍是内皮依赖性的，而且ML-7部分改善了这种功能障碍，但不影响平滑肌对NO的响应。

3.6 PRAT与体重及其他指标的相关性分析
Spearman相关性分析显示PRAT与体重正相关（ρ = 0.807，P < 0.001），并与多个ACh浓度下的内皮依赖性松弛率负相关。在对45个测试应用Bonferroni校正后（调整后的显著性阈值P < 0.00111），PRAT在1 μmol/L（ρ = ?0.648，P = 0.001）和10 μmol/L（ρ = ?0.691，P = 0.001）的ACh浓度下仍与松弛率显著相关，而在0.1 μmol/L的ACh浓度下（ρ = ?0.591，P = 0.005）的相关性不再显著。TC、LDL-C和ox-LDL水平与体重和PRAT显著正相关（ρ范围为0.586–0.622，所有P < 0.001），这些相关性在校正后仍然显著。在任何SNP浓度下均未检测到代谢参数与松弛率之间的显著相关性（所有P > 0.05）。详细的相关系数和P值见表2。

表2 变量
松弛率
肾周脂肪
Ach 0.001
Ach 0.01
Ach 0.1
Ach 1
Ach 10
体重 ρ 1.000.807 ?0.076 ?0.207 ?0.343 ?0.282 ?0.290 P.0?0.745 0.368
0.128 0.216 0.203
肾周脂肪 ρ.807 1.000 ?0.349 ?.403 ?.591 ?.648 ?.691
P0.0.12 10.070 0.005 0.001?0.001?
Glu ρ 0.147 0.065 ?0.207 ?0.256 ?0.255 ?0.169 ?0.178
P0.438 0.735 0.395 0.289 0.293 0.490 0.465
TC ρ.606.586 ?0.001 ?0.036 ?0.269 ?.414 ?0.362 P0?0.001?0.997 0.887 0.280 0.088 0.140
TG ρ 0.181 0.253 0.080 0.039 ?0.018 ?0.164 ?0.212
P0.340 0.178 0.745 0.872 0.943 0.502 0.383
HDL-C ρ 0.181 0.253 0.080 0.039 ?0.018 ?0.164 ?0.212
P0.340 0.178 0.745 0.872 0.943 0.502 0.383
LDL-C ρ 0.602.586 ?0.035 ?0.068 ?0.261 ?0.409 ?0.377
P0?0.001?0.887 0.781 0.280 0.082 0.111
ox-LDL-C ρ 0.622.609 0.140 0.133 ?0.084 ?0.247 ?0.247
P0?0?0.567 0.586 0.732 0.307 0.307
VLDL ρ 0.011 0.031 ?0.298 ?0.319 ?0.362 ?0.422 ?0.401
P0.956 0.875 0.229 0.197 0.140 0.081 0.099
肾周脂肪与动脉松弛率的相关性分析。

PRAT，肾周脂肪组织；TC，总胆固醇；TG，甘油三酯；HDL-C，高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C，低密度脂蛋白胆固醇；VLDL，极低密度脂蛋白；ox-LDL-C，氧化低密度脂蛋白；Glu，空腹血糖。使用双变量相关分析来我们的研究发现表明，肥胖会引发兔子的血管结构和功能损伤，表现为动脉内皮损伤以及内皮依赖性的血管舒张能力下降。从机制上看，这种与肥胖相关的内皮损伤与多种因素的相互作用有关，包括血脂异常、氧化应激、内脏脂肪堆积以及MLCK通路的激活，从而导致MLC磷酸化水平的上升。然而，MLCK抑制作用在体内和体外评估中的治疗效果存在显著差异，具体将在下文中讨论。

低密度脂蛋白（LDL）及其氧化形式（ox-LDL）是已知的动脉粥样硬化的致病因素，其中LDL-C是LDL的经典生物标志物（26）。与这一观点一致，我们的研究表明肥胖兔子体内的LDL-C和ox-LDL水平显著升高。ox-LDL在内膜下空间的过度积聚以及随后被巨噬细胞的摄取会导致泡沫细胞的形成，从而加剧内皮损伤。与此同时，内皮损伤又促进了LDL向内膜下空间的传输，在那里LDL进一步被氧化为ox-LDL，形成了一个恶性循环。值得注意的是，我们模型中观察到的ox-LDL水平显著升高不仅反映了LDL的氧化增加，也暗示了全身性的氧化应激状态。多种酶促途径参与了这一过程，包括血管烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶、髓过氧化物酶活性、线粒体功能障碍以及eNOS的解偶联[如其他研究所述（27, 28）]，所有这些都会产生氧化LDL的活性氧物质。重要的是，高脂肪饮食（HFD）不仅会诱发高脂血症，还会加剧氧化应激和炎症，从而维持这一恶性循环（29），这与我们的发现相符。

本研究的一个显著发现是，尽管HFD喂养的兔子的内皮依赖性血管舒张能力明显受损，但主动脉中的eNOS蛋白表达和总NO含量并未发生变化。这表明，在我们的饮食诱导肥胖模型中，内皮功能障碍并非由eNOS含量减少或NO绝对缺乏引起的。相反，它可能是由于内皮向平滑肌的信号传递改变，或者是因为NO下游的平滑肌收缩力增强所致。这一解释得到了ML-7（一种平滑肌MLCK抑制剂）的部分恢复血管舒张能力的支持，而ML-7并未影响eNOS或NO的水平。因此，我们的数据表明，即使eNOS/NO通路完好无损，肥胖仍可导致内皮依赖性血管舒张能力的损伤，而针对平滑肌收缩力的干预可能为其部分功能恢复提供机制上的解释。

内脏脂肪和异位脂肪是肥胖患者不良心血管代谢结局的主要驱动因素，其中内脏脂肪与动脉功能密切相关（30）。普拉特脂肪（PRAT）作为内脏脂肪的主要成分，会分泌脂联素和促炎细胞因子，其厚度与内脏脂肪面积呈正相关（31, 32）。最新研究表明，PRAT在维持心血管和肾脏稳态中起着重要作用（23）。我们的实验发现表明，饮食诱导的肥胖兔子体内PRAT积聚显著增加。重要的是，PRAT与体重呈正相关，但在所有测试的乙酰胆碱（ACh）浓度（0.1、1和10 μmol/L；P<0.05）下均与主动脉舒张能力呈负相关。此外，血清脂质参数（包括总胆固醇TC、LDL-C和ox-LDL）也与体重和PRAT体积呈正相关。这些发现共同表明了脂肪堆积、血脂异常和血管功能障碍之间的致病性相互作用，尤其是PRAT积聚与内皮依赖性血管舒张能力损伤之间存在强烈关联。新兴证据表明，PRAT可能通过多种途径影响心血管功能，包括（1）神经反射调节、（2）脂联素分泌以及（3）脂肪-肾脏相互作用（31）。从机制上看，PRAT的扩张可能通过增加四氢生物蝶呤的氧化和随后的超氧化物过度产生来促进内皮损伤，最终降低NO的生物利用度（33）。然而，具体的致病机制仍需进一步阐明。

本研究显示，肥胖兔子的内皮损伤与MLCK过度表达、MLC磷酸化增加、血脂异常和肾周脂肪沉积有关，而ML-7干预可以改善内皮依赖性血管舒张能力。值得注意的是，与对照组或HFD处理的兔子相比，ML-7处理的兔子表现出ox-LDL水平的 paradoxical increase（P<0.001），同时伴随着NO含量的下降趋势，尽管这一趋势尚未达到统计学意义，这提示ML-7可能诱导了某种氧化应激反应，需要进一步研究。

一个出乎意料的发现是，尽管ML-7处理组在体外血管舒张能力有所改善，但循环中的ox-LDL水平却显著升高。这一矛盾现象的机制尚不清楚。我们没有直接测量血管中的活性氧生成、eNOS解偶联或抗氧化酶活性，因此任何涉及氧化应激的解释都仍然是推测性的。有可能ML-7对脂质代谢或LDL氧化具有非靶向效应，这些效应与其MLCK抑制作用无关。或者，ox-LDL的增加可能反映了清除或分布的变化，而非氧化作用的增强。未来的研究需要通过直接测量动脉中的活性氧（例如二氢乙锭染色）、eNOS二聚体/单体比例以及血浆抗氧化能力来澄清这一矛盾。

本研究的一个关键发现是体内和体外评估的内皮功能存在差异：尽管ML-7在离体主动脉环中部分改善了乙酰胆碱诱导的血管舒张能力，但在同一动物的髂动脉中却未能改善血流介导的血管扩张（FMD）（图2）。这种差异具有重要的意义。首先，作为一种非侵入性技术，FMD可能无法检测到内皮功能的细微、部分改善，尤其是在受系统神经激素影响的传导血管中。其次，FMD测量是在清醒且受到轻微约束的兔子中进行的，这种状态可能导致压力、焦虑和随后的交感神经激活，从而影响血管张力和内皮功能，掩盖了在受控体外条件下更容易检测到的轻微治疗效果。第三，动脉粥样硬化是一种全身性疾病，但不同血管床的斑块特征和功能改变可能差异很大（34）。ML-7的治疗效果在胸主动脉中可能比在外周髂动脉中更为明显。最后，ML-7组观察到的氧化应激标志物（如ox-LDL）的增加可能抵消了其对FMD的任何潜在益处，因为FMD在很大程度上依赖于急性NO的生物利用度。无论原因如何，FMD改善的缺失表明，在我们的实验条件下，ML-7的体外益处并未转化为体内传导血管内皮功能的改善。这一发现限制了MLCK抑制剂在肥胖相关血管功能障碍中的转化意义，至少在所测试的剂量和持续时间范围内是如此。

总之，本研究表明，HFD诱导的肥胖会损害兔子的内皮依赖性血管舒张能力，这与血脂异常、内脏脂肪堆积以及MLCK/p-MLC通路的激活有关。eNOS/NO通路保持不变。MLCK抑制剂ML-7在体外以浓度依赖的方式部分改善了乙酰胆碱诱导的血管舒张能力，这种效应可能是通过降低平滑肌收缩力实现的，而不是通过恢复NO的生物利用度。然而，这种效应并未转化为体内的FMD改善。此外，ML-7治疗还意外地增加了循环中的ox-LDL水平，其机制尚不清楚。这些发现表明，MLCK的激活是肥胖引起的血管功能障碍的一个相关因素，但其抑制作用在该模型中仅带来部分、有限的体外益处。MLCK抑制剂对于肥胖相关血管疾病的治疗潜力仍需进一步验证，未来的研究应直接评估血管中的活性氧、eNOS的耦合情况，并探索替代的剂量或给药策略以实现体内疗效。

**研究的局限性**：
1. 我们没有直接测量活性氧的产生或eNOS的耦合状态，因此将氧化应激作为ox-LDL水平升高的解释仍然是推测性的。
2. 没有进行正式的样本量计算；未来的研究应基于此处报告的效果大小来估算样本量。
3. 我们的研究是在饮食诱导的肥胖兔子模型中进行的，因此将其外推到人类病理生理学时应谨慎。
4. 尽管ML-7是一种选择性的MLCK抑制剂，但我们不能完全排除其他可能促成观察结果的非靶向效应。
5. 体内和体外发现（乙酰胆碱诱导的血管舒张与FMD）之间的差异表明，ML-7的部分益处并未转化为活体动物传导血管内皮的改善，这限制了体外结果的生理和转化意义。