由原核微生物介导的、发生在最深海洋沟槽中的磷循环与碳循环的耦合过程

《Frontiers in Marine Science》：A coupled phosphorus and carbon cycling mediated by prokaryotic microbes in the deepest trench

　　摘要

在海洋磷（P）循环中存在一个长期存在的悖论：尽管溶解的无机磷（DIP）含量丰富，深水区域的碱性磷酸酶活性（APA）仍然很高，而在碳限制的深渊区域，驱动这种模式的活性微生物调控机制却基本上尚未得到测试。在这里，我们通过对比尔切尔深海（马里亚纳海沟）全水柱中溶解有机磷（DOP）和DIP的分析，结合实验室中的高压模拟培养实验，来验证一个假设，即深海区域观察到的APA水平升高是由于微生物对碳的需求所驱动的。我们发现了两种不同的磷-碱性磷酸酶活性（P-APA）调控机制：在磷缺乏的表层水中，APA活性受到磷限制的驱动；而在磷充足但碳匮乏的深水区域，APA活性则持续升高。在整个水柱中都能检测到具有代谢活性的碱性磷酸酶（AP）产生菌株，尤其是SAR11支系。路径分析用于评估观测数据与假设的因果框架的一致性，该框架将活性微生物群落、APA动力学以及磷-碳（P-C）循环联系起来，该模型解释了水柱中溶解有机碳变异的82.3%和DIP变异的75.4%。我们提出并验证了一种“搭便车”策略，即深海微生物通过表达AP来从DOP中获取碳，这为长期存在的深海APA悖论提供了一个之前未曾测试过的潜在机制解释，同时也揭示了一种可能代表深海碳封存途径分支的微生物介导的P-C耦合路径。

1. 引言

磷（P）是生命必需的营养素，对于细胞膜结构、遗传物质、能量转运蛋白和代谢信号传导至关重要（Karl, 2000; Colman et al., 2005; Duhamel et al., 2021）。磷在海洋中主要以溶解无机磷（DIP）和溶解有机磷（DOP）的形式存在（Paytan and McLaughlin, 2007）。虽然DIP是生物可利用性最强的形式，可以直接被微生物吸收，但DOP构成了主要的磷储库（Dyhrman et al., 2007），必须通过细胞外的碱性磷酸酶（AP）分解才能释放出生物可利用的磷酸盐（Sebastián et al., 2004; Luo et al., 2009）。这种酶促水解是海洋磷循环中的关键步骤，因为大多数磷酸化化合物无法穿过细胞膜被微生物利用（Luo et al., 2009; Karl, 2014）。

然而，海洋磷生物地球化学中的一个长期悖论挑战了这一传统观点：尽管周围DIP浓度远高于抑制AP的阈值，但全球深海水域中的APA活性却普遍升高（Koike and Nagata, 1997; Hoppe and Ullrich, 1999; Thomson et al., 2019）。已经提出了不同的假设来解释这一现象。Koike和Nagata（1997）认为，深水区域APA的升高可能来源于从表面快速下沉的颗粒。同样，Hoppe和Ullrich（1999）提出，印度洋观察到的APA很大一部分是以溶解形式存在的（即无细胞的），并且是由碳限制的细菌产生的（Hoppe and Ullrich, 1999）。这一悖论部分得到了解释，因为发现无细胞AP构成了各种海洋环境总AP的主要部分，其半衰期从几天到几个月不等（Baltar, 2018; Thomson et al., 2019）。这种被动持续机制可以在APA产生后很长时间内保持其活性，从而将酶活性与现场营养物质状态（即DIP浓度）脱钩（Thomson et al., 2019）。然而，存在被动酶池并不排除深海微生物可能主动调控APA的可能性。迄今为止，还没有研究通过实验验证深海微生物是否在高压条件下主动表达AP以获取有机碳，也没有将这种潜在机制与深渊区域的现场生物地球化学模式定量联系起来。

深渊区域（6,000–11,000米）代表了地球上最深且探索最少的海洋区域，其特征是极端的静水压力、间歇性的有机物输入以及长期的碳限制（Glud et al., 2013; Nunoura et al., 2015; Liu et al., 2018; Luo et al., 2018; Glud et al., 2021）。因此，这一独特环境成为探究超越传统磷限制范式的活性微生物APA调控的理想自然实验室。在这里，我们提出并验证了一个新的“搭便车”假说：深海区域APA的升高是由微生物对碳的需求驱动的，而不仅仅是由磷的可用性驱动的。具体来说，我们认为碳匮乏的深海微生物表达AP以水解DOP，主要是为了获取DOP分子中的有机碳部分，而DIP作为副产品被释放出来。

为了验证这一假设，我们整合了对马里亚纳海沟挑战者深海全深度（50–10,918米）APA、磷形态和活性微生物群落组成的测量数据。为了从机制上验证高压条件下APA与碳获取之间的联系，我们进一步使用了耐压深渊分离株Shewanella sp. MTB7进行了高压培养实验。通过结合野外观察和实验室实验操作，我们旨在解决深水碱性磷酸酶悖论，阐明AP在深海营养循环中的生态作用，并揭示之前未被认识的古菌介导的磷和碳循环之间的耦合。

2. 材料与方法

2.1 样本收集

2019年，我们在马里亚纳海沟挑战者深海进行了一次考察，在MTD站（142°21.7806’E, 11°25.8493’N）通过CTD casts在50、1,000、2,000、3,000和4,200米深度收集了海水样本，并在7,000和10,918米深度使用着陆器收集了样本（每个Niskin瓶子在其目标深度被触发并密封后继续上升）。样品收集后立即在船上进行了微生物胞外酶活性分析，具体方法如下所述。

2.2 APA的测量

使用荧光底物4-甲基伞形花烃基磷酸酯（MUF-P；Sigma-Aldrich）通过多浓度方法来确定碱性磷酸酶活性（Hoppe, 1983; Hoppe and Ullrich, 1999）。根据多浓度方法，使用两组最终浓度（系列A：0、0.05、0.1、0.25、0.5、1、2.5和5 μM；系列B：0、1、4、10、30、80和200 μM）确定了最大速度Vmax和米氏常数Km。使用Infinite M200 Pro微孔板读数仪（Tecan, Switzerland）在365/460 nm的激发和发射波长下，在0、1、2、3、4、5和6小时测量荧光密度。使用一系列无菌海水中MUF的标准溶液进行了MUF量化的校准曲线。

收集的海水用于在常压和现场温度条件下测量总APA（Vmax-Total）。在每个深度的部分海水样本还使用3-μm聚碳酸酯膜（Millipore Co., United States）在常压下进行了过滤（Liu et al., 2018）。滤液，以下称为自由生活部分（Vmax-FL），包含真正的无细胞溶解酶和附着在自由生活原核细胞外膜上的酶（即颗粒大小< 3 μm）。附着在颗粒上的微生物群落的APA（Vmax-PAM）通过Vmax-Total和Vmax-FL之间的差值计算得出。因此，测量的总APA代表了外源酶（与附着在颗粒上和自由生活细胞相关的）以及从细胞释放到周围海水中的酶的总活性（Luo et al., 2009）。

2.3 磷分析

对于磷分析，每个深度的三份50毫升海水样本通过0.45 μm孔径的醋酸纤维素滤膜（Whatman）过滤，滤液在-20°C下保存，用于总溶解磷（TDP）和溶解无机磷（DIP）的分析。TDP浓度使用碱性过硫酸盐氧化法（Ran et al., 2010）测定。DIP浓度使用基于标准方法的营养自动分析仪（Seal Analytical, United Kingdom）测定。溶解有机磷通过从TDP中减去测量的DIP来计算。

2.4 溶解有机碳分析

对于溶解有机碳（DOC）分析，每个深度的三份海水样本通过预燃烧（450°C, 4小时）的Whatman GF/F玻璃纤维滤膜（0.7 μm名义孔径）在低真空（<100 mbar）下过滤。滤液保存在0.02%（w>2的预燃烧硼硅酸盐小瓶中，并在4°C下避光保存直至分析。DOC浓度使用配备非分散红外（NDIR）检测的Shimadzu TOC-L CPH分析仪通过高温催化氧化（HTCO）测定。使用钾氢邻苯二甲酸酯（KHP）标准品（0–20 mg C L-1, R2 > 0.999）进行校准。每九个样本分析一次深海水参考样本，以确保仪器的可靠性。

2.5 核酸提取和cDNA合成

根据制造商的协议，使用RNeasy PowSoil DNA Elution Kit（QIAGEN）和RNeasy PowerSoil Total RNA Kit（QIAGEN）从水样中提取总DNA和RNA。获得的总DNA和RNA颗粒分别溶解在100 μL无DNase的ddH2O和无菌ddH2O中。总DNA和RNA的浓度使用NANODROP 2000（Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA）测定，并在-80°C下保存直至进一步分析。

为了消除RNA样本中的残留基因组DNA污染，按照制造商的说明使用不含RNase的DNase I（TaKaRa, China）处理纯化的总RNA，并通过使用未逆转录RNA作为模板进行PCR验证基因组DNA污染的缺失。随后使用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa, China）将验证无DNA的RNA逆转录成互补DNA（cDNA），以便进行后续的16S rRNA测序，以表征代谢活跃的微生物群落。从RNA中得到的总DNA和cDNA分别用于后续的16S rRNA扩增子测序，以表征总微生物群落和代谢活跃的微生物群落。平行提取的总DNA被保存作为备用，以供进一步验证。

2.6 16S rRNA的PCR扩增

总DNA和总cDNA样本使用带条形码的引物515F（5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA-3′）和806R（5′-GGACTACNVGGGTWT CTAAT-3′）（Walters et al., 2016）进行扩增，目标是对16S rRNA基因的V4区域。25 μL PCR反应包含10 μL Premix TaqTM（Takara, China）、每种引物0.5 μL（10 μM）、10 ng模板（DNA或cDNA）和13 μL无DNase的ddH2O。PCR在thermocycler PCR系统（GeneAmp 9700, Applied Biosystems）上进行，程序如下：94°C预热3分钟；35个循环，每个循环94°C 45秒、50°C 60秒、72°C 90秒；72°C维持10分钟。每次运行都包含阴性和阳性对照。所有PCR扩增子在1%琼脂糖凝胶上可视化，并使用EZNA Cycle Pure Kit（Omega Bio-Tek, Inc., USA）纯化，然后使用Qubit 3.0荧光计（Invitrogen, Carlsbad, CA, USA）进行定量。

2.7 Illumina MiSeq测序和数据处理

扩增子样本在Illumina MiSeq平台（Illumina, United States）上以等摩尔浓度混合并测序，由Major Bio-Pharm Technology Co. Ltd.（上海，中国）完成。原始序列使用cutadapt处理（平均质量得分低于20的序列被过滤掉，引物序列也被切除）（Martin, 2011）。修剪后的序列被截短、去噪，并使用DADA2命令过滤掉嵌合体。然后使用QIIME2中的SILVA 138.1数据库通过classify-sklearn插件对16S rRNA序列的扩增子变异体（ASVs）进行分类（Bolyen et al., 2019）。最后，移除了线粒体和未分类的ASVs。总DNA和cDNA的扩增子文库分别在不同的运行中测序，但使用相同的处理流程。这些过程产生了25,131-256,703个样本的序列，这些序列在ASV表中被重新采样为最小数量（25,131个）。基于代谢活跃微生物群的稀疏ASV丰度表进行了主成分分析（PCA），第一个主成分得分（PCA1）解释了活跃微生物群落结构总变异的53.8%，作为后续路径分析的代理。

2.8 高压下碳驱动APA机制的实验验证

为了探究磷充足深水区域APA升高背后的潜在机制，我们使用了从马里亚纳海沟5,900米深度分离出的耐压细菌Shewanella sp. MTB7进行了实验室实验（Li et al., 2023）。选择这个菌株是因为它的生态相关性、耐压性和实验可行性，它代表了一个用于验证高压条件下提出的碳驱动APA机制的模型生物。该菌株在10°C的marine broth 2216E中以摇床（180 rpm）预培养，直到达到早期对数生长阶段（OD600 ≈ 0.3–0.4）。然后从600 mL培养物中通过离心（4,000 × g, 8分钟, 4°C）收集细胞。为了去除富营养介质中的残留营养物质（主要是有机碳），细胞颗粒用无菌人工海水（ASW）洗涤了三次。ASW的配制方法如前所述（Zhang等人，2024年），并且在制备过程中不含任何有机碳源，以确保碳耗尽的基线条件。其中含有200 μM的K2HPO4，以在整个实验过程中维持充足的磷浓度。ASW的pH值调整为7.6，这处于APA的最佳范围内，并且接近挑战者深渊深海水的pH值。

洗涤后的细胞颗粒重新悬浮在新鲜ASW中，并分为四种实验处理组：一种是碳耗尽的对照组（–C）；另一种是添加了5 mM N-乙酰葡萄糖胺的碳充足对照组（+C）；一种是补充了200 μM葡萄糖-6-磷酸的碳耗尽介质（–C+G6P）；最后一种是同时含有5 mM N-乙酰葡萄糖胺和200 μM G6P的碳充足介质（+C + G6P）。每种处理组的细胞悬浮液都分三份（每份150 mL）装入无菌、可热封的培养袋（SEALPAK 502，Kapak，PROAMPAC公司，美国）。热封后，将袋子放入不锈钢高压容器（Feiyu，南通，中国）中。通过手动向容器内泵入无菌水，分别施加0.1、20、30、40和50 MPa的静水压力，以模拟现场的高压条件。然后将高压容器置于温度可控的水浴中（10°C）孵化5天，因为10°C是耐压细菌Shewanella sp. MTB7的最佳生长温度（Li等人，2023年）。

每天从每个重复组中采集样本。对于碱性磷酸酶活性（APA）的测定，取20 mL样本进行离心（12,000 × g，10分钟，4°C）。上清液通过0.22 μm的PES膜（Millipore公司，美国）过滤，然后按照第2.2节描述的协议立即用于酶分析。对于基因表达分析，将得到的细胞颗粒保存在1 mL的TRIzol?试剂（Invitrogen）中，迅速冷冻在液氮中，并存放在-80°C直到RNA提取。

根据制造商的说明从TRIzol保存的细胞颗粒中提取总RNA。提取的RNA用DNase I（TaKaRa公司，日本）处理以去除基因组DNA的污染，随后使用PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa公司，日本）逆转录成cDNA。使用Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR系统，通过定量实时PCR（qPCR）测定碱性磷酸酶基因phoA的表达。该qPCR测定的引物列在补充表1中。热循环程序包括最初的95°C变性30秒，接着是40个循环：95°C 10秒、58°C 30秒和72°C 30秒。相对基因表达水平使用2^-ΔΔCT方法计算（Livak和Schmittgen，2001年）。

2.9 路径分析
使用R lavaan v0.6–21包进行了路径分析，以验证我们假设的微生物介导的磷-碳耦合机制（Rosseel，2012年）。模型以16S rRNA衍生的活性微生物群落的第一主成分PCA1作为外来预测因子，APA、Vmax和Km作为中介变量，DIP和DOC作为响应变量。所有变量在拟合前都进行了标准化。参数通过最大似然法估计，进行5000次自助复制以计算稳健的标准误差和路径显著性。模型拟合通过卡方检验进行评估，方差解释通过R2量化。

2.10 统计分析
数据以平均值±标准差的形式呈现。使用IBM SPSS Statistics 26软件包进行了皮尔逊相关性分析。不符合正态性标准的数据（由Kolmogorov-Smirnov检验确定）在进一步分析前进行了平方根变换。在无法进行变换的情况下，使用斯皮尔曼等级相关系数。使用GraphPad Prism 7进行了单因素方差分析（ANOVA）或学生t检验，以分析处理组之间的显著差异（p < 0.05）。

3 结果与讨论
3.1 挑战者深渊的水文和营养条件
在挑战者深渊（CD）的不同深度（从50米到10,918米）采集了海水样本（表1）。我们的结果显示，表层水（50米）中的DIP浓度相对较低（0.11 μM）（图1）。这一浓度与太平洋副热带环流（Duhamel等人，2011年）、ALOHA站点（Colman等人，2005年）和阿拉伯海（Hoppe，1983年）的表层水报告的浓度相当，但高于北大西洋环流中部和东部的浓度（Zubkov等人，2007年）。然而，在深层水（1,000–10,918米）中，DIP浓度显著较高，范围在2.22至2.91 μM之间（平均2.49 ± 0.25 μM）。这些结果与早期关于马里亚纳海沟的研究报告的结果相似（Nunoura等人，2015年）。

表1
深度（米） DOC（μM） DIP（μM） DOP（μM） C/Pratio Vmax-Totala（nM h-1） Vmax-FLb（nM h-1） Vmax-PAMc（nM h-1） Vmax-FL Km-Totald（μM） Km-FLe（μM）
50 56.6 7 0.11 0.09 63 0.23 75 16.17 8.11 68.12 21.65 14 4.05
1,000 35.00 2.22 0.46 76 18.03 9.72 5.92 53.98 0.51 65.06
2,000 37.50 2.91 0.10 37 518.29 9.98 5.76 54.67 5.88 60.11
3,000 33.33 2.70 0.38 88 17.35 10.21 7.14 58.97 6.03 40.16 4,200 35.83 2.63 0.16
22 416.66 10.90 8.30 65.47 8.57 48.16
7,000 35.00 2.41 0.07 500 16.15 10.23 8.31 63.35 8.76 37.04 10,918 35.83 2.40 0.08
44 815.41 7.30 7.58 47.46 0.29
49.43

a,b,c 分别表示CD水样中总碱性磷酸酶活性、颗粒相关活性和自由生活活性。
d,e 分别表示总碱性磷酸酶活性半饱和常数和自由生活活性。

图1
测量了挑战者深渊和马里亚纳海沟水样中的溶解有机物（DOP，μM）和无机磷（DIP，μM）以及碱性磷酸酶活性（Vmax-Total，nM h-1）的浓度。

与DIP的分布不同，DOP在CD水柱中显示出分层分布模式，不同采样深度之间的浓度高低交错（图1）。DOP浓度从66 nM变化到463 nM（平均191.2 ± 161.9 nM），并且连续深度之间的差异高达一个数量级。此外，DOP浓度比DIP低1-2个数量级，这种模式与非海沟水域常见的情况相反（Bj?rkman和Karl，2003年）。值得注意的是，在表层水中，DOP平均占总溶解磷（TDP）的46.0%，而在深层水中仅占12.9%（补充表2），远低于太平洋和大西洋非海沟水域报告的55-92%（Duhamel等人，2011年；Suzumura等人，2012年）。具体来说，在北太平洋副热带环流和南太平洋副热带环流中，DOP占TDP的55-74%（Duhamel等人，2011年），而在西北太平洋，这一比例在62%到92%之间（Suzumura等人，2012年）。此外，DOP池的周转时间在表层水中为13.0个月，在深层水中为5.1至6.6个月（补充表2），这比太平洋报告的DOP周转时间（0.4-84.4天）（Suzumura等人，2012年；Duhamel等人，2017年；Bj?rkman等人，2018年）要长，也比南大西洋副热带环流的DOP周转时间（3.7-17.3年）（Mather等人，2008年）短。

3.2 深层富磷水中异常高的碱性磷酸酶活性
我们使用荧光底物4-甲基伞形花酯磷酸测量了碱性磷酸酶的潜在活性，将之前的研究扩展到了整个海洋深度（Liu等人，2018年）。最显著的观察是表层水和深层水之间DIP和潜在APA（Vmax-Total）的对比模式。CD表层水的潜在APA最高，而测量的DIP和DOP浓度最低（图1；表1）。相反，CD深层水中的DIP浓度较高，同时潜在APA的水平也较高。因此，我们的结果显示CD水柱中存在两种不同的磷-碱性磷酸酶活性（P-APA）机制：一种是在表层水中，DIP低而APA高；另一种是在深层水中，DIP高且对于富含DIP的深层水来说APA也相对较高（图1）。整个水柱的平均Vmax-Total为17.9 ± 2.8 nM h-1，这比太平洋中部非海沟水域报告的值高1-2个数量级（Koike和Nagata，1997年）。与其他使用类似方法测得的海洋区域的Km值范围（例如，地中海西北部和北大西洋中部的0.05至2.4 μM）（Tamburini等人，2002年；Baltar等人，2010年；Baltar等人，2010年）相比，我们的值显著较高。这表明CD中的碱性磷酸酶群落具有较低的底物亲和力，这可能反映了微生物对不同磷动态的适应。

当使用0-5 μM的初始底物浓度时，APA几乎呈线性增加（数据未显示），表明测试的底物浓度远低于酶的Km值。因此，随后使用0-200 μM的较高底物浓度测量了APA。本研究中高Km值可能是由于CD水中存在的有机物具有抗性。特别是，CD水倾向于积累结构复杂且化学稳定的DOP化合物，包括磷酸化的腐殖质和难降解的脂质（Duhamel等人，2011年；Zheng等人，2024年；Han等人，2025年）。这些难降解化合物在垂直传输过程中选择性降解易降解有机物后仍然存在（Benner和Amon，2015年；Li等人，2019年）。这些难降解的DOP分子由于空间位阻作用，使得磷酸基团无法与AP的活性位点结合，从而降低了结合亲和力（Hedstrom，2010年）。因此，CD水中的AP可能进化出了改进的活性位点动态，导致底物结合不那么紧密，从而导致更高的Km值（Feller，2010年）。此外，食细菌者（如纤毛虫和鞭毛虫）将细胞内的酶释放到周围环境中，也可能进一步导致观察到的高Km值（Karner等人，1994年；Bochdansky等人，1995年；Davey等人，2001年）。总体而言，这些因素表明CD微生物群落适应了依赖表层水有机物质脉冲供应的生活方式，并能够快速响应或适应营养变化。

3.3 碳饥饿的化学证据
碱性磷酸酶可以释放结合在DOP中的磷，是一大类底物特异性较低的磷单酯酶（Colman等人，2005年）。在DIP浓度较低的环境中，DIP耗尽或底物受限的微生物群落可以诱导APA的产生（Hoppe，2003年；Mather等人，2008年）。因此，APA常被用作水生环境中磷限制的指标。在CD深层水中检测到相对较高的DIP浓度（图1）表明相关的微生物群落并未受到磷的限制。然而，与非海沟深层水（例如，北大西洋中部（Koike和Nagata，1997年）和北大西洋中部（Baltar等人，2010年）不同，CD深层水同时保持了较高的DIP浓度和较高的APA水平。测得的APA比其他海洋（如大西洋（Baltar等人，2009年；Baltar等人，2010年）、地中海（Tamburini等人，2002年）和第勒尼安海（Tamburini等人，2009年）中的APA水平高2-30倍。

CD深层水中高DIP浓度与高APA水平的并存与普遍观点相反，即高DIP浓度会抑制微生物的AP合成（Van Wambeke等人，2002年；Hoppe，2003年；Dyhrman等人，2007年；Thomson等人，2019年）。我们进一步分析了水柱的营养化学成分，发现CD微生物周期性地处于碳饥饿状态。这一点通过水柱中深度交替的C/P比率得到证实（表1）。表层水的C/P比为630:1，远高于典型的Redfield比率，而深层水则表现出交替的低和高C/P比率，分别低于和高于Redfield比率（表1）。值得注意的是，三种APA组分（总活性 [Vmax-FL]、自由生活组分 [Vmax-PAM] 和颗粒附着微生物 [Vmax-PAM]）显示了一致的深度相关模式（表1）。Vmax-FL和Vmax-PAM都对总APA有显著贡献（Vmax-FL：48-68%；Vmax-PAM：32-53%），并且在磷限制的表层水和磷充足但碳饥饿的深层水中，这三种组分的水平都升高了。虽然颗粒附着微生物（Vmax-PAM）可能与颗粒有机物的降解更紧密相关（Luo等人，2018年），自由生活微生物（Vmax-FL）有助于持续存在的溶解酶池（Thomson等人，2019年），但它们在碳饥饿下的共同升高表明了统一的群落策略。我们假设表层水中的微生物在磷耗尽时产生APA，而深层水中的微生物则以适应碳限制的方式作出响应，这暗示了海沟水中磷循环和碳循环之间的紧密联系。我们进一步推测，深层水中的微生物可能通过表达高水平的APA来释放有机碳（OC），从而同时导致深层水中DIP的高丰度（Benitez-Nelson和Buesseler，1999年；Steenbergh等人，2011年）。事实上，在Challenger Deep水柱中，由DOP分解产生的再生DIP（表层水，92%；深层水，平均65%）的比例远高于全球平均水平（36%；参见补充表2）（Duteil等人，2012年）。深层水中微生物表达的增强型AP活性代表了一种策略，用于微生物释放和消耗来自DOP的有机部分，无论环境中的磷含量如何（Hoppe，2003年；Luo等人，2011年）。我们将表层水和深层水中APA、DIP和DOP的不同模式解释为微生物生态位划分以及对Challenger Deep水柱中两种不同磷-APA环境的适应。这一论点也得到了DOP原位水解速率（VDOP）计算结果的支持（Duhamel等人，2011年），该结果显示VDOP与DOP之间存在强烈的线性关系（R2 = 0.983；p < 0.003，数据未显示）。综合这些结果表明，Challenger Deep深层水中的微生物APA反应是针对碳饥饿和对有机碳（OC）的获取，而不是磷的耗尽。看来，可被APA水解的DOP输入到深层海沟水体中是以脉冲模式进行的，其动态通过DOP、C/P比率和VDOP的高低交替模式得到了很好的说明（表1，补充表2）。此外，测得的Km值比环境中的DOP浓度高出2-3个数量级，表明碱性磷酸酶系统在底物限制和非饱和条件下运行。这意味着Challenger Deep中的微生物能够快速响应可水解DOP的间歇性输入，这与观察到的DOP浓度和C/P比率的脉冲模式一致。因此，从表层水到深层水的DOP间歇性脉冲输入为DIP和DOC的再生提供了磷和碳的供应机制。因此，深层海沟水体表现出高水平的APA和累积的DIP，从而导致C/P比率和DOC浓度的交替变化。我们的结果进一步表明，在生态学解释中使用APA作为磷压力或限制的指标时必须谨慎（Koike和Nagata，1997年；Hoppe和Ullrich，1999年；Duhamel等人，2011年）。高APA值并不一定反映微生物群落的磷限制或压力（Colman等人，2005年）。

为了进一步验证我们的假设并研究高压下的这种潜在机制，我们使用了耐压细菌Shewanella sp. MTB7进行了高压生长实验。当在富含磷的培养基（200 μM DIP）中受到碳饥饿（-C）时，MTB7在所有测试的压力条件下（0.1–50 MPa）显示出的APA显著增加（图2）。鉴于磷不是限制因素，这种APA诱导不太可能是对磷限制的反应（Duhamel等人，2011年；Karl，2014年；Duhamel等人，2021年）。虽然这一结果与碳驱动的APA策略一致，但还需要考虑另一种解释：在严重碳饥饿的情况下，细胞裂解可能导致细胞内磷酸酶的被动释放，这种现象在大气压条件下已有记录（Baltar等人，2019年）。鉴于经典研究表明，在磷充足条件下，碱性磷酸酶基因（例如phoX）不会仅由碳饥饿诱导（Sebastian和Amerman，2009年），这种解释更加合理。综合来看，-C组观察到的高APA可能代表了一种积极的碳获取生理策略，或是微生物碳饥饿的结果。

然而，我们的实验使用有机磷底物葡萄糖-6-磷酸（G6P）提供了明确的证据，证明了一种调控的碳搜寻策略。向碳饥饿的培养物（-C + G6P）中添加G6P触发了显著且持续的APA诱导，在所有压力条件下的所有时间点都显著高于添加了G6P的碳充足对照组（+C + G6P）（图2）。由于两组中的无机磷都丰富且相同，仅在碳饥饿培养物中观察到的APA特异性上调表明MTB7水解G6P是为了其碳部分，而不是为了磷。这一发现通过基因表达分析得到了进一步证实，该分析显示在-C + G6P处理中碱性磷酸酶基因phoA显著上调（图3）。这与海洋碱性磷酸酶的多功能作用的认识一致，其中像PhoA这样的酶被Alteromonas等关键类群广泛表达，其调节可能受到磷限制之外的因素的影响，包括碳饥饿（Saavedra等人，2025年）。这一分子证据证实了观察到的APA是活性转录调控的直接结果，而不是细胞裂解的产物，从而验证了我们的核心假设。

从生理学角度来看，整体代谢活性（由绝对APA值反映）在最佳生长压力0.1 MPa时最高，并随着静水压力的增加而下降（图2）。最重要的是，APA通过碳饥饿和有机磷可用性的协同效应特异性诱导的关键调控模式即使在50 MPa下也得到了保持（图2E）。这表明碳饥饿和APA介导的有机磷水解之间的机制联系可能是MTB7的一种基本的、具有压力抵抗力的生理特征，揭示了微生物在深海环境中的潜在生态作用。我们在Challenger Deep富含磷的深层水中观察到的持续高水平APA与所谓的“深层碱性磷酸酶悖论”现象一致——尽管环境中的磷酸浓度很高，但APA活性仍然普遍存在（Koike和Nagata，1997年；Hoppe和Ullrich，1999年；Thomson等人，2019年）。这一悖论传统上被认为是由于无细胞酶的持续存在，这些酶在释放后很长时间内仍然活跃，并且可以在空间和时间上与原位营养状态解耦（Baltar，2018年；Thomson等人，2019年）。实际上，Thomson等人（2019年）证明，在多样化的海洋环境中，无细胞AP酶构成了总AP酶的主要部分，其半衰期从几天到几个月不等（Thomson等人，2019年），这为即使在高DIP条件下DOP的持续水解提供了合理的解释。然而，Dykens等人（2025年）估计，在东北太平洋深层水域，无细胞APA对再生的Pi贡献不到10%（Dykens等人，2025年）。通过对Shewanella sp. MTB7进行的高压培养实验，我们提供了直接证据，表明APA和相应的phoA基因表达上调是由有机磷底物（例如G6P）在碳饥饿存在的情况下特异性触发的，与DIP的可用性无关。这表明深层水域中的高APA不仅可能是过去生理状态的遗迹，更重要的是，代表了微生物获取有机碳的积极策略，从而在深海环境中将磷和碳的获取联系起来。我们进一步提出，微生物对DOP的分解以获取碳可能代表了深海碳封存的断裂，这对碳循环和气候变化具有深远的影响。Dykens等人（2025年）的最新工作强调了重新悬浮的沉积物和下沉颗粒作为深层水域中无细胞AP酶载体的潜在作用，有助于“活死”酶池的形成（Dykens等人，2025年）。虽然这些物理过程确实可能增加水柱中的总APA，但我们的群落数据和实验验证表明，观察到的APA中有相当一部分是代谢活跃的，并由碳限制驱动。这一点还得到了已知产生APA的类群（如SAR11和Gammaproteobacteria）在深层水域中的普遍存在的支持（详见第3.5节），表明AP的碳搜寻功能在深海原核生物中可能比以前认为的更为普遍。通过碱性磷酸酶水解有机磷可以是深海细菌缓解碳饥饿的针对性生理策略。这种功能在高压下得以维持，证实了在Challenger Deep深层水中观察到的高APA是对碳缺乏的生理和代谢调节反应。据我们所知，这是第一个提供直接实验证据的研究，显示了在深海高压条件下碱性磷酸酶在直接从有机磷酸盐中获取碳中的作用。我们还注意到，我们的培养实验是在有氧条件下进行的，并且pH值固定为7.6，而深层水柱和沉积物-水界面表现出变化的氧化还原状态和微妙的pH梯度。氧化还原条件和pH对APA表达和酶稳定性的潜在影响没有系统地进行检查，这是本研究的局限性。未来的研究应该在更严格的地球化学条件下检验APA的调节，包括亚氧化和缺氧处理。

为了验证我们提出的由碳驱动的APA“搭便车”策略是否是深层原核生物中的普遍适应特征，而不仅仅是Shewanella sp. MTB7的菌株特异性特征，我们将活跃的微生物群落结构与我们的机制假设联系起来，并通过路径分析模型进行了进一步的定量验证（图4，表2）。我们的基于16S rRNA的群落分析显示，已知产生AP的谱系具有利用溶解有机磷（DOP）的代谢能力，包括SAR11支系和蓝细菌（主要是Prochlorococcus），在表层水中代谢活跃，并在整个水柱中可检测到，包括深层深度（6,000–10,918米）（图5）。这些类群构成了活跃微生物群落的核心组成部分（在我们的路径分析中由PCA1表示），我们证明了它们是水柱中APA动力学参数的主要上游调节因子。

图4显示了假设的因果关系路径分析模型，涉及Challenger Deep水样中的活跃微生物群落、Vmax、Km、DIP和DOC。箭头厚度表示标准化路径系数（β）的大小。实线和虚线分别表示正负β值。R2值表示每个变量在模型中解释的方差比例。路径系数代表标准化的统计关联；详见第3.6节的解释。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001。

表2预测因子与结果的关系：标准化系数（β）和显著性p值。PCA1对Vmax的效应为-0.35（SE=0.15，p<0.05）；PCA1对Km的效应为0.63（SE=0.23，p<0.01）；Vmax对DIP的效应为-0.43（SE=0.14，p<0.00）；Km对DIP的效应为-0.74（SE=0.17，p<0.00）；Vmax对DOC的效应为0.44（SE=0.13，p<0.00）；Km对DOC的效应为0.78（SE=0.15，p<0.00）；Vmax对Km的效应为0.35（SE=0.17，p<0.01）。PCA1对DIP的效应为-0.80（SE=0.04，p<0.00）。路径分析结果显示Challenger Deep中微生物介导的P-C耦合。

PCA1 = 活跃微生物群落的第一个主成分得分；β = 标准化路径系数；SE = 自举法的标准误差（n = 5000）；ns = 不显著；*p < 0.05，**p < 0.01，**p < 0.001。路径模型对观测数据的拟合度非常好（χ2 = 1.14，df = 2，p = 0.57）。该模型分别解释了Vmax、Km、DIP和DOC方差的12.2%、39.1%、75.4%和82.3%。

图5基于16S rRNA扩增子测序（不含“_a”的样本和含有“_a”的样本），显示了Challenger Deep马里亚纳海沟全水柱（50–10918米）中颗粒附着（PA）和自由生活（FL）细菌群的组成。主要分类群的相对丰度在不同层次上有所显示：(A) 门，(B) 纲，(C) 目，以及 (D) 属。后缀“_a”表示具有代谢活性的微生物群落。SAR11支系是全球海洋中最为优势的化能异养菌系（Morris等人，2002年；Sowell等人，2009年），在表层水中占据了活跃细菌扩增子序列变异体（ASVs）的12%；在7000米和10918米的海深渊深度，它仍然保持代谢活性（占活跃ASVs的6-5%）（图5C）。SAR11支系的成员具有通过AP表达利用DOP的能力，并且其细胞对磷的需求极低（Zubkov等人，2007年；Sowell等人，2009年；Sebastián等人，2012年）。结合我们路径分析中发现的活性微生物群落对米氏常数Km的显著正面调控效应（β = 0.63，p < 0.01）（表2），这些数据表明，深海SAR11种群可能主要通过水解DOP来获取有机碳，而不是为了获取可利用的磷酸盐，因为海深渊水体中的DIP浓度始终较高。这与我们的“搭便车”假说直接吻合。

值得注意的是，我们在整个水柱中检测到了具有代谢活性的蓝细菌种群（图5A），其中Prochlorococcus在表层水中占活跃细菌ASVs的24%，在7000米和10918米深度分别仍可被检测到（占活跃ASVs的17%和2%）（图5D）。虽然Prochlorococcus通常局限于光合作用带，但其在深海中的存在与先前的研究结果一致（Tarn等人，2016年；Guo等人，2018年），这很可能反映了来自表层的细胞向下传输而非原位生长。许多蓝细菌菌系是混合营养型的，可以通过AP生产来矿化DOP（Moore，2013年；Sisma-Ventura和Rahav，2019年），并且先前的研究表明Prochlorococcus是寡营养海水中磷吸收的主要贡献者（Zubkov等人，2007年；Tiwari等人，2015年）。尽管在深海深度检测到的Prochlorococcus序列可能来源于下沉的细胞，但路径分析揭示的APA动力学参数对DOC积累的强烈直接贡献（Km：β = 0.78，p < 0.001；Vmax：β = 0.44，p < 0.01）表明，与这些来自表层的蓝细菌相关的AP酶，以及由当地深海原核生物产生的AP酶，可能共同参与了周围APA池的构成。

尽管这些群落数据强烈表明在优势菌系中存在广泛的碳驱动AP调控潜力，但在原位压力下直接验证这一机制需要一个可培养且耐压的模型生物。我们选择了Shewanella sp. MTB7作为研究对象，因为它属于在现场发现的最丰富的菌系之一。环境测序确定其分类地位为假单胞菌门（变形菌门）、γ-变形菌纲、Alteromonadales目（图5A–C）。作为这些群体的成员，Shewanella sp. MTB7是从马里亚纳海沟5900米深处分离出来的（Li等人，2023年），因此能够准确反映该地区的常见群落结构。使用它使我们能够研究一个广泛存在且具有代谢重要性的深海菌类（γ-变形菌纲），尽管Shewanella属本身并不是数量最多的（图5D）。选择MTB7是因为它与研究地点的生态相关性以及它在高静水压力（高达50 MPa）下的实验可行性，而目前无法培养的SAR11和蓝细菌并不具备这些特性。因此，MTB7所展示的生理反应可以被视为当地原核生物为应对深海碳饥饿而采用的更广泛适应策略的代表性例子。

3.6 对深海碳和磷循环的影响

为了验证我们的核心假设，即深海微生物通过“搭便车”策略表达AP来获取有机碳，并解决关于活性微生物调控是否有助于长期存在的深海碱性磷酸酶悖论的关键知识空白（Koike和Nagata，1997年；Hoppe和Ullrich，1999年；Thomson等人，2019年），我们构建了一个路径分析模型来阐明活性微生物群落、AP动力学参数以及Challenger Deep水柱中耦合的磷-碳循环之间的因果关系（图4，表2）。该模型与我们的全深度观测数据非常吻合（χ2 = 1.14，df = 2，p = 0.57），分析使用了R lavaan软件包（Rosseel，2012年）进行，并进行了5000次自助法重复实验以确保参数估计的稳健性。具有代谢活性的微生物群落（由PCA1表示）对AP动力学特性具有显著的直接调控作用：它正向调控米氏常数Km（β = 0.63，p < 0.01），负向调控最大反应速度Vmax（β = -0.35，p < 0.05）（表2）。这一结果提供了首个原位定量证据，表明深海富含磷的水体中AP的增加并非仅仅来自无细胞的酶的被动持续存在（Thomson等人，2019年），而是由具有代谢活性的AP产生菌系主动调控的，尤其是普遍存在于海深渊水柱中的SAR11支系。

Km和Vmax都对水柱中DOC的积累有直接且显著的正面贡献（Km：β = 0.78，p < 0.001；Vmax：β = 0.44，p < 0.01），同时对DIP浓度有显著的负面影响（Km：β = -0.74，p < 0.001；Vmax：β = -0.43，p < 0.01）（表2）。该模型解释了水柱中DOC 82.3%的变异性和DIP 75.4%的变异性，为我们的“搭便车”策略提供了定量支持：深海微生物表达AP主要是为了水解DOP以获取有机碳片段，而DIP作为这一过程的副产品在水柱中积累。DIP和DOC之间的显著负相关性（β = -0.80，p < 0.001）进一步证实了这一机制框架，这些原位发现与我们的高压培养结果一致，后者显示在碳饥饿的Shewanella sp. MTB7中AP得到特异性诱导和phoA上调。需要指出的是，该模型中的路径系数代表拟合结构方程模型中变量之间的标准化统计关联。该模型与假设的耦合机制一致，尽管它本身并不能建立直接的生化因果关系。来自野外观察、高压培养实验和群落组成数据的证据共同支持了所提出的“搭便车”策略。这些发现重新定义了AP在海洋中的生态作用，揭示了一种由原核生物介导的磷-碳耦合机制，使微生物能够从DOP中获取有机碳。虽然这些结果基于Challenger Deep的一个全深度剖面，但它们为研究其他深海环境中的碳驱动AP动态提供了可测试的框架，对理解深海沟壑在海洋生物地球化学循环中的作用具有潜在意义。

我们认识到，当前研究为所提出的碳驱动AP机制提供了间接但一致的证据。此外，我们也认识到这一策略面临一个固有的生态挑战。由于碱性磷酸酶在细胞外发挥作用，DOP的水解会将有机碳片段释放到周围的海水中，这些片段可能会通过扩散作用丢失。在深海区域寒冷、高压且底物有限的环境中，微生物捕获这些释放的碳片段的效率仍然是一个未解之谜。可能缓解扩散损失的机制包括将AP活性限制在细胞表面或周质空间内、存在高亲和力的吸收系统，或者形成能够保留水解产物的细胞聚集体。直接证明碳从DOP中的同化（例如，使用13C标记的底物）以及定量评估这条途径对深海环境中微生物碳需求的贡献，仍然是未来工作的重要目标。这样的研究对于全面评估此处描述的耦合磷-碳循环机制的生态重要性是必要的。